崔杰，王翠翠，劉永光，趙紅，張德珍，遲文娟，楊園園

(1.濰坊科技學(xué)院/山東省設(shè)施園藝生物工程研究中心/山東省高校設(shè)施園藝實(shí)驗(yàn)室，山東 壽光 262700；2.青島市黃島區(qū)自然資源局，山東 青島 266555)

番茄灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的一種世界性病害，主要危害葉片和果實(shí)，造成發(fā)病部位腐爛[1]，已成為我國(guó)溫室番茄生產(chǎn)中高發(fā)病害之一[2]?；移咸焰呦驳蜏?、高濕條件，不僅在番茄生長(zhǎng)期為害，在番茄儲(chǔ)藏期及運(yùn)輸期均能侵染果實(shí)，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)60%[3]。因此，灰霉病已成為限制我國(guó)番茄安全生產(chǎn)的重要因素。

目前防治番茄灰霉病的主要方法為化學(xué)防治，然而由于灰霉病菌繁殖快、變異度大等使得該病菌對(duì)化學(xué)藥劑極易產(chǎn)生抗藥性[1]。對(duì)于采后果實(shí)來(lái)說(shuō)，生物防治在抑制病原菌生長(zhǎng)的同時(shí)能夠保證食品的安全性，且對(duì)環(huán)境友好，因此以有效微生物取代化學(xué)殺菌劑用于果蔬采后病害的防治具有廣闊的應(yīng)用前景。芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)因其穩(wěn)定性好、定殖率高以及防治效果好等優(yōu)點(diǎn)，已被開(kāi)發(fā)成生物殺菌劑。楊利敏等[4]測(cè)定出一株枯草芽孢桿菌的發(fā)酵濾液在離體葉片上對(duì)番茄灰霉的防治效果可達(dá)100%；Bu等[5]篩選的一株枯草芽孢桿菌L1－21對(duì)番茄果實(shí)灰霉病防效達(dá)86.57%；潘曉梅等[6]從土壤中篩選到一株蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其對(duì)灰霉病菌的菌絲抑制率達(dá)66.35%；童蘊(yùn)慧等[7]分離獲得的拮抗性強(qiáng)、抗菌譜廣的地衣芽孢桿菌對(duì)番茄葉片和果實(shí)灰霉病的防效為70%～80%，優(yōu)于50%速克靈2000倍液。目前針對(duì)番茄灰霉病生防菌的研究集中于平板對(duì)峙效果或?qū)θ~片病情的控制，而采后控制效果鮮有報(bào)道。因此，本研究從番茄根際土壤中獲得一株對(duì)番茄灰霉病具有良好防效，且具有廣譜真菌抗性的芽孢桿菌，并測(cè)定了其對(duì)采后番茄灰霉病抑制效果，為豐富生物防治番茄灰霉病抑病資源、開(kāi)發(fā)新型農(nóng)用殺菌劑提供了材料。

1 材料與方法

1.1 供試病原真菌與培養(yǎng)基

供試菌株:番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)、番茄灰葉斑病菌(Stemphylium lycopersici)、黃瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、番茄黑斑病菌(Alternaria alternata)、黃瓜黑斑病菌(Alternaria cucumerina)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum siamense)、蘋果褐斑病菌(Marssonina mali)，均由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存。蘋果炭疽葉枯病菌(Glomerella cingulata)和蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria dothidea)由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院李保華教授惠贈(zèng)；番茄早疫病菌(Alternaria solani)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院吳學(xué)宏教授惠贈(zèng)。所有菌株均經(jīng)過(guò)單孢或單菌絲分離后保存。

供試培養(yǎng)基:拮抗細(xì)菌的分離和培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L，pH值自然)；病原菌的培養(yǎng)以及對(duì)峙培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L，pH值自然)。所有培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.2 番茄灰霉病拮抗細(xì)菌的分離方法

于2021年4月1日在山東省壽光地區(qū)番茄溫室采集根際土壤樣品，取10 g放入盛有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中于28℃、180 r/min振蕩30 min，使之充分混勻，然后置于80℃水浴處理10 min。用無(wú)菌水將其稀釋成10－1、10－2、10－3和10－4倍的土壤懸浮液，每個(gè)濃度吸取100 μL涂布于LB平板上，每個(gè)梯度重復(fù)3次。將平板倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)48 h。挑取形態(tài)不同的細(xì)菌單菌落在LB固體平板上劃線，獲得純化細(xì)菌菌株。

