楊一凡 王亭 劉世國 李冰

[摘要] 目的 分析1例X連鎖低磷血癥性佝僂病（XLH）病人遺傳學(xué)改變及其基因型表型。

方法 對1例散發(fā)性低磷血癥性佝僂病病人進(jìn)行全外顯子組測序（WES）分析，找出致病基因突變位點(diǎn)，結(jié)合病人臨床表現(xiàn)進(jìn)行基因型和表型的分析。對先證者及其同胞進(jìn)行Sanger測序驗證。

結(jié)果 實驗室檢查顯示，先證者血清磷降低，堿性磷酸酶升高，甲狀旁腺激素升高；X射線及磁共振成像檢查顯示，病人下肢嚴(yán)重內(nèi)翻畸形，胸椎管狹窄，腰椎間盤突出及胸腰椎退行性病變。測序結(jié)果顯示，先證者PHEX基因的第15內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)一個異常剪接位點(diǎn)的雜合突變c.1646-2A>G，其同胞未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變。因此，先證者被診斷為XLH。

結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)了1例XLH病人PHEX基因剪接位點(diǎn)突變，有助于了解和完善中國XLH病人的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 家族性低血磷性佝僂病；全外顯子組測序；X染色體上內(nèi)肽酶同源磷調(diào)節(jié)基因；DNA突變分析

[中圖分類號] R596.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）05-0639-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.126

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20220713.0951.002.html;2022-07-13 17：12：23

SPLICE SITE MUTATION AND PHENOTYPE IN X-LINKED HYPOPHOSPHATEMIC RICKETS： A CASE ANALYSIS

YANG Yifan， WANG Ting， LIU Shiguo， LI Bing

（Department of Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）;

[ABSTRACT] Objective To analyze the genetic change， genotype， and phenotype of a patient with X-linked hypophosphatemic rickets （XLH）.

Methods A case of sporadic hypophosphatemic rickets was analyzed by whole exome sequencing to identify the mutation site of the disease gene， and the genotyping and phenotypic analysis were performed in combination with the clinical manifestations of the patient. The proband and her siblings were validated by Sanger sequencing.

Results Laboratory examinations for the proband showed a decrease in phosphorus and an increase in alkaline phosphatase and parathyroid hormone in the serum. Radiological examinations （X-ray， and magnetic resonance imaging） revealed severe varus deformity of the lower limbs， thoracic spinal stenosis， lumbar disc herniation， and thoracolumbar degenerative disease. Sequencing results showed that an abnormal heterozygous mutation at the splice site c.1646-2A>G was identified at the intron 15 of the PHEX gene in the proband， which was not found in her siblings. Therefore， the proband was diagnosed as having XLH.

Conclusion In this study， a splice site mutation in the PHEX gene has been identified in a patient with XLH， which is helpful to understand and improve the genetic basis of XLH patients in China.

[KEY WORDS] familial hypophosphatemic rickets; whole exome sequencing; phosphate-regulating gene with homologies to endopeptidase on the X chromosome; DNA mutational analysis

低磷血癥性佝僂病是一種具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的骨代謝障礙性疾病，其臨床表現(xiàn)為生長緩慢、負(fù)重肢體彎曲，一般在1～2歲后表現(xiàn)明顯，常伴有腎臟磷酸鹽重吸收缺陷和異常骨礦化^[1-3]。X-連鎖低磷血癥性佝僂病（XLH，OMIM#307800）是其中最常見的類型，發(fā)病率約為 1/20 000^[4]。XLH是由于X染色體上內(nèi)肽酶同源磷調(diào)節(jié)基因（PHEX，OMIM#300550，NM_000444.6）失活性突變引起的^[5]。PHEX基因位于Xp22.1上，由22個外顯子組成，全長243 kb^[6-7]。常規(guī)技術(shù)檢查（包括放射技術(shù)檢查和電生理檢查）對XLH診斷有輔助性作用，但由于XLH具有臨床和遺傳異質(zhì)性，無法根據(jù)臨床數(shù)據(jù)確定基因型與表型的相關(guān)性。本研究通過全外顯子組測序（WES）和Sanger測序驗證，結(jié)合病人的實驗室和影像學(xué)檢查結(jié)果，從1個XLH中國家系中鑒定出1個PHEX基因的異常剪接突變?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象

病人來自山東省的一個患有XLH的中國家庭。先證者為女性，47歲（圖1中Ⅱ3），根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和實驗室檢查，在青島大學(xué)附屬醫(yī)院臨床診斷為XLH。其他家系成員均無此病（圖1）。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得家系成員的知情同意。

