王衛(wèi)東,艾麗絲,詹 艷,王雪晴,孫 慧,龔永生,金艷霞*

(1.湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室特色野菜良種繁育與綜合利用湖北省工程技術(shù)研究中心生物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,中國(guó)湖北 黃石 435002;2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)湖北 武漢 430072;3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院,中國(guó)江蘇 蘇州 215008)

肺癌是較常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤,發(fā)病率增長(zhǎng)迅速,因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、預(yù)防難、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),患者存活率很低。肺癌分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC占85%;根據(jù)組織亞型,NSCLC又分為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)、大細(xì)胞癌 3 種類型[1～2]。LUAD 占肺癌病例的40%,來(lái)自于小的氣道上皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞,具有侵襲性和快速致命性,總生存率低于5年,通常診斷為晚期時(shí)已擴(kuò)散轉(zhuǎn)移;LUSC占肺癌病例的25%～30%,起源于肺中央支氣管上皮細(xì)胞中的早期鱗狀細(xì)胞;大細(xì)胞癌占肺癌病例的5%～15%[3]。雖然低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(lowdose computed tomography,LDCT)用于肺癌篩查降低了肺癌患者死亡率,但晚期肺癌患者5年存活率仍不到15%[4]。研究表明,早期診斷可顯著提高肺癌患者5年存活率,腫瘤大小為21 mm的IA期肺癌患者術(shù)后5年生存率達(dá)92%[5]。但肺癌患者在早期階段無(wú)明顯癥狀,因而易漏診,發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已為晚期,且其經(jīng)治療后易復(fù)發(fā),預(yù)后差。臨床上肺癌的治療藥物有順鉑及其衍生物、單抗藥物(如阿特珠單抗)、靶向藥物(如吉非替尼)等[6],但都有一定的副作用或低特異性,存在局限性。因此,肺癌的早診和治療仍是臨床迫切需要解決的重難點(diǎn)問(wèn)題,早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)和早治療可有效降低死亡風(fēng)險(xiǎn)和改善預(yù)后。

前期研究中,我們運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到α-1-酸性糖蛋白1(alpha-1-acid glycoprotein 1,AGP1)在早期NSCLC血清中表達(dá)下調(diào),且能有效區(qū)分早期NSCLC和健康受試者,有望作為早診NSCLC的腫瘤標(biāo)志物[7];將早期NSCLC患者外周血中的白細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選到下調(diào)的AGP1蛋白,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)早期NSCLC中AGP1表達(dá)下降受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的調(diào)控,且 AGP 與 TGF-β 聯(lián)合診斷早期NSCLC的效果很好,曲線下面積(area under the curve,AUC)達(dá)到 0.985[8]。

AGP1又稱血清類黏蛋白1(orosomucoid 1,ORM1),是orosomucoid家族成員之一,該家族包括 ORM1(AGP1)和 ORM2(AGP2)[9]。AGP1 主要由肝臟合成并分泌到血液中,血液中的中性粒細(xì)胞也能分泌。AGP1含有201個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量為23.51 kD,其含有的多個(gè)糖鏈占總相對(duì)分子質(zhì)量的45%[10],故在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)中AGP1蛋白的條帶大小約為44 kD。據(jù)報(bào)道,血清中AGP1有12～20種不同的糖型[11]。UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,AGP1含有5個(gè)N-連接的GlcNAc 修飾位點(diǎn),即 33、56、72、93 和 103 位點(diǎn)(https://www.uniprot.org/uniprot/P02763;2020-05-07)。AGP1是絲氨酸蛋白酶抑制劑,也是急性時(shí)相蛋白,是炎癥生物標(biāo)記物之一,在炎癥或感染中AGP1血清濃度增加[12～13],AGP1與其他指標(biāo)聯(lián)合可用于區(qū)分活動(dòng)肺結(jié)核和潛伏肺結(jié)核感染[14]。Sumanth等[11]報(bào)道,血清中肝臟來(lái)源的AGP1(sAGP1)和中性粒細(xì)胞分泌的AGP1(nAGP1)肽段序列一致,但二者糖型不同,表現(xiàn)功能不同,sAGP1限制血小板反應(yīng)性,nAGP1限制sAGP1的促炎作用。AGP1還是免疫調(diào)節(jié)蛋白,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[15]。Sumanth等[16]報(bào)道,AGP1上調(diào)巨噬細(xì)胞中MAPK信號(hào)。AGP1也可與納米粒子相互作用,既能保持蛋白質(zhì)的天然活性,又可減少納米粒子的細(xì)胞毒性[17]。此外,AGP1可作為腫瘤的診斷和預(yù)后指標(biāo),例如用于早期乳腺癌的診斷[18]和胰腺癌的預(yù)后判斷[19]。Zhang等[20]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定發(fā)現(xiàn),AGP1的表達(dá)水平在喉癌組明顯高于健康組,用于喉癌診斷的AUC值為0.92,靈敏度為78.80%,特異性為89.70%,并且其與喉癌進(jìn)展相關(guān),提示AGP1有潛力作為喉癌診斷的生物標(biāo)志物。研究表明,AGP1的N-糖基化修飾在疾病中發(fā)生改變,具有很大的診斷和預(yù)后潛力,如用于Ⅱ型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)判斷[21]。Ayyub等[22]也報(bào)道,糖基化的AGP1可作為肺癌潛在的血清生物標(biāo)志物。

