勞家鴻蔣騰洋劉光銳楊振德林億群李俊玨彭小團(tuán)鄭琳柯丁芷柔

(1.廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

桉樹為桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyputs)植物，是我國南方重要的速生豐產(chǎn)樹種之一，具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、易種植、培育周期短等優(yōu)點(diǎn)，在提高經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益方面發(fā)揮著重要作用[1]。然而調(diào)查顯示，桉樹種植區(qū)的生物多樣性下降，害蟲的種類和數(shù)量迅速上升[2]。桉樹枝癭姬小蜂(Leptocybe invasaFisher＆La Salle)是近年來危害桉樹的一種重要外來入侵害蟲，隸屬膜翅目(Hymenoptera)姬小蜂科(Eulophidae)，成蟲可在桉樹嫩枝、葉柄及葉脈等處產(chǎn)卵并形成大量蟲癭，嚴(yán)重影響桉樹生長發(fā)育。研究表明，桉樹枝癭姬小蜂的形態(tài)和生理指標(biāo)受溫度和寄主植物條件的顯著影響[3]，而桉樹能夠通過合成大量防御性次生代謝物和激活保護(hù)酶來抵御其持續(xù)危害[4－6]，因此，探討兩者間的互作機(jī)制，可為桉樹生產(chǎn)中有效防治該害蟲提供參考。

昆蟲體內(nèi)伴生細(xì)菌作為與昆蟲關(guān)系密切的微生物，在昆蟲生長發(fā)育及繁殖過程中發(fā)揮著重要作用，是害蟲防治中尚未開發(fā)的一類重要生物資源[7]。研究表明，桉樹枝癭姬小蜂伴生細(xì)菌可以降解桉樹體內(nèi)的某些防御物質(zhì)，有助于桉樹枝癭姬小蜂克服桉樹抗性[8]。目前已有學(xué)者從桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)分離出了17株不同的細(xì)菌菌株，分屬于厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)[9，10]。但尚未見關(guān)于這些伴生菌對(duì)桉樹生長發(fā)育和生理代謝影響的研究報(bào)道。組織培養(yǎng)是植物快繁的一種重要手段，可有效脫除植物所帶病毒，且具有成活率高、病蟲害少、節(jié)本高效等優(yōu)勢，被越來越廣泛地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中[11]。本研究以桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)兩株優(yōu)勢細(xì)菌的菌液單獨(dú)或混合噴灑桉樹組培苗，通過比較葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、葉綠素含量、光合和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的差異，初步分析這兩種細(xì)菌處理對(duì)桉樹生理代謝的影響，以期為闡明桉樹枝癭姬小蜂與寄主桉樹之間的互作關(guān)系及該害蟲的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試桉樹材料為巨園桉DH 201－2(E.grandis×E.tereticornis)的組培苗，高度為28.0～30.0 cm，地徑為0.4～0.5 cm，由廣西林業(yè)科學(xué)研究院提供。

供試細(xì)菌菌株為N14、E4，均由廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)分離保存，其中，前者被鑒定為腸桿菌屬(Enterobacter)，屬革蘭氏陰性菌，后者被鑒定為短小桿菌屬(Curtobacterium)，屬革蘭氏陽性菌。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理方法

試驗(yàn)于2021年10月在廣西大學(xué)林學(xué)教學(xué)實(shí)踐基地進(jìn)行。設(shè)4個(gè)處理:CK(對(duì)照)，噴灑10 mL清水；N14，僅噴灑10 mL稀釋的N14菌液；E4，僅噴灑10 mL稀釋的E4菌液；N14＋E4，兩種菌液各5 mL混合后噴灑。每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1盆。

處理方法:將用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的N14和E4菌株菌液調(diào)節(jié)吸光度到0.5，稀釋50倍，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，均勻地噴灑在桉樹葉上，每隔2天噴灑一次，各處理每次噴灑10 mL，共噴3次，每次噴灑后進(jìn)行套袋保濕處理。噴灑期間天氣晴好，3次噴灑結(jié)束后的7 d內(nèi)只對(duì)組培苗基部淋水并進(jìn)行常規(guī)管理，7 d后采集組培苗葉片用于各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

采用Li－6400便攜式光合分析儀測定光合作用參數(shù)；采用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)IMAGINGPAM(上海澤泉科技股份有限公司)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)；采用研磨－分光光度計(jì)法測定葉綠素(Chl)含量；酸性茚三酮法測定脯氨酸(PRO)含量，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量；采用蒽酮－硫酸法測定可溶性糖(SS)含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白(SP)含量[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表繪制，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和MDA含量的變化

