謝文杰，雷坤陽，孫 庭

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌 330006

腎細(xì)胞癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤之一，其中腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）最常見且具有發(fā)病率高、生存期短等特點(diǎn)。近年來，隨著外科技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的早期ccRCC 患者在手術(shù)切除腫瘤后長期存活［1］。晚期ccRCC 患者往往失去了手術(shù)機(jī)會，并且對放射治療和化學(xué)治療不敏感，因此在晚期ccRCC 的治療中靶向治療十分重要［2-3］。

lncRNA 是一類不包含任何開放閱讀框的長度大于200 bp 的RNA［4］。盡管lncRNA 不編碼蛋白質(zhì)，但它卻是生物體內(nèi)多種生物學(xué)過程中不可缺少的調(diào)節(jié)因子［5］。已有許多研究表明，lncRNA 與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有非常密切的聯(lián)系［6-7］。多項(xiàng)研究表明lncRNA 在ccRCC 的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，它可通過多種機(jī)制促進(jìn)ccRCC 細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖、遷移及侵襲［8-9］。LINC00342 是一種長鏈基因間非編碼RNA，最早在2016 年被報(bào)道［10］。目前有關(guān)LINC00342 的研究并不少見，例如，有研究發(fā)現(xiàn)LINC00342 可以促進(jìn)結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展［11-12］。然而，LINC00342 在ccRCC 中的作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究旨在探索LINC00342 在ccRCC 中的作用及其分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)譜動態(tài)分析（GeneExpression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫分析 通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析523 例ccRCC 組織及100 例癌旁組織中LINC00342 的表達(dá)水平，并分析513 例ccRCC 樣本（257 例高表達(dá)，256 例低表達(dá)）中LINC00342 的表達(dá)水平與患者生存率的關(guān)系。

1.2 臨床標(biāo)本的獲取65 例ccRCC 組織及配對的癌旁組織來源于2020 年1 月至2021 年1 月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科接受腎癌根治術(shù)的患者，所有標(biāo)本均經(jīng)病理診斷為ccRCC，患者術(shù)前均未接受過放射治療和化學(xué)治療，組織標(biāo)本采集后立即放入液氮，后轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱內(nèi)保存供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。本研究通過南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，所有患者均知情同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人正常腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2） 及5 種 人ccRCC 細(xì) 胞 系（786-O、A498、ACHN、OS-RC-2、769-P）均購自武漢普諾賽生物科技有限公司。細(xì)胞用含有10% FBS（美國Gibco 公司）和1%青霉素-鏈霉素混合液的RPMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d 更換1 次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至融合度為30%～50%時，用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen 公司）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組如下：siRNA 組（轉(zhuǎn)染si-LINC00342）、陰性對照（negative control，NC）組（轉(zhuǎn)染LINC00342-NC）和空白對照組。轉(zhuǎn)染所需的si-LINC00342、LINC00342-NC均購自漢恒生物科技（上海）有限公司。

1.4 qPCR檢測LINC00342和miRNA-384表達(dá)采用TRIzol 試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）提取組織及細(xì)胞中的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）合成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃15 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 20 s，循環(huán)40次。以β-肌動蛋白及U6作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of primers

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力 將消化、離心并重懸后的細(xì)胞按照每孔2×103個細(xì)胞的密度接種至96 孔板中，培養(yǎng)0、24、48、72 h 時在每孔內(nèi)分別加入10 μL CCK-8 試劑（武漢賽維爾生物科技有限公司），在37 ℃條件下孵育2～4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處的光密度（D450）值。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力將細(xì)胞均勻地接種至6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，用槍頭在每孔中做一“十”字劃痕，PBS 清洗后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，于0 h 和24 h 時在顯微鏡下拍照，并計(jì)算細(xì)胞遷移距離百分比。細(xì)胞遷移距離百分比=（各轉(zhuǎn)染組0 h 劃痕寬度－各轉(zhuǎn)染組24 h 劃痕寬度）/（空白對照組0 h 劃痕寬度－空白對照組24 h 劃痕寬度）×100%。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 事先在Transwell 小室的上室中涂抹基質(zhì)膠（美國Corning公司），待其凝固后備用。在下室中加入600 μL含20% FBS 的培養(yǎng)基，放入Transwell 小室。將細(xì)胞常規(guī)消化、離心后用無血清培養(yǎng)基重懸，在上室中加入200 μL 含2×104個細(xì)胞的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h 時用棉簽將上室擦洗干凈，用甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。風(fēng)干后在顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 用RIPA 裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司）裂解細(xì)胞后提取蛋白質(zhì)，用BCA 法檢測所提取蛋白質(zhì)的濃度。用SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。將PVDF 膜與波形蛋白（vimentin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）和上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體（英國Abcam 公司）孵育過夜后，再與二抗（英國Abcam 公司）孵育1 h，最后用顯影液（武漢賽維爾生物科技有限公司）對PVDF 膜進(jìn)行成像，分析各條帶的灰度值。