然而,關(guān)于AGP1在肺癌中的研究報(bào)道較少。為進(jìn)一步研究AGP1在肺癌的表達(dá)及其臨床意義,本研究通過(guò)生物信息技術(shù)分析AGP1在肺癌中的表達(dá)及與肺癌患者生存的關(guān)系,通過(guò)組織和血清樣本驗(yàn)證AGP1在早期肺癌中的表達(dá),最后通過(guò)分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)探究過(guò)表達(dá)AGP1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖的影響,以期為AGP1用于肺癌的生存評(píng)估或靶向AGP1的肺癌治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集和分離

所有患者及健康受試者樣本采集自南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院,收集的臨床樣本信息見(jiàn)表1。NSCLC患者通過(guò)LDCT和組織病理學(xué)分析確診,肺癌患者分期按照國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(International Association for the Study of Lung Cancer,IASLC)的第八版TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)。本實(shí)驗(yàn)共收集了9例非腫瘤樣本(3例健康樣本和6例良性疾病患者)和6例NSCLC IA期患者的血清樣本。患者血清在外科手術(shù)前收集,采集的血液樣品于4℃400g離心20 min,隨后將血清按每管200 μL進(jìn)行分裝,并立即凍存于-70℃?zhèn)溆?。每份血清在使用前不超過(guò)兩次凍融。

表1 樣本信息Table 1 Sample information in this study

4對(duì)組織樣本在患者手術(shù)過(guò)程中收集,癌旁組織距離癌組織2 cm。組織樣本采集后液氮速凍,立即置于-70℃凍存?zhèn)溆谩＝M織樣本先在6孔板中用滅菌的剪刀剪碎,加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)(Sigma-Aldrich公司,德國(guó))的RIPA裂解液和陶瓷珠,隨后在全自動(dòng)樣品快速研磨儀中研磨60 s,共研磨5次。冰上放置30 min后,12 000 r/min離心10 min,收集的上清液即為組織勻漿的蛋白質(zhì)提取物。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析與統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/;2020-05-07)分析AGP1基因在肺癌中的表達(dá)。運(yùn)用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cbioportal.org/;2020-05-07)分析AGP1基因在肺癌中的DNA改變情況。用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/;2021-01-24)分析AGP1與其他蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系,探究AGP1在肺癌中表達(dá)變化可能涉及的調(diào)控機(jī)制。運(yùn)用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Protein Atlas,HPA;https://www.proteinatlas.org/;2021-01-24)和SPSS軟件(v26.0)統(tǒng)計(jì)分析AGP1表達(dá)與早期肺癌患者生存的關(guān)系。運(yùn)用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(https://kmplot.com/analysis/;2021-01-24)分析AGP1表達(dá)與肺癌患者生存的相關(guān)性。蛋白質(zhì)印跡條帶經(jīng)Image J軟件進(jìn)行量化分析后,再用GraphPad Prism軟件(v8.0)中非配對(duì)的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P＜0.05被認(rèn)為有顯著差異。