與CK相比，N14處理使桉樹葉片中的SS、SP、PRO、MDA含量顯著增加；而E4處理除使PRO顯著增加外，其余指標(biāo)均降低，但僅SP降低顯著；N14＋E4處理除使PRO含量顯著增加外，其余指標(biāo)均與對(duì)照差異不顯著(圖1)。噴灑菌液處理間比較，N14處理的4種物質(zhì)含量均顯著高于E4處理；N14＋E4處理的4種物質(zhì)含量均介于N14和E4處理之間，其中，SP和SS含量與兩種單菌處理均差異顯著，PRO含量與E4處理差異顯著，MDA含量與N14處理差異顯著。

圖1 不同處理下桉樹葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和MDA含量變化

2.2 桉樹葉片中葉綠素含量的變化

葉綠素是主要的光合色素，其含量高低決定了植物光合階段對(duì)光能的捕獲能力，受環(huán)境、生物因子等多種因素影響。由圖2可知，E4處理下，桉樹葉片中的Chl a、Chl b、Chl a＋b含量及Chl a/b值最高，顯著高于其它處理；N14＋E4處理次之，除Chl b外均顯著高于N14處理，但與CK差異不顯著(Chl a除外)；N14處理的各指標(biāo)最低，除Chl b含量外，其它指標(biāo)均顯著低于CK(圖2)。

圖2 不同處理下桉樹葉片中葉綠素含量變化

2.3 桉樹葉片光合指標(biāo)的變化

由表1可知，與CK相比，E4處理的Pn和WUE顯著升高，Ci顯著下降，Gs、Tr略高于CK，差異不顯著；N14處理的Pn、Gs、Tr、WUE均顯著低于CK，而Ci顯著高于CK；N14＋E4處理的Pn、Tr顯著低于CK，Ci和WUE顯著高于CK，Gs與CK差異不顯著。三個(gè)噴灑菌液處理間，除Tr、WUE外，各指標(biāo)均差異顯著，且N14＋E4處理的各指標(biāo)值介于N14和E4處理間。

表1 不同處理下桉樹葉片的光合指標(biāo)

2.4 桉樹葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

由表2可以看出，E4處理的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)量(Yield)、非光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)(qN)和光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)(qP)、電子傳遞速率(ETR)最高，除Fv/Fm與CK差異不顯著外，均達(dá)差異顯著水平。N14處理的各指標(biāo)最低，且顯著低于CK。N14＋E4處理的Fv/Fm顯著低于CK，與N14處理差異不顯著；Yield、qN、qP與CK差異不顯著，但顯著高于N14處理；ETR顯著高于CK和N14處理(P<0.05)。

表2 不同處理下桉樹葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

2.5 桉樹生理特性的相關(guān)性分析

由表3可知，Chl a＋b與Chl a極顯著正相關(guān)，與Chl b和Chl a/b顯著正相關(guān)，說明桉樹葉片的葉綠素含量主要決定于Chl a含量；Chl a＋b與SS、SP、PRO、MDA均呈負(fù)相關(guān)，且與SS相關(guān)顯著，而與除Ci外的其它光合指標(biāo)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)均呈正相關(guān)，且與Pn、Fv/Fm和ETR相關(guān)極顯著。Chl a/b與qN、qP、Fv/Fm極顯著正相關(guān)，與Pn、ETR顯著正相關(guān)，而與SS極顯著負(fù)相關(guān)，與Ci顯著負(fù)相關(guān)。

表3 桉樹生理指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)

3 討論與結(jié)論

昆蟲體內(nèi)伴生著豐富的細(xì)菌、真菌等微生物，其中細(xì)菌可為宿主昆蟲提供營養(yǎng)物質(zhì)，合成昆蟲所必需的糖類、蛋白質(zhì)以及維生素等化合物，甚至可以協(xié)助宿主入侵[13－16]。本研究用分離自桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)的兩株優(yōu)勢菌(N14、E4)培養(yǎng)液單獨(dú)或混合噴灑桉樹組培葉片，以期通過分析葉片中葉綠素含量、光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等指標(biāo)的變化，初步探究桉樹枝癭姬小蜂與桉樹的互作機(jī)制。具體研究結(jié)果如下。

葉綠素具有吸收光能的作用，其含量與光合作用緊密相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，除Ci外，E4處理能提高桉樹組培苗葉片中的葉綠素含量和光合作用參數(shù)，而N14處理則使其降低。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)N14＋E4處理的各指標(biāo)值居于E4和N14處理之間，這與禹勝男等[18]的研究結(jié)論一致，表明混合細(xì)菌處理時(shí)細(xì)菌間存在一定的協(xié)同作用。

