趙海靜，袁萍，趙珺，冀曉慧，張清學(xué)，王文軍

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心，廣州 510120)

在常規(guī)IVF過程中，常通過原核出現(xiàn)來評估卵母細(xì)胞的受精情況。正常受精是指受精后16～20 h內(nèi)觀察到受精卵中有2個清晰的原核(2PN)和2個極體(2PB)[1]。不具備以上形態(tài)學(xué)特征的受精卵，如零原核(0PN)等被稱為異常受精[2]。有11.3%～20.0%的成熟卵母細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)0PN現(xiàn)象[3]。行IVF后第1天原核觀察為0PN的成熟卵母細(xì)胞在后續(xù)的發(fā)育過程中會有兩種結(jié)局：(1)沒有發(fā)生分裂，處于未受精狀態(tài)，我們稱之為0PN卵母細(xì)胞；(2)能夠繼續(xù)發(fā)育到第1次分裂，即為0PN來源胚胎。根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會實驗室指南[2]，不建議移植0PN來源胚胎。但是，有很多研究者對0PN來源胚胎進(jìn)行了大量的細(xì)胞遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，部分0PN來源胚胎為二倍體胚胎，并且有4.4%～37.2%的0PN來源胚胎能夠發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚[4-6]。以上研究提示，在觀察受精時沒有原核的成熟卵母細(xì)胞可能實際上是含有2PN的受精卵，沒有觀察到2PN的主要原因可能是在固定時間進(jìn)行受精評估很容易錯過原核觀察[7]。

正常受精的卵母細(xì)胞其原核消失大約發(fā)生在受精后的23～25 h，而發(fā)育速度快的胚胎其原核消失可能早于發(fā)育速度正常的胚胎[8-9]。所以，固定時間原核評估為0PN但能夠繼續(xù)分裂的0PN來源胚胎，也許是發(fā)育速度快的胚胎，只是在觀察受精時原核已經(jīng)消失。胚胎發(fā)育過程中的2個重要時間截點為：(1)從受精開始到原核消失的時間間隔稱為tPNf；(2)從受精開始到第1次細(xì)胞分裂的時間間隔稱為t2[10]。Kobayashi等[11]研究發(fā)現(xiàn)：(1)使用延時攝像(Time-lapse)監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行原核評估時，0PN來源胚胎的發(fā)生率顯著低于固定時間原核評估方法(0.0% vs. 8.3%，P<0.05)；(2)發(fā)育速度快的胚胎其原核消失早于發(fā)育速度正常的胚胎；(3)在固定時間原核評估時，0PN來源胚胎的t2顯著短于2PN來源胚胎[(22.4±1.46)h vs.(27.3±3.32)h，P<0.05]，這說明0PN來源胚胎更早開始分裂，其發(fā)育速度更快；(4)通過Time-lapse觀察受精后48 h內(nèi)2PN來源胚胎的發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，t2和tPNf參數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，提示原核消失越早細(xì)胞開始分裂越早，發(fā)育速度也越快；(5)移植0PN來源囊胚能夠獲得健康嬰兒。因此，大部分0PN來源且發(fā)育速度快的胚胎是由于原核消失早，導(dǎo)致固定時間觀察時錯過了原核的出現(xiàn)，因此被錯誤地判斷為0PN來源胚胎。在我們中心常規(guī)使用固定時間原核評估方法，可能錯過原核觀察而出現(xiàn)一定比例的0PN來源胚胎。本文擬通過比較固定時間原核評估中的0PN來源胚胎和2PN來源胚胎的Day 2(D2)和D3卵裂球數(shù)及其囊胚培養(yǎng)結(jié)局，從形態(tài)學(xué)特征來探究0PN來源胚胎的發(fā)育速度及發(fā)育潛能；并通過比較IVF-0PN來源囊胚與植入前遺傳學(xué)檢測-單基因病(PGT-M)周期中2PN來源囊胚的染色體整倍體率，從遺傳學(xué)角度評估0PN來源胚胎的真實染色體狀態(tài)。本研究為分析0PN來源胚胎的臨床應(yīng)用價值，提高胚胎利用率提供了理論依據(jù)，也為0PN來源胚胎的臨床移植提供參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年10月至2020年9月于本中心行常規(guī)IVF治療的20對不孕不育夫婦的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)控制性促排卵方案為長方案；(2)D1原核觀察為0PN或2PN。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)D1原核觀察為1PN、3PN或多PN；(2)D1卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察為MI、GV、退化或空透明帶。

共納入20個周期的183枚卵母細(xì)胞。行IVF后D1固定時間原核評估，沒有原核的成熟卵母細(xì)胞共67枚(0PN卵母細(xì)胞14枚，0PN來源胚胎53枚)，2PN來源胚胎共116枚。剔除14枚0PN卵母細(xì)胞后，根據(jù)原核評估以及細(xì)胞分裂情況分為兩組：0PN胚胎組(0PN來源胚胎，n=53)和2PN胚胎組(2PN來源胚胎，n=116)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：入組患者均采用長方案進(jìn)行促排卵。陰道B超監(jiān)測卵泡生長情況，當(dāng)B超監(jiān)測有1～2個卵泡直徑≥18 mm時，給予肌肉注射HCG(珠海麗珠)10 000 U，注射后36～38 h在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。在體視顯微鏡下收集卵泡液中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，并置于G-IVF液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)。