1.3 目的基因AGP1的擴(kuò)增

從人cDNA文庫(kù)中獲取AGP1的cDNA(cDNA模板由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孫慧教授贈(zèng)送),以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為5′-TGTACCAGACTACGCTGGCCGGCCAGAATTCatggcgctgtcctgggttcttac-3′,下游引物為 5′-TCTACGTAATACGACTCACTATAGTTCTAGActaggattccccctcctcctg-3′,引物訂購(gòu)于武漢擎科生物科技有限公司。上游引物中引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(GAATTC),下游引物中引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)(TCTAGA)。擴(kuò)增條件:98℃預(yù)變性5 min,然后以98℃變性15 s、60℃復(fù)性15 s、72℃延伸30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min。

1.4 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物條帶,隨后切膠,用膠回收試劑盒(No.D2500-01-100T,OMEGA公司,美國(guó))回收PCR產(chǎn)物;同時(shí),將帶有HA標(biāo)簽的空載質(zhì)粒pCS2-HA用EcoRⅠ、XbaⅠ于37℃雙酶切過(guò)夜,回收酶切產(chǎn)物;雙酶切產(chǎn)物(空載體)和基因片段(AGP1基因)用重組克隆酶(2×MultiF Seamless Assembly Mix,武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司)在50℃連接15 min;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取大小適宜、邊緣光滑的單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定,篩選陽(yáng)性克隆,并由武漢擎科生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序比對(duì)正確的克隆擴(kuò)大培養(yǎng),用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(No.CW2105,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10%Gibco胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細(xì)胞 A549、H157、SK-LU-1、H1299 和H1975,以及其他細(xì)胞如293T細(xì)胞、肝癌細(xì)胞Hep G2、宮頸癌細(xì)胞HeLa和乳腺癌細(xì)胞MCF7,培養(yǎng)箱條件:37℃、5%CO2,用胰酶消化傳代。所有細(xì)胞均由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孫慧教授贈(zèng)送。

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和H157細(xì)胞,分別重懸,A549細(xì)胞按每孔3.00×105個(gè)種植于6孔板中,H157細(xì)胞按每孔2.45×105個(gè)種植于6孔板中;待6孔板中細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),用Highgene轉(zhuǎn)染試劑(No.RM09014,武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.6 Western-blot檢測(cè)

收集6孔板中轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌兩次,加入含0.20 mmol/L PMSF的RIPA裂解液,冰上裂解30 min,隨后12 000 r/min離心10 min,吸取上清至新管中。用BCA試劑盒(Thermo Fisher公司,美國(guó))于562 nm處測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。上樣的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)15%SDS-PAGE電泳后,在300 mA電流下轉(zhuǎn)膜45 min;膠中蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene),PVDF]膜(Merck Millipore公司,德國(guó))上后,用5%脫脂牛奶封閉過(guò)夜。洗膜3次,室溫孵育AGP1抗體(1∶2 000稀釋,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)和GAPDH抗體(1∶10 000稀釋,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)1 h;洗膜3次,室溫孵育羊抗兔HRP-IgG二抗(1∶5 000稀釋,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)或羊抗鼠HRP-IgG二抗(1∶5 000稀釋,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)1 h;洗膜3次后顯影,用Vilber FUSION FX7化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。

1.7 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和H157細(xì)胞,重懸成單細(xì)胞懸液,種植于96孔板中,A549細(xì)胞每孔種植5.00×103個(gè),H157細(xì)胞每孔種植4.08×103個(gè),過(guò)夜培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)AGP1基因的質(zhì)粒,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后每孔加入10 μL CCK-8試劑(Dojindo),放在培養(yǎng)箱中孵育,每隔30 min用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。將所測(cè)的值用Excel表按如下公式計(jì)算:細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%,并用GraphPad Prism軟件(v8.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGP1在肺癌中的表達(dá)