正方形表示男性，圓圈表示女性；黑色符號表示受影響的成員；黑色箭頭表示家族中的先證者。

1.2 實驗室和影像學(xué)檢查

采集先證者空腹靜脈血，應(yīng)用日立7600全自動生化分析儀測定血鈣、磷和堿性磷酸酶（ALP）濃度。用ECLIA Elecsys全自動分析儀（E170，德國曼海姆羅氏診斷公司）測定血清1，25-雙羥維生素D（1，25（OH）2D）和甲狀旁腺激素（PTH）水平。用3.0 Tesla臨床掃描儀（GE HDX 3.0 T MR系統(tǒng)，GE Medical System，Milwaukee，USA）對病人進(jìn)行腰椎和胸椎磁共振成像（MRI）檢查，并與之前在同一家醫(yī)院、使用相同的MRI技術(shù)和相同的臨床掃描儀檢查、年齡和性別匹配的健康個體50名進(jìn)行比較。同時進(jìn)行X線檢查。

1.3 突變基因檢測

1.3.1 基因組DNA提取 分別采集該家系Ⅱ代成員的血液樣本2 mL，使用Qiagen DNA試劑盒提取DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.2 WES分析 對先證者（Ⅱ3）進(jìn)行WES分析。打斷基因組DNA，完成DNA片段化和接頭連接，制備cDNA文庫。應(yīng)用Aglient 2100檢驗合格的cDNA文庫，將經(jīng)過富集的DNA應(yīng)用Illumina HISeq 2000測序儀進(jìn)行雙末端測序，平均測序深度達(dá)96.2×，目標(biāo)區(qū)域97.67×，覆蓋率為98%。去除接頭污染和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選結(jié)果應(yīng)用MaxEntScan、Spliceman對可能有害的突變進(jìn)行預(yù)測，從而發(fā)現(xiàn)該家系致病的突變基因。

1.3.3 Sanger測序 將WES所測得的高致病突變，在該家系第Ⅱ代樣本中進(jìn)行Sanger測序，以驗證WES結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用Primer express 3.0軟件設(shè)計引物（引物序列F：CATGTATGAAGGAGCCCAGCTT；R：CCTGGTAACAAGGATCAGAAAACA），對檢出突變所在外顯子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50.0 μL，包括：Master Mix 21.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。擴(kuò)增完成后，PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對擴(kuò)增條帶明亮且單一者使用ABI 3730XL測序儀（Applied Biosystems 3730-XL）進(jìn)行測序。用BioEdit（Borland，V7.0.1）程序?qū)NA序列進(jìn)行分析，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行比較。然后應(yīng)用聚合物鑒定突變位點(diǎn)，比對人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）鑒定新突變。

2 結(jié) 果

2.1 XLH家系臨床特點(diǎn)和實驗室檢查先證者，女，47歲。父母非近親結(jié)婚，G3P3，正常自然陰道分娩。出生體質(zhì)量2.4 kg，初次啼哭無延遲。臨床表現(xiàn)為身材矮小（身高140 cm，體質(zhì)量65 kg，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）33.16 kg/m²），下肢膝內(nèi)翻嚴(yán)重畸形，牙齒發(fā)育不良。臨床主要癥狀為步態(tài)異常，腰痛10年，下肢麻木2年。其他家庭成員無相關(guān)臨床癥狀。先證者實驗室檢查結(jié)果顯示：血鈣2.16 mmol/L（正常范圍2.08～2.60 mmol/L），血磷0.5 mmol/L（正常范圍0.8～1.6 mmol/L），ALP 133 U/L（正常范圍15～112 U/L），PTH 67 ng/L（正常范圍15～65 ng/L），1，25（OH）2D 21.24 μg/L（正常范圍20～35 μg/L）。其他家系成員的臨床表現(xiàn)和實驗室結(jié)果均正常。先證者X線檢查顯示嚴(yán)重的下肢內(nèi)翻畸形（圖2A）；MRI檢查：胸椎管狹窄、腰椎間盤突出、胸腰椎退行性病變（圖2B），全身松質(zhì)骨數(shù)量增加，骨密度增高，骨盆韌帶骨化。其他50名健康個體影像學(xué)檢查均無異常。

2.2 突變基因的WES分析及Sanger測序驗證

WES分析顯示，先證者存在1個PHEX基因剪接位點(diǎn)雜合突變（c.1646-2A>G，NM_000444.

