蔣家璇，韓盼盼，孔振楊，程陸陸，姚沛琳

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州 234000）

0 引言

食用植物酵素是以新鮮蔬菜、水果、藥食兩用本草類為原料，由多種微生物經過較長時間發(fā)酵得到的功能性發(fā)酵產品[1]。據(jù)報道，食用植物酵素可以有效清除體內過多的活性氧自由基，當自由基積累過多時，會對機體內的蛋白質、核酸等造成損傷，從而引發(fā)細胞的結構被破壞，甚至引發(fā)細胞突變[2]。在預防和治療因自由基誘發(fā)的疾病和抗衰老方面具有廣闊的應用前景[3-4]。

百香果分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，是一種重要的藥食同源類植物，常作為民間傳統(tǒng)藥材使用[5-6]。百香果中含有的酚類化合物種類和含量較多，如黃酮類、黃酮醇類及酚類、酸類等[7]。百香果由于具有良好的風味特征，已在飲料加工中廣泛使用，受到廣大消費者的喜愛。但是，目前對于百香果的加工依然是初級加工模式，制作成百香果風味飲料或果干，因此可以借助酵素這種高營養(yǎng)價值的產品，增加百香果的附加價值，實現(xiàn)百香果產業(yè)的轉型升級[8]。

目前，食用植物酵素品類繁多，發(fā)酵周期長，品質差別較大，而且缺少相關科學支撐。因此，亟需對食用植物酵素發(fā)酵過程中的重要的代謝產物變化和功能特性進行深入研究[9-10]。以百香果為原料，采用自然發(fā)酵方法制備百香果酵素，探究發(fā)酵過程中總糖、總酸、總酚等活性成分的變化規(guī)律，并以DPPH、羥基和ABTS 自由基清除率及還原力為指標，研究體外抗氧化活性的變化規(guī)律，為百香果酵素的精準發(fā)酵控制提供科學依據(jù)和理論基礎，用標準化手段規(guī)范傳統(tǒng)工藝，縮短發(fā)酵周期，保證酵素品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮百香果、單晶冰糖，購自宿州大潤發(fā)超市。

1.1.2 主要試劑

氫氧化鈉、酚酞、蒽酮、濃硫酸、沒食子酸、福林酚（10%）、碳酸鈉、無水乙醇、抗壞血酸、過氧化氫、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，國藥集團提供；標準葡萄糖溶液、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼、ABTS 自由基清除能力檢測試劑盒，上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

SHP-400FE 型生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學儀器有限公司產品；Multiskan Go 酶標儀，美國Thermo公司產品；1-1SPK 小型臺式冷凍離心機（Sigma）、pH 計（希瑪儀表）、BSA124S 型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產品；JRA-6 型數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產品；SW-CJ-1CU 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；GI100T 型滅菌鍋，致微儀器有限公司產品；玻璃發(fā)酵罐（居元素）。

1.3 試驗方法

1.3.1 百香果酵素的制備

用超純水清洗百香果表面雜質，自然瀝干水分，將試驗器材進行滅菌，百香果與糖質量比為1∶1，混勻密封，避光室溫發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，每天同一時間進行放氣15 min、攪拌，觀察發(fā)酵情況。在發(fā)酵的第0 天，第10 天，第20 天，第30 天，第40 天，第50 天，第60 天取樣，將樣品以轉速10 000 r/min離心6～8 min，取上清液待測[11]，于-20 ℃下保存，待測。

1.3.2 代謝產物的測定

（1）pH 值測定。利用pH 計測定發(fā)酵過程中pH值的變化[12]。

（2）總酸含量測定。根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定方法》[13]。

（3）總糖含量測定。用蒽酮-硫酸法來測定樣品中的總糖含量[14]。

（4）總酚含量測定。GB/T 31740.2—2015 茶多酚的檢測方法[15]。

1.3.3 抗氧化活性的測定

（1）DPPH 自由基清除能力的測定。參照范金波等人[16]的方法，對DPPH 自由基清除率進行測定。

（2）羥基自由基清除能力的測定。采用Fenton法[17]。

（3）ABTS 自由基清除能力的測定。采用ABTS自由基清除能力試劑盒，按照試劑盒提供的方法進行測定。

（4）還原力的測定。還原力測定以維C 作為參照[18]，先加入1 mL 不同濃度的樣品液和pH 值為6.6的0.2 moL/L 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，再加入1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻。于50 ℃恒溫反應20 min，隨后加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL 終止反應，對停止反應的溶液進行離心處理。取2.5 mL 離心上清液、2.5 mL 超純水、0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL混合均勻，室溫靜置反應10 min，于波長700 nm 處測其吸光度。

2 結果與分析

2.1 百香果發(fā)酵過程中pH 值與總酸含量的變化結果

百香果酵素不同發(fā)酵時間總酸、pH 值的變化見圖1。

圖1 百香果酵素不同發(fā)酵時間總酸、pH 值的變化

由圖1 可知，在發(fā)酵前10 d，總酸含量變化不明顯，pH 值迅速下降；當發(fā)酵10～20 d 時，總酸呈現(xiàn)增長趨勢，pH 值呈緩慢降低的現(xiàn)象，主要因為自然發(fā)酵下乳酸菌、醋酸菌等微生物大量增殖，產生大量的酸性次級代謝產物；在發(fā)酵20～60 d，總酸含量逐漸上升，pH 值基本穩(wěn)定。

2.2 百香果發(fā)酵過程中總糖含量的變化結果

葡萄糖標準曲線見圖2。

由圖2 可知，采用蒽酮-硫酸法建立標準曲線，相關系數(shù)為R2=0.998 7，在葡萄糖質量濃度為20～160 μg/mL，質量濃度和吸光度呈良好的線性關系。