采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析AGP1在肺腺癌(LUAD)和肺鱗癌(LUSC)中的表達(dá),結(jié)果顯示,相對(duì)正常肺組織樣本,AGP1的mRNA表達(dá)水平在LUAD樣本(n=483)中無(wú)明顯差異,但在LUSC樣本(n=486)中顯著下調(diào)(圖1A)。進(jìn)一步的臨床樣本W(wǎng)estern-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,NSCLC患者肺癌組織中AGP1蛋白的表達(dá)水平下降,但無(wú)顯著差異(P=0.08)(圖1B和1C);而相對(duì)于非腫瘤(non-tumor)樣品,早期NSCLC(stage IA)患者血清中AGP1蛋白的表達(dá)顯著下降(圖1D和1E)。

圖1 AGP1在肺癌中的表達(dá)水平(A)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析肺腺癌和肺鱗癌組織中AGP1 mRNA表達(dá)水平。紅色表示腫瘤組織(T),灰色表示正常組織(N)。TPM,transcripts per million。參數(shù)設(shè)置:|log2(變化倍數(shù))|閾值:1;P值閾值:0.01;log scale:是,用log2(TPM+1)表示;Jitter大小:0.4;匹配正常數(shù)據(jù):匹配TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中正常樣本和GTEx數(shù)據(jù);(B)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺癌患者組織中AGP1蛋白表達(dá)水平。15 μg組織裂解液上樣到15%的SDS-PAGE中,轉(zhuǎn)膜后分別用AGP1和GAPDH一抗孵育,再用HRP-IgG二抗孵育,曝光時(shí)間5 s,最后顯示的條帶用Image J軟件進(jìn)行分析。PN,患者癌旁組織;PT,患者腫瘤組織;(C)統(tǒng)計(jì)分析肺癌組織中AGP1表達(dá)水平;(D)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺癌患者血清中AGP1蛋白表達(dá)水平。5 μg血清蛋白上樣到15%SDS-PAGE中,轉(zhuǎn)膜后用AGP1一抗孵育,再用HRP-IgG二抗孵育,曝光時(shí)間5 s,最后顯示的條帶用Image J軟件進(jìn)行分析;(E)統(tǒng)計(jì)分析AGP1在肺癌患者血清中的表達(dá)。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,*P＜0.05。Fig.1 The expression level of AGP1 in lung cancer(A)Analysis of the AGP1 mRNA expression levels in LUAD and LUSC tissues by GEPIA database(http://gepia.cancer-pku.cn/).Red represents tumor(T)tissues and gray represents normal(N)tissues.TPM,transcripts per million.Parameter settings:|log2(fold change)|cutoff:1;P-value cutoff:0.01;log scale:Yes,and the log2(TPM+1)was used for log-scale;Jitter size:0.4;Matched normal data:Match TCGA normal and GTEx data;(B)Detection of the AGP1 expression levels in tissues of lung cancer patients by Western-blot.The tissue lysates(15 μg)were loaded to 15%SDS-PAGE.After transferred onto the PVDF membrane,the blots were probed with anti-AGP1 and-GAPDH antibodies,and then incubated with HRP-IgG secondary antibody.The exposure time was 5 s.Band intensities were analyzed by Image J software.PN,paracancerous tissues in patient;PT,tumor tissues in patient;(C)Statistics analysis of AGP1 expression in lung tissues;(D)Detection of the AGP1 expression levels in sera of lung cancer patients by Western-blot.5 μg of proteins from sera were loaded to 15%SDS-PAGE and transferred onto the PVDF membrane.The blots were probed with anti-AGP1 antibody,and then incubated with HRP-IgG secondary antibody.The exposure time for blots was 5 s.Band intensities were analyzed by Image J software;(E)Statistics analysis of AGP1 expression in sera of lung cancer patients.The statistics data are expressed as mean± standard error.*P＜0.05.