1.9 LINC00342下游靶分子的預(yù)測及驗(yàn)證 利用Starbase 網(wǎng)站和LncBook 數(shù)據(jù)庫預(yù)測LINC00342 的下游靶分子，并通過qPCR 驗(yàn)證其表達(dá)，然后預(yù)測LINC00342 與miRNA-384 的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成LINC00342 的野生型（wild type，WT）和突變型（mutation，Mut）結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建目的質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒。使用轉(zhuǎn)染試劑［漢恒生物科技（上海）有限公司］將LINC00342-WT 和LINC00342-Mut 的目的質(zhì)粒分別與miRNA-384 mimic 和NC mimic［漢恒生物科技（上海）有限公司］共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，使用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測系統(tǒng)檢測螢光素酶的活性。螢光素酶活性計(jì)算方法如下：螢光素酶活性＝螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存率的比較采用log-rank 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 LINC00342在ccRCC 組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，LINC00342 在ccRCC 組織中高表達(dá)（P＜0.05），并且LINC00342 高表達(dá)的患者總生存率低于低表達(dá)的患者（P＝0.001 8，圖1）。qPCR檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織和HK-2 細(xì)胞相比，LINC00342 在ccRCC 組織和5 種ccRCC 細(xì)胞系中均呈高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，圖2）。LINC00342 在ccRCC 細(xì) 胞 系786-O 和OS-RC-2 中表達(dá)最高，因此選擇這2 種細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)LINC00342 表達(dá)的中位數(shù)（8.396），將65 例ccRCC 患者分為高表達(dá)組（n＝32）和低表達(dá)組（n＝33）。結(jié)果顯示，LINC00342 高表達(dá)的ccRCC 患者腫瘤直徑更大、臨床分期更晚（P均＜0.05，表2）。

表2 ccRCC 組織中LINC00342 的表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系Tab 2 Relationship between LINC00342 expression in ccRCC tissues and clinicopathological features of patients n (%)

圖1 LINC00342 在ccRCC 組織中的表達(dá)及其與患者總生存率的關(guān)系Fig 1 Expression of LINC00342 in ccRCC tissues and its relationship with overall survival rate

圖2 LINC00342 在ccRCC 組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig 2 Expression of LINC00342 in ccRCC tissues and cell lines

2.2 LINC00342對ccRCC 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用siRNA 沉默LINC00342 能夠抑制786-O 和OS-RC-2 細(xì)胞的增殖能力（P均＜0.05，圖3）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默LINC00342 可使786-O 和OS-RC-2細(xì)胞的遷移能力減弱（P均＜0.05，圖4）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA 組786-O 和OS-RC-2 細(xì)胞的侵襲能力低于NC 組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，圖5）。

圖3 沉默LINC00342 抑制ccRCC 細(xì)胞增殖Fig 3 Silencing of LINC00342 inhibits proliferation of ccRCC cells

圖4 沉默LINC00342 抑制ccRCC 細(xì)胞的遷移Fig 4 Silencing of LINC00342 inhibits migration of ccRCC cells

圖5 沉默LINC00342 抑制ccRCC 細(xì)胞的侵襲Fig 5 Silencing of LINC00342 inhibits invasion of ccRCC cells

2.3 LINC00342對ccRCC 細(xì)胞EMT 的影響 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，沉默LINC00342 可使786-O 和OS-RC-2 細(xì)胞中波形蛋白和神經(jīng)鈣黏素的表達(dá)下調(diào)，上皮鈣黏素的表達(dá)上調(diào)（P均＜0.05，圖6）。提示LINC00342 可能通過調(diào)節(jié)EMT 進(jìn)程促進(jìn)ccRCC 細(xì)胞的遷移及侵襲。

圖6 沉默LINC00342 抑制ccRCC 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 6 Silencing of LINC00342 inhibits expression of EMT-associated proteins in ccRCC cells