1.3 番茄灰霉病拮抗細(xì)菌初篩

將番茄灰霉病菌于25℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水沖洗菌落，使用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)至1×107個(gè)/mL。取500 μL孢子懸液加入100 mL融化冷卻至45℃左右的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，制成含病原菌的瓊脂平板。在病原菌平板上用十字劃線法接入待檢測(cè)細(xì)菌菌株，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。挑選出對(duì)番茄灰霉病菌有明顯拮抗作用的細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩。

1.4 番茄灰霉病拮抗細(xì)菌復(fù)篩

采用平板對(duì)峙法進(jìn)行拮抗細(xì)菌的復(fù)篩。于對(duì)峙培養(yǎng)前3 d活化番茄灰霉病菌，同時(shí)挑取一環(huán)初篩有抑制效果的拮抗細(xì)菌加入到100 mL液體LB培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，制備種子液。取100 μL種子液加入100 mL LB培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)48 h。對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)，在PDA平板中央接種直徑6 mm的番茄灰霉病菌菌餅，四周等距離2.5 cm處接種5 μL待測(cè)細(xì)菌菌液，以5 μL無(wú)菌水作為空白對(duì)照。置于25℃黑暗培養(yǎng)，3 d后統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌液對(duì)番茄灰霉病病原菌的抑制率。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)平板，試驗(yàn)重復(fù)3次。

抑制率(%)＝(對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑－菌餅直徑)×100。

1.5 生防細(xì)菌SG－11的抑菌譜測(cè)定

于對(duì)峙培養(yǎng)前3～5 d將番茄枯萎病菌、番茄灰葉斑病菌、黃瓜靶斑病菌、黃瓜黑斑病菌、番茄黑斑病菌、番茄早疫病菌、草莓炭疽病菌、蘋果褐斑病菌、蘋果炭疽葉枯病菌和蘋果輪紋病菌共10種常見(jiàn)植物病原菌進(jìn)行活化。將直徑6 mm菌餅置于PDA平板中央，距其2.5 cm處四個(gè)點(diǎn)滴加5 μL拮抗菌SG－11菌液，以無(wú)菌水為對(duì)照，25℃培養(yǎng)3～5 d后計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 拮抗細(xì)菌SG－11對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制效果

參考1.4獲得拮抗細(xì)菌SG－11的種子液，取100 μL種子液加入100 mL LB培養(yǎng)基中28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，用LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)液分別稀釋5、10、20、40倍，平板中央放置直徑為6 mm的灰霉菌餅。以無(wú)菌水為空白對(duì)照，50%腐霉利1500倍液為陽(yáng)性對(duì)照。25℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，計(jì)算抑制率。

將SG－11菌液調(diào)整濃度為1×109cfu/mL，于12000 r/min離心15 min，使用細(xì)菌過(guò)濾器將上清液過(guò)濾，上清濾液用無(wú)菌水稀釋5、10、20、40倍，分別取10 μL與濃度為1×105個(gè)/mL的番茄灰霉病菌孢子懸浮液(用1%葡萄糖溶液配制)等體積混合，滴到載玻片中央，于100%相對(duì)濕度下25℃培養(yǎng)10 h。無(wú)菌水與分生孢子的混合液為空白對(duì)照。滴加0.1%曲利苯藍(lán)乳酚油終止萌發(fā)，檢查孢子萌發(fā)率，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)玻片檢測(cè)200個(gè)孢子，試驗(yàn)重復(fù)3次。孢子萌發(fā)率(%)＝孢子萌發(fā)數(shù)量/孢子總量×100；孢子萌發(fā)抑制率(%)＝(1－處理孢子萌發(fā)率)/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100。

1.7 拮抗細(xì)菌SG－11的分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌通用引物27F/1492R和up－1/up－2r分別擴(kuò)增16S rDNA和gyrB基因片段[8]，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的基因序列與GenBank中已知的核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并選取近緣種序列用MEGA 7軟件中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.8 菌株SG－11對(duì)離體番茄果實(shí)灰霉病的抑制作用