圖2 葡萄糖標準曲線

百香果酵素不同發(fā)酵時間總糖含量的變化見圖3。

圖3 百香果酵素不同發(fā)酵時間總糖含量的變化

由圖3 可知，發(fā)酵前期（0～20 d），總糖含量迅速降低，一方面說明糖作為碳源被分解利用，微生物生長和代謝較快；另一方面說明百香果原料中的水分在高糖滲透壓條件下，發(fā)酵液被稀釋，導致總糖含量降低。發(fā)酵中期（20～40 d），總糖質量濃度從0.770 g/mL 下降到0.704 g/mL。發(fā)酵后期（40～60 d），總糖質量濃度處于先增加后降低最終趨于穩(wěn)定的階段，增加的原因可能是隨著發(fā)酵液中糖質量濃度的降低，微生物開始利用代謝產物中的糖類，進而溶解在發(fā)酵液中。

2.3 百香果發(fā)酵過程中總酚質量濃度的變化結果

總酚標準曲線見圖4，百香果酵素不同發(fā)酵時間總酚質量濃度的變化見圖5。

圖4 總酚標準曲線

由圖4 可知，相關系數(shù)為R2=0.999 5，在沒食子酸質量濃度10～60 μg/mL，質量濃度和吸光度呈良好的線性關系。由圖5 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，總酚質量濃度呈現(xiàn)上升的趨勢。在發(fā)酵50～60 d 時總酚含量迅速上升，可能是因為百香果中的酚類物質在此發(fā)酵階段大量溶出，或者是因為微生物消耗原料中的某些成分合成酚類物質或者其他代謝物轉化成酚類物質。在發(fā)酵第60 天時，達到最高值為0.9 mg/mL。

圖5 百香果酵素不同發(fā)酵時間總酚質量濃度的變化

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH 自由基清除能力變化結果

百香果酵素不同發(fā)酵時間DPPH 自由基清除率的變化見圖6。

圖6 百香果酵素不同發(fā)酵時間DPPH 自由基清除率的變化

由圖6 可知，隨著發(fā)酵時間增加，0.5%的質量分數(shù)和1.0%的質量分數(shù)對DPPH 自由基的清除率的變化趨勢相同，均呈現(xiàn)先增加再緩慢降低再增加的變化趨勢。在發(fā)酵第50 天～第60 天時，DPPH 自由基的清除率呈現(xiàn)增大的趨勢，可能與此階段總酚的大量增加有關。當質量分數(shù)為0.5%時，在發(fā)酵的第30 天，清除率達到最大值為60.0%；當質量分數(shù)為1.0%時，在發(fā)酵的第40 天，清除率達到最大值為78.7%。因此，從DPPH 自由基清除率的變化趨勢來看，百香果酵素發(fā)酵時間在30～40 d 為宜。

2.4.2 羥基自由基清除能力變化結果

百香果酵素不同發(fā)酵時間羥基自由基清除率的變化見圖7。

圖7 百香果酵素不同發(fā)酵時間羥基自由基清除率的變化

采用硫酸亞鐵-過氧化氫體系產生羥基自由基，通過水楊酸鈉對反應后的羥基自由基進行快速捕捉[20]。由圖7 可知，隨著發(fā)酵時間的延長，羥基自由基的清除率先增大后穩(wěn)定。在發(fā)酵10～20 d，從37.5%增大到75.1%。在第20 天～第50 天時，呈緩慢上升然后趨于穩(wěn)定。在第50 天～第60 天時，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，可能與微生物衰亡有關。因此達到某個節(jié)點后，延長發(fā)酵時間對羥基自由基的清除能力貢獻不大。

2.4.3 ABTS 自由基清除能力變化結果

百香果酵素不同發(fā)酵時間ABTS 自由基清除率的變化見圖8。

圖8 百香果酵素不同發(fā)酵時間ABTS 自由基清除率的變化

由圖8 可知，百香果酵素的ABTS 自由基清除能率保持在35%左右。隨著發(fā)酵時間延長，基本上呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在發(fā)酵第50 天，達到最大值為39.5%。

2.4.4 百香果發(fā)酵過程中還原力的變化

百香果酵素在不同發(fā)酵時間還原力的變化見圖9。

圖9 百香果酵素在不同發(fā)酵時間還原力的變化

由圖9 可知，在整個發(fā)酵周期，除發(fā)酵20～30 d，均呈現(xiàn)不斷增大的趨勢。在發(fā)酵40～60 d，增加幅度明顯，吸光度從0.391 上升到0.565。與以上3 種抗氧化指標相比，還原力的變化趨勢與其差別較大，是因為還原力是一個綜合性指標，與多種抗氧化機制有關。

3 結論

通過對百香果酵素發(fā)酵過程中總酸、pH 值、總糖、總酚及4 個抗氧化指標的結果分析來看，百香果酵素的發(fā)酵可以分為3 個階段：發(fā)酵初期（0～10 d），發(fā)酵中期（10～20 d），發(fā)酵末期（20～40 d）。因此，在發(fā)酵40 d 時，可以作為百香果酵素前發(fā)酵結束的依據(jù)，在該階段，可以通過補加營養(yǎng)物質或者人工接種發(fā)酵微生物進行發(fā)酵調控。采用傳統(tǒng)發(fā)酵技術制備百香果酵素，研究了主要代謝產物及抗氧化活性隨著發(fā)酵時間的變化趨勢，有必要開展代謝產物與抗氧化活性相關性分析及菌群的結構和變化，為百香果酵素精準發(fā)酵奠定理論基礎。