葉綠素a和葉綠素b在光合作用中發(fā)揮著不同的功能。本研究中，E4處理下葉綠素a和葉綠素b含量顯著提高，而N14對(duì)兩者尤其葉綠素a有明顯的降解作用，說明兩種優(yōu)勢細(xì)菌主要通過影響葉綠素a使葉綠素總含量改變。葉綠素a/b在CK和N14＋E4處理下值相當(dāng)，且高于陽生植物理論值(3.00)；在E4處理下值最高(4.27)，而在N14處理下值最低，且小于3.00，表明E4處理可大幅提高桉樹對(duì)光的捕獲能力，而N14處理則可通過降低葉綠素含量減少對(duì)光能的利用，保護(hù)光反應(yīng)中心免受過剩光能的傷害[19，20]。

氣體交換參數(shù)是反映植物光合能力的表觀性狀，其中光合速率可直接反映光合作用的強(qiáng)弱，受氣孔因素和非氣孔因素限制。一般來說，氣孔因素限制光合速率時(shí)，Gs和Ci同時(shí)降低；而非氣孔因素限制光合速率時(shí)，Gs升高或下降，Ci升高[21]。本研究結(jié)果表明，E4處理下，Pn、Gs、Tr均升高，Ci降低，而N14和N14＋E4處理下反之，說明這兩種優(yōu)勢細(xì)菌通過不同的調(diào)節(jié)方式影響植株的光合速率，其中E4主要通過增加PSⅡ潛在活性等提高光合效率，N14和混合細(xì)菌則主要通過非氣孔限制因素來降低光合速率。

葉綠素?zé)晒馐枪夂献饔玫奶结槪魏苇h(huán)境因子對(duì)光合作用的影響都可以通過葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)快速、靈敏且無損地反映出來[22]。本研究中，桉樹葉片的Fv/Fm、Yield、qN、qP、ETR在N14處理下均顯著降低，接近PSⅡ受損臨界值[23]，說明PSⅡ潛在活性受到明顯抑制[24]；而E4處理下Yield、qN、qP、ETR提高顯著，F(xiàn)v/Fm略有提高，表現(xiàn)出對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心活性的明顯促進(jìn)作用。表明兩種細(xì)菌在對(duì)PSⅡ光反應(yīng)活性的影響上起著相反的作用，因此，兩者混合處理的效果介于單獨(dú)應(yīng)用時(shí)。

PRO、SS、SP是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量增加可以提高植物細(xì)胞液的滲透壓，增強(qiáng)細(xì)胞的吸收保水能力，同時(shí)抑制細(xì)胞膜脂過氧化，降低膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，維護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定性，是植物抵御環(huán)境變化的重要生理調(diào)節(jié)機(jī)制[25－27]。本研究中，N14處理下桉樹葉片中的PRO、SS、SP、MDA含量顯著增加；E4處理下SS、SP、MDA含量降低，PRO含量增加；N14＋E4處理下PRO、SS、SP含量升高，MDA含量略有降低。表明不同菌處理對(duì)桉樹葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累的影響不同，PRO可能是桉樹應(yīng)對(duì)細(xì)菌侵染的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。另外，N14處理的葉片中SS大量積累可能為桉樹枝癭姬小蜂提供營養(yǎng)物質(zhì)，利于其近一步侵害桉樹[28，29]；而E4處理下SS下降可能是桉樹葉片發(fā)生防御反應(yīng)的結(jié)果[29]。

Weidner等研究發(fā)現(xiàn)，單細(xì)菌和混合細(xì)菌處理對(duì)植物產(chǎn)生的效應(yīng)往往不同，尤其是生態(tài)位互補(bǔ)型菌株的混合處理可以提高其對(duì)植物的正向選擇[30]。本研究結(jié)果也表明，混合菌株(N14＋E4)處理對(duì)桉樹組培苗各項(xiàng)生理指標(biāo)的作用效果介于兩個(gè)單菌處理之間，傾向于正向作用。

綜上所述，桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)兩種優(yōu)勢細(xì)菌對(duì)桉樹組培苗葉片的生理代謝和光合熒光參數(shù)均產(chǎn)生了明顯影響，E4菌株以正向作用為主，N14菌株以負(fù)向作用為主，N14與E4混合處理的作用效果介于二者之間，傾向于正向作用。這可為進(jìn)一步研究桉樹枝癭姬小蜂與桉樹間的侵害－防御機(jī)制及生物防治桉樹枝癭姬小蜂提供參考。