從壽光番茄溫室中采集處于青熟期的“貝貝”櫻桃番茄果實(shí)，選取成熟度、果型、大小一致的果實(shí)用于接種試驗(yàn)。經(jīng)75%乙醇果面消毒后，用無(wú)菌釘在果實(shí)赤道處打孔(直徑2 mm，深度2 mm)，每個(gè)果實(shí)一個(gè)孔口。待傷口晾干后，向其加入10 mL不同稀釋倍數(shù)的SG－11上清濾液(同1.6)，以無(wú)菌水處理為空白對(duì)照，50%腐霉利1500倍液為陽(yáng)性對(duì)照。于22℃恒溫保濕處理48 h后，每傷口接種10 μL濃度為1×105個(gè)/mL的灰霉病菌孢子懸浮液。將接種后的番茄果實(shí)置于22℃、相對(duì)濕度為90%左右的密封盒中，每24 h觀察發(fā)病率與病斑擴(kuò)展情況，測(cè)量病斑直徑，計(jì)算防效。防效(%)＝(對(duì)照組病斑面積－處理組病斑面積)/對(duì)照組病斑面積×100。每個(gè)處理接種30個(gè)番茄，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄灰霉病拮抗細(xì)菌菌株的篩選

從供試土壤樣品中共獲得28株細(xì)菌，經(jīng)初篩與復(fù)篩后確定4株細(xì)菌對(duì)番茄灰霉病菌有較為穩(wěn)定的拮抗效果。在對(duì)峙培養(yǎng)中，4株細(xì)菌對(duì)番茄灰霉病菌的菌絲具有明顯的抑制作用，靠近細(xì)菌的一側(cè)菌絲生長(zhǎng)速度減緩或停止。4個(gè)菌株中SG－11對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率為79.81%(圖1)。

圖1 拮抗細(xì)菌對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

2.2 菌株SG－11對(duì)10種病原真菌的抑制作用

菌株SG－11對(duì)供試10種病原菌有不同程度的抑制作用，抑制率范圍為49.07%～78.02%，具有抑菌廣譜性。其中，對(duì)蘋果輪紋病菌、蘋果炭疽葉枯病菌和草莓炭疽病菌的抑制率均在70%以上，顯著高于其他供試病原菌(表1)。

表1 拮抗細(xì)菌菌株SG－11對(duì)10種病原真菌的抑制作用

2.3 生防菌SG－11對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)的影響

2.3.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 生防菌株SG－11對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率隨菌液稀釋倍數(shù)的增加而顯著降低，SG－11原液對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率高達(dá)92.44%，顯著優(yōu)于50%腐霉利1500倍液(表2)；稀釋5倍對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率為87.00%，與50%腐霉利1500倍液沒(méi)有顯著差異；稀釋40倍時(shí)防效降低為26.45%。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組菌絲直立、粗細(xì)均勻，頂端分枝較少(圖2A)；加入SG－11后菌絲生長(zhǎng)受到抑制，且發(fā)育異常，菌絲扭曲、分枝多(圖2B)，有細(xì)胞質(zhì)外滲現(xiàn)象(圖2C)。

2.3.2 對(duì)孢子萌發(fā)的影響 菌株SG－11濾液對(duì)番茄灰霉病菌分生孢子的萌發(fā)有明顯的抑制作用，可顯著降低其萌發(fā)率(表2)。正常生長(zhǎng)的灰霉菌分生孢子萌發(fā)后菌絲生長(zhǎng)較快，且粗細(xì)均勻(圖2D)，而經(jīng)SG－11濾液處理的分生孢子萌發(fā)較慢，芽管分枝較多(圖2E)，萌發(fā)率隨著濾液濃度升高而降低，但稀釋40倍時(shí)對(duì)孢子萌發(fā)抑制率仍高達(dá)30.73%。稀釋10倍時(shí)其對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率仍優(yōu)于50%腐霉利1500倍液(表2)。

表2 菌株SG－11培養(yǎng)液對(duì)孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖2 菌株SG－11對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