2.2 AGP1表達(dá)與肺癌患者生存的相關(guān)性

利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)和SPSS統(tǒng)計(jì)分析AGP1表達(dá)與NSCLC生存的關(guān)系,結(jié)果顯示,AGP1低表達(dá)肺癌患者的存活時(shí)間要比AGP1高表達(dá)肺癌患者的存活時(shí)間更短。在肺癌發(fā)生早期(IA期),AGP1 mRNA表達(dá)水平的FPKM(fragments per kilobase million)臨界值(cutoff)為0.60,高于0.60的肺癌患者(n=150)生存時(shí)間長(zhǎng),低于0.60的肺癌患者(n=50)生存時(shí)間短,但兩者間沒(méi)有顯著差異(P=0.37)(圖2A)。進(jìn)一步利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析AGP1表達(dá)與肺癌患者生存的關(guān)系,生存曲線顯示,AGP1低表達(dá)的肺癌患者(n=1 075)的中位生存時(shí)間為64.10個(gè)月,高表達(dá)AGP1的肺癌患者(n=850)的中位生存時(shí)間為72.33個(gè)月,差異具有顯著性(P=0.03)(圖2B),該結(jié)果同樣表明AGP1低表達(dá)的肺癌患者生存率更低。

圖2 肺癌中AGP1表達(dá)與生存的相關(guān)性分析(A)AGP1表達(dá)與早期肺癌患者生存的相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)來(lái)源于HPA數(shù)據(jù)庫(kù),用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;(B)AGP1表達(dá)與所有肺癌患者生存的相關(guān)性分析,數(shù)據(jù)來(lái)源于Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)。Fig.2 Correlation analysis of AGP1 expression and survival in lung cancer(A)Correlation analysis between AGP1 expression and the survival of early lung cancer patients.The data was derived from HPA database and analyzed by SPSS software(v26.0);(B)Correlation analysis between AGP1 expression and the survival of all lung cancer patients.The data was derived from Kaplan-Meier Plotter database.

2.3 肺癌細(xì)胞株中AGP1蛋白的表達(dá)

利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析AGP1在細(xì)胞水平的表達(dá)(https://www.proteinatlas.org/ENSG00000229314-ORM1/cell;2020-05-07),結(jié)果顯示,AGP1 mRNA在肺癌細(xì)胞株A431和A549中的表達(dá)水平較低。我們也檢測(cè)了培養(yǎng)的5種肺癌細(xì)胞株A549、SKLU-1、H1299、H157和H1975,以及 4種其他非肺癌細(xì)胞株如293T細(xì)胞、肝癌細(xì)胞Hep G2、宮頸癌細(xì)胞HeLa和乳腺癌細(xì)胞MCF7中AGP1的表達(dá)水平,結(jié)果表明AGP1蛋白在上述5種肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)量也相對(duì)較低(圖3)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中AGP1的表達(dá)10 μg細(xì)胞裂解液和3 μg非腫瘤樣品的血清蛋白上樣到15%SDS-PAGE中,轉(zhuǎn)膜后分別用AGP1和GAPDH一抗孵育,再用HRP-IgG二抗孵育,曝光時(shí)間是30 s。Fig.3 Detection of AGP1 expression in cell lines by Western-blotThe cell lysates(10 μg)and sera(3 μg)from non-tumor samples were loaded to 15%SDS-PAGE.After transferred onto the PVDF membrane,the blots were probed with anti-AGP1 and-GAPDH antibodies,respectively,and then the blots were incubated with HRP-IgG secondary antibody.The exposure time was 30 s.

2.4 過(guò)表達(dá)AGP1基因?qū)SCLC細(xì)胞增殖的影響

將AGP1基因過(guò)表達(dá)載體pCS2-HA-AGP1分別轉(zhuǎn)染到LUAD細(xì)胞A549和LUSC細(xì)胞H157中,采用Western-blot檢測(cè)AGP1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,與空載對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染組的AGP1蛋白表達(dá)量顯著增加,表明AGP1基因在NSCLC細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)(圖4A)。

運(yùn)用CCK-8試劑檢測(cè)AGP1過(guò)表達(dá)對(duì)A549和H157細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)AGP1基因可顯著抑制A549和H157細(xì)胞的增殖(圖4B和4C)。

