王宇，王輝，朱文瑩，李文麗，王富

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東 青島 266109)

番茄(Solanum lycopersicumL)是世界上最重要的蔬菜作物之一。許多病原體能夠引起番茄病害，并阻礙其生產(chǎn)。由于缺乏有效的控制措施，病毒病成為許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的主要限制因素[1]。

番茄褪綠病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)隸屬長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Criniviru)，最早于20世紀(jì)90年代中期在美國發(fā)現(xiàn)[2]。ToCV不能通過種子、汁液摩擦、機(jī)械摩擦傳播，只能通過煙粉虱以半持久性方式傳播[3]。ToCV侵染番茄植株后潛伏期較長，通常在感染后3～4周才引起癥狀[4]。感染ToCV的植株一般從中下部葉片出現(xiàn)癥狀并逐漸向上發(fā)展，中部葉片表現(xiàn)為葉脈間輕微褪綠黃化，底部葉片則出現(xiàn)明顯的褪綠黃化，葉脈深綠，感病葉片變脆且易折，葉片黃化疑似營養(yǎng)缺素癥[5]。盡管該病毒在果實(shí)上沒有明顯的癥狀，但由于光合面積的損失，產(chǎn)量顯著降低[6]。

水楊酸(salicylic acid，SA)是一種化學(xué)誘導(dǎo)因子，也是系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的信號(hào)分子，在植物中作為導(dǎo)致SAR誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組成部分發(fā)揮作用，并在抵抗包括真菌、細(xì)菌和病毒在內(nèi)的所有微生物病原體方面也發(fā)揮作用[7]。SA因具有高效、無毒、對(duì)環(huán)境無害、使用方法簡單和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而成為一種新型的抗病性誘導(dǎo)劑[8]。外源SA處理可以誘導(dǎo)黃瓜、辣椒、番茄等多種植物產(chǎn)生局部和系統(tǒng)抗性[9－14]。然而，SA對(duì)番茄褪綠病毒病危害是否有緩解作用，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究以番茄褪綠病毒病易感品種‘Moneymaker’為試驗(yàn)材料，對(duì)番茄幼苗葉片噴施SA和接種ToCV處理，并對(duì)接種4周內(nèi)各處理番茄植株病情指數(shù)、帶毒量、抗氧化酶活性、抗逆應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量及光合參數(shù)等進(jìn)行檢測，進(jìn)而探明SA對(duì)番茄褪綠病毒病的抑制作用，從而為該病害的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與生長條件

供試材料:易感番茄褪綠病毒病番茄品種‘Moneymaker’。

植物生長條件:選擇飽滿種子置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上，28℃人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠生產(chǎn))黑暗催芽3 d。出芽后播種于育苗穴盤，人工氣候室中(光/暗:2h/12h；溫度:25℃/16℃；濕度設(shè)置為75%)培養(yǎng)至4片真葉并移栽于直徑10 cm的花盆中。

1.2 水楊酸處理和番茄褪綠病毒接種

水楊酸處理方法:用無菌水配置2 mmol/L SA水溶液，當(dāng)番茄生長至5～6片真葉時(shí)平均分成兩份，其中一份噴施2 mmol/L SA水溶液至葉面均勻分布，另一份噴施等體積的無菌水，每隔1 d噴施1次，共噴施3次，之后進(jìn)行病毒接種。

病毒接種方法:取飼養(yǎng)的健康煙粉虱用帶ToCV的番茄葉片喂養(yǎng)48 h以獲得攜帶ToCV的煙粉虱，經(jīng)隨機(jī)取樣檢測確認(rèn)帶毒后，用微蟲籠轉(zhuǎn)移帶毒煙粉虱至噴施完SA或無菌水的番茄植株第4片真葉上，每株番茄接種25頭，取食48 h后移除煙粉虱。噴施無菌水和SA的番茄幼苗各隨機(jī)取一半植株進(jìn)行帶毒煙粉虱接種處理。共設(shè)置噴施無菌水(W)、噴施無菌水后接種病毒(W＋ToCV)、噴施水楊酸(SA)和噴施水楊酸后接種病毒(SA＋ToCV)4個(gè)處理。每個(gè)處理25～30株番茄植株，重復(fù)3次。分別于移除煙粉虱后7、14、21、28 d取相同部位番茄葉片，立即冷凍在液氮中，－80℃保存。

1.3 病情指數(shù)計(jì)算

番茄褪綠病毒病的分級(jí)方法如下。其中，0級(jí):番茄植株沒有癥狀；1級(jí):番茄植株下部僅有部分葉片出現(xiàn)葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；2級(jí):植株從下部開始有一半葉片出現(xiàn)葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；3級(jí):植株大面積葉片出現(xiàn)葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；4級(jí):植株整株出現(xiàn)癥狀，褪綠黃化非常嚴(yán)重，基本沒有健康組織。病情指數(shù)(DI)計(jì)算公式如下:

病情指數(shù)＝∑(各級(jí)發(fā)病植株數(shù)×各級(jí)別代表值)/(調(diào)查總植株數(shù)×最高級(jí)別代表值)×100 。

1.4 番茄樣品ToCV病毒量及應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量檢測

葉片總RNA的提取采用艾科瑞生物公司的SteadyPure植物RNA提取試劑盒進(jìn)行。cDNA的合成采用Vazyme公司的HiScript III All－in－one RT SuperMix Perfect for qPCR試劑盒進(jìn)行。參照丁天波等[15]的方法，通過qRT－PCR進(jìn)行病毒檢測，所用引物ToCVqF:5′－CTTTCTGGATGGTTTGCGGC－3′；ToCVqR:5′－TCCCCAACCAATGGTCGTTT－3′。根據(jù)擴(kuò)增曲線、熔解曲線和Ct值確定其帶毒情況，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒感染量。

熒光定量所用引物如表1所示，以α－tubulin內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化處理，基因相對(duì)表達(dá)量按照2－△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。熒光定量反應(yīng)體系(20 μL):cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，TB GreenPremix Ex TaqⅡ10 μL，ddH2O 6 μL。LightCycler 480熒光定量儀程序:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

表1 用于qRT－PCR的引物序列

1.5 抗氧化酶活性檢測

粗酶液的提取:稱取0.1 g番茄葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，8000 r/min、4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性分別采用對(duì)應(yīng)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)進(jìn)行，測定波長分別為560、470、240 nm。

1.6 光合生理指標(biāo)測定

使用便攜式光合測定儀(CIRAS－3型，美國PP Systems)，在同一時(shí)間測定植株節(jié)位一致的完全展開葉片的凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)。每片葉重復(fù)3次取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016進(jìn)行處理，DPS進(jìn)行方差分析，GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸處理對(duì)接種ToCV番茄幼苗病情指數(shù)及帶毒量的影響

接種病毒后7 d，W＋ToCV和SA＋ToCV處理均無植株出現(xiàn)褪綠癥狀；隨著接種時(shí)間的延長，W＋ToCV和SA＋ToCV處理植株的病情指數(shù)逐漸增加(圖1)，分別由接種后14 d的22.5%和7.5%增加到28 d的50.0%和37.5%，且兩處理間均差異顯著；接種后28 d，W和SA處理番茄植株葉色較為濃綠，且均正常坐果，而W＋ToCV和SA＋ToCV處理葉色褪綠較為明顯，并且W＋ToCV處理植株坐果受到較大影響，但SA＋ToCV處理褪綠癥狀較W＋ToCV處理有所緩解(圖2)。說明SA處理顯著減輕了番茄褪綠病毒的危害。

圖1 W＋ToCV和SA＋ToCV處理植株的病情指數(shù)

圖2 處理28 d后番茄植株的表型

由圖3可知，番茄葉片帶毒量隨接種天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，接種后14 d與接種后7 d相比增幅較小，接種后21 d增幅較大，特別是接種后28 d帶毒量與接種后21 d相比高10～20倍。兩處理在接種后7、14、21、28 d帶毒量均存在顯著差異，說明SA處理顯著降低了接種ToCV后番茄植株的帶毒量。

圖3 W＋ToCV和SA＋ToCV處理番茄植株中ToCV病毒含量

2.2 水楊酸處理對(duì)接種ToCV后番茄葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

抗氧化酶活性檢測結(jié)果(圖4)顯示，在接種病毒后7～21 d，各處理SOD活性均呈先下降后上升的趨勢(shì)，其中W＋ToCV和SA＋ToCV處理增幅較大，且W＋ToCV增幅較SA＋ToCV更大。各處理植株葉片的POD活性整體呈上升趨勢(shì)，除W處理外的各處理POD活性在接種病毒后21 d時(shí)最高。隨著接種時(shí)間的延長，各處理番茄植株葉片CAT活性呈逐漸下降趨勢(shì)。

圖4 各處理下番茄葉片抗氧化酶活性

2.3 水楊酸處理對(duì)接種ToCV后番茄葉片中應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖5可知，W＋ToCV和SA＋ToCV處理Sl-PR1和SlPR2基因的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，且均于接種病毒后14 d達(dá)到最大值。除第14 d，SA＋ToCV處理植株葉片中SlPR1轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于W＋ToCV處理。W＋ToCV處理中SlPR5的表達(dá)模式與SlPR1和SlPR2的表達(dá)模式較為相似，但是表達(dá)量峰值延遲到接種病毒后21 d出現(xiàn)。

接種病毒后7 d，SA和SA＋ToCV處理番茄植株葉片中SlSOD、SlPOD及SlCAT2均被顯著誘導(dǎo)(圖5)，同時(shí)，W＋ToCV處理也顯著誘導(dǎo)了SlSOD的表達(dá)。接種病毒后14 d，SA處理中SlPOD和SlCAT2相對(duì)表達(dá)量較高，SA＋ToCV處理中SlSOD和SlPOD的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他處理。接種病毒后28 d，各處理間SlSOD、SlPOD及SlCAT2的相對(duì)表達(dá)量均無顯著差異。