6），即該基因編碼cDNA的第1646位點(diǎn)（第15內(nèi)含子）上游的第2個堿基由腺嘌呤（A）變?yōu)轼B嘌呤（G），導(dǎo)致剪接位點(diǎn)突變，從而引起編碼蛋白功能異常。MaxEntScan（http：//hollywood.mit.edu/bur-gelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html）分析顯示，Maximum Entropy Model（MAXENT）-6.23，F(xiàn)irst-order Markov Model（MM）-5.56，Weight Matrix Model（WMM）-3.09，對應(yīng)的野生型評分分別為11.09、11.88、13.81；Spliceman指數(shù)顯示62%。該突變可能會影響mRNA剪接，從而影響編碼蛋白功能，最終導(dǎo)致疾病表現(xiàn)。

對WES分析顯示的高度可疑致病位點(diǎn)c.1646-2A>G進(jìn)行Sanger測序驗證，結(jié)果表明，先證者攜帶該致病突變，而家系中其他兩位正常成員（Ⅱ1、Ⅱ2）未發(fā)現(xiàn)該基因的異常。此外，在中國山東的100名無關(guān)健康對照者中也未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。因此，先證者可被診斷為XLH。

3 討 論

XLH是低磷血癥性佝僂病中最常見的類型，因為病人維生素D吸收相對無效，因此XLH病人的臨床表現(xiàn)與大多數(shù)佝僂病病人的臨床表現(xiàn)不同^[9]。XLH病人實驗室檢查表現(xiàn)為低磷血癥、ALP升高、血鈣正常、1，25（OH）2D正?；蚱汀TH正?；蚱?sup>[4]。XLH病人在兒童發(fā)育早期由于腎臟磷酸鹽滲漏導(dǎo)致血液中磷酸鹽水平降低和骨礦化缺陷而對維生素D治療產(chǎn)生抵抗力；隨著年齡增長，病人會出現(xiàn)自發(fā)性牙齒膿腫、廣泛骨痛和關(guān)節(jié)病等^[5-7]。雖然患有XLH的病人臨床表現(xiàn)不盡相同，但其特點(diǎn)均為佝僂骨畸形、身材矮小和牙齒畸形等^[3]。

PHEX的失活性突變可致磷調(diào)節(jié)因子纖維生長因子23（FGF23）升高，減少腎小管磷的重吸收，抑制活性維生素D的生成，導(dǎo)致骨骼礦化障礙^[9]。因此，PHEX基因的功能喪失伴隨骨骼礦化缺陷、FGF23的合成和分泌增強(qiáng)。迄今為止，在XLH病人中已發(fā)現(xiàn)約460個PHEX突變，國內(nèi)也有相關(guān)病例報道^[10-12]。然而，PHEX失活導(dǎo)致XLH骨骼和腎臟異常的確切機(jī)制尚未完全闡明。

PHEX基因如發(fā)生病理性變異可導(dǎo)致低磷血癥性佝僂病，通常以X連鎖顯性的方式遺傳：男性病人可將病理性變異遺傳給女兒，女兒患病率為100%，因為男性通常只有一個X染色體的半合子，所以X連鎖顯性疾病在男性中的表達(dá)率通常高于女性^[13-15]。女性病人有50%的可能將病理性變異遺傳給子女，但通常女性病人的癥狀較輕，無明顯的骨骼發(fā)育畸形，只表現(xiàn)為低磷血癥^[16]。

對散發(fā)性病人，PHEX基因突變的分子診斷對于確認(rèn)XLH的臨床診斷，進(jìn)行遺傳咨詢和促進(jìn)產(chǎn)前干預(yù)具有重要意義。國內(nèi)外研究顯示，XLH病人在出現(xiàn)生長障礙及佝僂病體征前的嬰兒期開始治療，其身高改善及病情減輕較1歲后開始治療者效果好^[17]。XLH病人的子女應(yīng)在出生后3個月內(nèi)仔細(xì)追蹤，盡早治療。

2014年YUE等^[18]報道了9個中國漢族無關(guān)家系（其中有3個散發(fā)性病例）的16例病人（5例男性，11例女性），12例病人有膝內(nèi)翻的表現(xiàn)，但嚴(yán)重程度不一；4例病人存在牙齒發(fā)育異常，其中2例病人有不同程度的牙齒脫落。對相關(guān)研究報道的病例進(jìn)行比較顯示，不同種族的相同基因突變會導(dǎo)致不同的臨床特征^{[1，18]}。

本研究通過對1例中國XLH病人的WES分析及Sanger測序驗證，結(jié)合病人的臨床表現(xiàn)、實驗室和影像學(xué)檢查結(jié)果，確定了一個影響RNA轉(zhuǎn)錄本的致病基因突變，該突變位于PHEX基因內(nèi)含子15剪接受體位點(diǎn)（c.1646-2A>G）。隨著對XLH遺傳學(xué)分子基礎(chǔ)認(rèn)識的加深和我國XLH病人數(shù)量的增加，將有望闡明PHEX基因復(fù)雜的基因型-表型關(guān)系和功能，有助于XLH的早期分子診斷和治療。本研究為深入了解XLH的病理生理機(jī)制，更準(zhǔn)確迅速地診斷該遺傳性出生缺陷疾病奠定基礎(chǔ)。今后需要對更多的中國XLH病人進(jìn)行研究，以闡明PHEX突變的分布和頻率以及中國XLH病人的基因型-表型關(guān)系。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）