圖4 過(guò)表達(dá)AGP1基因后肺癌細(xì)胞A549和H157的增殖情況(A)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺癌細(xì)胞中AGP1的表達(dá)。10 μg細(xì)胞裂解液上樣用于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè);(B)AGP1基因過(guò)表達(dá)24 h后CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞A549和H157的增殖情況;(C)AGP1基因過(guò)表達(dá)48 h后CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞A549和H157的增殖情況。采用非配對(duì)的t檢驗(yàn)在GraphPad Prism(v8.0)中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,*P＜0.05。Fig.4 The proliferation of both A549 and H157 cells after overexpression of the AGP1 gene(A)Detection of AGP1 expression in lung cancer cells by Western-blot.10 μg of cell lysates were loaded to 15%SDS-PAGE and used for Western-blot detection;(B)Detection of proliferation in A549 and H157 cells after overexpression of AGP1 for 24 h with CCK-8 kits;(C)Detection of proliferation in A549 and H157 cells after overexpression of AGP1 for 48 h with CCK8 kits.The statistics data were analyzed by unpaired t-test using GraphPad Prism(v8.0).*P＜0.05.

2.5 生物信息學(xué)分析AGP1基因改變和AGP1互作蛋白質(zhì)

運(yùn)用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)中1 144例肺癌樣本分析NSCLC患者AGP1表達(dá)下降可能的原因,發(fā)現(xiàn)肺癌中AGP1基因總的改變率是1.10%,其中LUAD中的突變比例是0.91%,擴(kuò)增比例是0.30%,缺失比例是0.30%;LUSC中的突變比例是0.41%,缺失比例是0.21%(圖5A)。因此,DNA水平的改變可能是AGP1表達(dá)水平降低的原因之一。

進(jìn)一步的STRING網(wǎng)站分析顯示,AGP1蛋白可與多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,包括白蛋白(albumin,ALB)、纖維蛋白原γ鏈(fibrinogen gamma chain,FGG)、α2-巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin,A2M)、纖維蛋白原β鏈(fibrinogen beta chain,FGB)、纖維蛋白原α鏈(fibrinogen alpha chain,FGA)、富含組氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein,HRG)、胎球蛋白 A(human alpha-2-HS glycoprotein,AHSG)、絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(serine protease inhibitor A1,SERPINA1)、血清類黏蛋白2(orosomucoid 2,ORM2)和觸珠蛋白(haptoglobin,HP)(圖 5B)。

圖5 AGP1基因改變和AGP1互作蛋白質(zhì)分析(A)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cbioportal.org/)分析AGP1基因中DNA的改變頻率;(B)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)分析與AGP1相互作用的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。物種:人。Fig.5 Analysis of the AGP1 expression change and interaction protein with AGP1(A)Analysis of the DNA change in AGP1 gene in lung cancer by cBioPortal database(http://cbioportal.org/);(B)Analysis of the protein-protein network that interacts with AGP1 by STRING database(https://string-db.org/).Organism:Homo sapiens.