圖5 各處理番茄葉片中抗逆應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)

2.4 水楊酸處理對(duì)接種ToCV后番茄葉片葉綠素含量及光合作用的影響

接種病毒后28 d，W、SA和SA＋ToCV處理葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均顯著高于W＋ToCV處理，且W、SA和SA＋ToCV三處理葉綠素含量差異不顯著(表2)。光合生理指標(biāo)測定結(jié)果顯示，W＋ToCV和SA＋ToCV處理的番茄植株葉片凈光合速率(Pn)差異不顯著，但均顯著低于W和SA處理，且SA處理顯著低于W處理。W＋ToCV處理番茄植株葉片蒸騰速率(Gs)顯著低于W處理，但與SA和SA＋ToCV間均無顯著差異。各處理胞間CO2濃度(Ci)無顯著差異。

表2 水楊酸處理對(duì)接種病毒后番茄植株葉片葉綠素含量及光合生理指標(biāo)的影響

3 討論與結(jié)論

SA不僅能使植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)和過敏反應(yīng)(HR)，而且在病原體侵染植物后，還能活化一系列防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)傳遞過程中的重要成分[16]。在本研究中，外源SA顯著降低了接種ToCV后番茄植株的病情指數(shù)和葉片中的帶毒量，并且顯著減輕了番茄褪綠病毒的危害。SA處理的植物中疾病發(fā)生率較低的原因可能是由于SA在宿主－病毒相互作用中起著關(guān)鍵作用。有研究表明，SA處理增強(qiáng)了植物的抗病毒能力或由于SAR延遲了疾病癥狀的出現(xiàn)[17，18]。Bayram ?evik等[19]研究認(rèn)為，大部分ToCV抑制基因與代謝、光合作用、防御和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，ToCV感染直接減慢新陳代謝，對(duì)光合作用和植物防御產(chǎn)生不利影響。番茄植株感染ToCV后，葉片褪綠變黃，影響光合作用。本研究通過測定光合生理指標(biāo)和葉片葉綠素含量證實(shí)ToCV顯著降低葉片葉綠素含量和凈光合速率，而SA處理后減輕ToCV對(duì)番茄葉綠素的破壞，也提高光合速率和蒸騰速率。

病毒感染促進(jìn)細(xì)胞代謝，增加ROS的產(chǎn)生，從而破壞細(xì)胞室。在感染早期，H2O2含量的增加伴隨著抗氧化劑活性的降低，從而限制了病原體的生長和傳播，然后經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(PCD)的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生激活相鄰細(xì)胞防御反應(yīng)的信號(hào)。其中SA及其衍生物就是參與植物防御反應(yīng)放大的信號(hào)分子[20]。在NahG轉(zhuǎn)基因植物中，SA降解酶水楊酸羥化酶可降低SA的產(chǎn)生，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物更易受到病原微生物侵染[21]。SOD是第一個(gè)參與清除ROS過程的抗氧化酶，其主要作用是將超氧離子快速歧化為H2O2和分子氧。POD可通過催化與H2O2相關(guān)的各種氧化還原反應(yīng)生成H2O，從而降低植物內(nèi)部的氧化狀態(tài)[22]。外源噴施SA后，植物體內(nèi)的SA水平提高，SA與SA受體蛋白結(jié)合，抑制POD的活性以及自由基的產(chǎn)生，激活POD的合成及其他防衛(wèi)反應(yīng)[23]。在番茄受到番茄黃化曲葉病毒侵染后，SOD活性和POD活性均有所提高[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種ToCV處理后CAT活性下降，而POD活性逐漸升高。這表明番茄清除H2O2可能與POD活性的增加有關(guān)，而CAT活性的降低導(dǎo)致作為局部獲得性抗性(LAR)中的第二信使的H2O2含量增加[24]。

PRs的誘導(dǎo)被認(rèn)為是抗性誘導(dǎo)的一個(gè)標(biāo)志[25]。PRs是植物中具有潛在抗性的化合物，可以抵抗病原菌的入侵[26]。本研究表明，W＋ToCV和SA＋ToCV處理均能誘導(dǎo)SlPR1、SlPR2和Sl-PR5的表達(dá)。此外，本試驗(yàn)還研究了ToCV和SA處理下活性氧清除酶基因的表達(dá)模式，ToCV和SA處理均誘導(dǎo)SlSOD、SlPOD和SlCAT2的表達(dá)，該結(jié)果與Li等[14]在研究SA誘導(dǎo)番茄抵御番茄黃化曲葉病毒抗性研究中的結(jié)果較為類似。前人研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控番茄防御反應(yīng)可能是通過調(diào)控ROS清除酶和PRs基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，從而調(diào)控ROS和SA信號(hào)通路[27]。本研究結(jié)果也表明可能通過類似途徑增強(qiáng)了外源水楊酸處理對(duì)番茄褪綠病毒的抗性。