2.4 拮抗菌株SG－11的分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)16S rDNA與gyrB基因測(cè)序分別獲得1064 bp和1053 bp長(zhǎng)度的序列，經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)的序列相似性最高，分別為98.41%與98.77%。采用MEGA 7最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果(圖3)表明，16S rDNA與gyrB基因序列聚類中，菌株SG－11均與B.velezensis聚為一支，因此將拮抗菌株SG－11鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 基于16S rDNA(A)與gyrB基因(B)構(gòu)建的 菌株SG－11系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 菌株SG－11對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的防治效果

處理番茄果實(shí)3 d后，調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同稀釋倍數(shù)的濾液均對(duì)番茄果實(shí)灰霉病有顯著防效，病斑直徑小于無(wú)菌水處理(圖4)。使用SG－11濾液原液、稀釋5倍與10倍的濾液處理番茄果實(shí)后防效均高于80%。隨著濾液濃度的降低，其對(duì)番茄灰霉病的防效也逐步減弱，稀釋40倍時(shí)防效僅為30.0%，低于50%腐霉利1500倍液(圖4)。

圖4 生防菌株SG－11對(duì)番茄果實(shí) 灰霉病的防治效果

3 討論與結(jié)論

本研究從番茄溫室土壤中篩選到一株對(duì)番茄灰霉病有較好拮抗效果的細(xì)菌SG－11，經(jīng)16S rDNA與gyrB序列分析，將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。芽孢桿菌抗逆性強(qiáng)、在植物表面有較好的定殖能力，且防治效果好、穩(wěn)定性高，已廣泛應(yīng)用于多種植物病害的生物防治中。據(jù)報(bào)道，特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)在室內(nèi)和盆栽試驗(yàn)中均對(duì)黃芪根腐病表現(xiàn)出較好的防效[9]；番茄內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌ZSY－1可在根部和葉部組織定殖，且對(duì)番茄植株灰霉病防效高于80%[10]。貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌親緣關(guān)系較近，近年來(lái)已用于防治桃褐腐病、菜豆菌核病[10]、番茄青枯病和黃瓜棒孢葉斑病[11]等幾十種植物病害。本研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌株SG－11的抑菌譜非常廣，對(duì)蘋果輪紋病菌、草莓炭疽病菌和蘋果炭疽葉枯病菌有非常強(qiáng)的抑制作用，防治效果均高于70%，表明該菌株具有成為新型生防微生物農(nóng)藥的潛力。

番茄采后病害常導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)番茄進(jìn)入儲(chǔ)藏期后，灰霉病發(fā)生率高達(dá)40%[12]，然而儲(chǔ)藏期果實(shí)不宜采用化學(xué)農(nóng)藥防控，因此生物防治成為果蔬采后病害防治的重要途徑。已有研究表明貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)浸泡采后番茄果實(shí)對(duì)早疫病具有良好的防效[13]，羅倫隱球酵母菌(Cryptococcus laurentii)懸浮液浸泡櫻桃番茄10 min后對(duì)灰霉病的防效達(dá)59.1%[14]。然而目前關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌控制番茄采后灰霉病的研究較少，本研究中菌株SG－11濾液稀釋10倍后對(duì)灰霉病的防效仍高于80%，表明SG－11對(duì)番茄果實(shí)灰霉病具有較好的防效。

拮抗細(xì)菌對(duì)病原菌的作用方式主要是抑制真菌分生孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)以及導(dǎo)致病原菌菌絲畸形如頂端膨大、分支增多、細(xì)胞質(zhì)外滲等[15]，這在本研究中也得到了證實(shí)。SG－11對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)等具有顯著的抑制作用，表明該菌株在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了抑菌物質(zhì)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)拮抗細(xì)菌或真菌能產(chǎn)生醇類和酮類等有機(jī)揮發(fā)物(VOCs)，也可能通過(guò)分泌脂肪類、酯類、酚類和肽類等物質(zhì)來(lái)抑制病原菌生長(zhǎng)[16－18]，但有關(guān)菌株SG－11抗菌活性物質(zhì)尚不明確，還需進(jìn)一步提取和鑒定。另外，生防菌除自身分泌抗菌物質(zhì)外，還能提高植物防御酶活性[14，19，20]。因此，為進(jìn)一步明確其抑菌機(jī)理有必要開(kāi)展SG－11在番茄果實(shí)上定殖以及對(duì)番茄防御酶活性方面的研究，為該菌株活體制劑研發(fā)提供依據(jù)。