3 討論

本團(tuán)隊(duì)前期經(jīng)免疫組織化學(xué)和Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AGP1蛋白在早期NSCLC組織和血清中表達(dá)水平下降,提示AGP1有望作為新的血清腫瘤標(biāo)志物用于NSCLC早期診斷[7～8],但AGP1在肺癌發(fā)生中的具體作用以及可否用于肺癌預(yù)后判斷還不清楚。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),AGP1在LUSC中轉(zhuǎn)錄水平顯著下降,在LUAD中無(wú)明顯差異表達(dá)(圖1A);進(jìn)一步的Western-blot分析也證實(shí),AGP1在早期肺癌組織和血清中表達(dá)下降(圖1B～D)。文中cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果提示,AGP1在兩種肺癌中的表達(dá)水平不同可能是由于AGP1在LUAD和LUSC中的DNA改變頻率不同(圖5A),但這仍需臨床樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。前期我們團(tuán)隊(duì)還報(bào)道了AGP1蛋白在63例晚期NSCLC患者血清中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)晚期時(shí)AGP1表達(dá)水平恢復(fù)[8];肺癌動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)也證明AGP1蛋白在肺癌晚期表達(dá)水平回復(fù)[7～8],這些表明AGP1只在早期NSCLC較短的一個(gè)窗口期呈現(xiàn)表達(dá)水平下降,可能與腫瘤發(fā)生復(fù)雜的調(diào)控有關(guān)。此外,據(jù)研究報(bào)道,腺癌和鱗癌發(fā)展的細(xì)胞來(lái)源不同,且不同的基因通過(guò)調(diào)控不同的信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生[3];Li等[23]也報(bào)道,與LUAD預(yù)后相關(guān)的基因并不與LUSC預(yù)后相關(guān),表明AGP1在LUAD和LUSC中表達(dá)變化不同可能與腺癌和鱗癌本身也有關(guān)。Luo等[10]報(bào)道,AGP1基因的表達(dá)主要受糖皮質(zhì)激素、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6等因子的綜合調(diào)控。我們通過(guò)蛋白質(zhì)互作分析發(fā)現(xiàn),AGP1蛋白與急性時(shí)相蛋白HP、ORM2和絲氨酸蛋白酶抑制劑SERPINA1有相互作用(圖5B),而HP蛋白β鏈被報(bào)道也可作為NSCLC的血清診斷標(biāo)志物[24]。TGF-β通過(guò)誘導(dǎo)NSCLC的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。Smad4是TGF-β信號(hào)通路的重要組成部分,在TGF-β誘導(dǎo)NSCLC的EMT中發(fā)揮重要作用[26]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn),肺癌患者血清中AGP1表達(dá)下降可能是TGF-β/Smad通路調(diào)控中性粒細(xì)胞中AGP1的表達(dá)導(dǎo)致[8]。因此,TGF-β/Smad通路及與HP蛋白的相互作用可能是AGP1參與肺癌發(fā)生的機(jī)制之一,但仍需更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證?？偟膩?lái)講,本研究結(jié)果為AGP1參與肺癌發(fā)生提供了參考依據(jù)。

Yokobori等[27]報(bào)道,巖藻糖基化修飾的AGP可作為肺癌患者經(jīng)納武單抗免疫治療后的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。有研究指出,血清AGP可作為NSCLC患者服用多烯紫杉醇后中性粒細(xì)胞減少的預(yù)測(cè)指標(biāo)[28];Bruno等[29]也報(bào)道,AGP可作為多烯紫杉醇治療NSCLC患者的預(yù)后生存判斷指標(biāo),可作為療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。本研究發(fā)現(xiàn),AGP1的表達(dá)與肺癌患者生存有關(guān),低表達(dá)AGP1的肺癌患者其生存率更短(圖2),表明AGP1有作為肺癌預(yù)后判斷指標(biāo)的潛力,具有重要臨床價(jià)值。

雖然肺癌的治療效果在臨床上已有較大改善,但肺癌總體生存率較低。當(dāng)前,已有許多研究報(bào)道肺癌的治療策略和療效評(píng)價(jià),如:血清中表面活性蛋白D(surfactant protein D,SFTPD)通過(guò)封閉配體與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的結(jié)合抑制EGFR信號(hào)通路,可用于臨床EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療效果的評(píng)估指標(biāo)[30～31];galectin-3可作為肺癌治療的藥物靶標(biāo)[32～33];β-糖可用于原發(fā)和轉(zhuǎn)移性肺癌的治療[34]。Wang等[35～36]報(bào)道,AGP1蛋白可分別與布加替尼(brigatinib)和塞立替尼(ceritinib)相互作用,用于漸變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)陽(yáng)性的晚期NSCLC患者的治療。本研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)AGP1基因可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖(圖4),表明AGP1參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,AGP1在LUSC中轉(zhuǎn)錄水平下降,在早期肺癌組織和血清中也表達(dá)下降,這可能是其DNA頻率改變或信號(hào)通路調(diào)控變化導(dǎo)致,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究;AGP1的表達(dá)與肺癌患者生存有關(guān),低表達(dá)AGP1的肺癌患者其生存率更短,表明AGP1有望作為肺癌預(yù)后判斷指標(biāo);過(guò)表達(dá)AGP1基因可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖,暗示AGP1有望作為肺癌治療的一個(gè)靶點(diǎn)。本研究闡明了AGP1在肺癌中的表達(dá)改變、生物學(xué)功能和臨床意義,為AGP1可能用于肺癌診斷、生存評(píng)估和治療靶點(diǎn)提供了科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。