2.4 LINC00342促進(jìn)ccRCC 細(xì)胞惡性表型的機(jī)制 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miRNA-384、miRNA-545-5p 和miRNA-19a-3p 可能是LINC00342的下游靶分子（圖7A）。qPCR 結(jié)果顯示，沉默LINC00342可使786-O和OS-RC-2細(xì)胞中miRNA-384的表達(dá)升高（P均＜0.05，圖7B）。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，在786-O 和OS-RC-2 細(xì)胞中，miRNA-384 mimic 與LINC00342-WT 共 轉(zhuǎn) 染 后 螢光素酶活性均下降（P均＜0.05），而miRNA-384 mimic 與LINC00342-Mut 共轉(zhuǎn)染后螢光素酶活性沒有出現(xiàn)明顯下降（P均＞0.05，圖7C～7E），說明miRNA-384 是LINC00342 的下游靶分子。

圖7 miRNA-384 是LINC00342 的靶分子Fig 7 miRNA-384 was a target gene for LINC00342

3 討 論

人類基因組測序結(jié)果顯示，編碼蛋白質(zhì)的RNA只占一小部分，大部分RNA 都是非編碼RNA，其中l(wèi)ncRNA 由于涉及多種生物學(xué)機(jī)制并且與多種腫瘤密切相關(guān)［13］，各國學(xué)者一直熱衷于對其進(jìn)行深入研究。隨著靶向治療的問世，針對腎癌的靶向治療藥物逐漸增多，然而其臨床效果目前尚不能令人滿意，探索lncRNA 在ccRCC 中的作用具有至關(guān)重要的意義［14］。本研究在初始階段對GEPIA 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)LINC00342 在ccRCC組織中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與患者生存率降低有關(guān)，因此將LINC00342 作為研究對象。

本研究采用qPCR 檢測了65 對ccRCC 組織及癌旁組織、5 種ccRCC 細(xì)胞系中LINC00342 的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)LINC00342 在ccRCC 組織及細(xì)胞系的表達(dá)升高，并且其高表達(dá)與腫瘤直徑大、臨床分期晚有關(guān)。為了驗(yàn)證LINC00342在ccRCC中的作用，本研究進(jìn)行了一系列體外實(shí)驗(yàn)，CCK-8 實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC00342可以促進(jìn)ccRCC 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。既往研究發(fā)現(xiàn)LINC00342 在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，并且可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲［11］。LINC00342 在大腸癌中不僅具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，還可阻斷細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞的凋亡［12,15］。因此，LINC00342 可能與腫瘤惡性行為密切相關(guān)。

EMT 通常是指上皮細(xì)胞在經(jīng)歷多種變化后呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞表型，包括遷移能力、侵襲性和抗凋亡能力的增加，以及大量細(xì)胞外基質(zhì)成分的形成［16］。EMT 的特征是上皮標(biāo)志物下調(diào)、間質(zhì)標(biāo)志物上調(diào)、基底膜降解、細(xì)胞向間質(zhì)遷移［17］。大多數(shù)腫瘤的進(jìn)展往往伴隨著EMT 的發(fā)生，EMT 在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過程中起著至關(guān)重要的作用。多項(xiàng)研究表明，lncRNA 可以通過作用于EMT 對腫瘤的進(jìn)展產(chǎn)生影響［18-19］。本研究中蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，沉默LINC00342 可使ccRCC 細(xì)胞中波形蛋白和神經(jīng)鈣黏素表達(dá)下調(diào)、上皮鈣黏素表達(dá)上調(diào)。由此可以推斷，LINC00342 對ccRCC 進(jìn)展的影響可能與EMT 有關(guān)。

miRNA-384 是一種非編碼小RNA，研究表明其參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。miRNA-384 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡［20］。miRNA-384還可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖［21］。在ccRCC中，miRNA-384 可靶向RAS 癌基因家族成員RAB23 來抑制細(xì)胞的增殖和遷移［22］。本研究采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miRNA-384和LINC00342 之間的靶向關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miRNA-384是LINC00342 的下游靶分子之一，LINC00342 對ccRCC 細(xì)胞惡性表型的調(diào)節(jié)作用可能是通過靶向miRNA-384 而實(shí)現(xiàn)的。

本研究的不足之處有以下幾點(diǎn)。首先，本研究采集的組織樣本量較小，這可能使研究結(jié)論的可靠性下降；其次，由于條件有限，本研究沒有進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)；最后，本研究沒有就miRNA-384 發(fā)揮作用的下游機(jī)制進(jìn)行深入研究。

綜上所述，LINC00342 在ccRCC 組織中表達(dá)上調(diào)，且與不良的臨床病理學(xué)結(jié)果相關(guān)。LINC00342可以促進(jìn)ccRCC 細(xì)胞的惡性表型，miRNA-384 是LINC00342 的下游靶分子之一。