2.精液收集及處理：取卵當(dāng)天男方以手淫法采集精液，待精液液化后，通過密度梯度離心及上游法處理，從而獲得符合IVF受精要求的優(yōu)質(zhì)精子。

3.IVF及原核觀察：獲得的卵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)4～6 h后行IVF，加精濃度為0.3×106/ml。授精16～20 h后評估原核情況，受精卵中出現(xiàn)兩個原核的為2PN，未見原核的為0PN。

4.胚胎培養(yǎng)及發(fā)育評估：去除顆粒細(xì)胞后，將胚胎轉(zhuǎn)移至G1-plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中，置于37℃、6%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至D3。依據(jù)之前文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[12]，在D2和D3分別進(jìn)行卵裂期胚胎的發(fā)育評估，并重點關(guān)注卵裂球數(shù)量。在D3將胚胎轉(zhuǎn)移至G2-plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。在D5和D6分別評估囊胚發(fā)育情況，依據(jù)Gardner評分系統(tǒng)[13]，綜合囊胚擴張狀態(tài)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育情況對囊胚質(zhì)量進(jìn)行全面評估。根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚發(fā)育分為6個時期：1期為早期有腔室囊胚，囊胚腔體積<胚胎總體積的1/2；2期為囊胚腔體積≥胚胎總體積的1/2；3期為擴張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期為囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變??；5期為正在孵出，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期為孵出囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。處于3～6期的囊胚，還需對內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量分級。其中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級：A級為細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級為細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C級為細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞分級：A級為上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級為上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C級為上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成，細(xì)胞很少。本中心定義可利用囊胚為透明帶擴張程度≥3期，且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評分至少1項優(yōu)于C級；優(yōu)質(zhì)囊胚為透明帶擴張程度≥3期，且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評分為BB及以上。

5.囊胚活檢：對D5或D6的可利用囊胚，使用30 μm活檢針(Cook，美國)輕輕吸入5～6個滋養(yǎng)層細(xì)胞并通過激光切割法獲得活檢細(xì)胞，再將活檢細(xì)胞裝入含5 μl磷酸鹽緩沖液(江蘇億康基因)的無RNA/DNA酶的小管中，儲存于-80℃冰箱待進(jìn)行植入前遺傳學(xué)檢測以分析染色體狀態(tài)。

6.觀察指標(biāo)：比較兩組間胚胎發(fā)育潛能情況，包括D2和D3卵裂球數(shù)、囊胚形成率、可利用囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率以及染色體整倍體率。囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%；可利用囊胚率=可用囊胚數(shù)/形成囊胚數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/形成囊胚數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、夫妻雙方的一般資料

本研究共納入20對不孕不育夫婦。女方平均年齡為(33.70±5.95)歲，平均獲卵數(shù)為(14.85±9.47)個；男方平均精子正常形態(tài)率為(3.83±1.54)%，平均精子頂體酶活性為(55.20±29.48)μIU/106精子(表1)。

表1 納入研究夫妻雙方的一般資料(-±s)

二、兩組間胚胎發(fā)育潛能比較

0PN胚胎組D2卵裂球數(shù)、D3卵裂球數(shù)、囊胚形成率、可利用囊胚率均顯著高于2PN胚胎組(P<0.05)；0PN胚胎組的優(yōu)質(zhì)囊胚率略高于2PN胚胎組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組間胚胎發(fā)育情況比較[(-±s)，%]

三、不同來源囊胚的染色體整倍體率比較

為了分析0PN來源胚胎的染色體是否正常，我們對0PN來源囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢及染色體篩查。根據(jù)不同來源囊胚分為兩組：0PN來源囊胚為0PN囊胚組(n=42)，選取同一時期的PGT-M周期中2PN來源囊胚為2PN囊胚組(n=251)。比較兩組間染色體整倍體率發(fā)現(xiàn)，0PN囊胚組的染色體整倍體率略高于2PN囊胚組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 不同來源囊胚組間染色體整倍體率比較[(-±s)，%]

討 論

原核觀察是目前評估受精與否的常用方法，然而由于雌雄原核的不同步發(fā)育會導(dǎo)致固定時間的原核觀察不完全準(zhǔn)確。因此，在適當(dāng)時間內(nèi)未觀察到原核，并不一定提示受精失敗[1]。受精時表現(xiàn)為0PN但能夠繼續(xù)發(fā)育到第1次卵裂，即為0PN來源胚胎[11]。

0PN來源胚胎是源自于正常受精或異常受精很難確定。Lim等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在合子期丟棄的0PN來源胚胎中有66%是二倍體，這說明一定比例的0PN來源胚胎實際上是2PN來源胚胎。原核的誤判主要原因是由于在固定時間原核評估很容易錯過原核的出現(xiàn)[7]。Kobayashi等[11]通過Time-lapse對胚胎進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，發(fā)育速度快的胚胎其原核消失要早于發(fā)育速度正常的胚胎，因此使用固定時間原核評估時，發(fā)育速度快的胚胎因原核已經(jīng)消失而錯過原核觀察，從而被誤判為0PN來源胚胎。這一結(jié)論支持了我們的研究，本文結(jié)果顯示，0PN來源胚胎D2和D3的卵裂球數(shù)均顯著高于2PN來源胚胎(P<0.05)，這說明0PN來源胚胎的發(fā)育速度快于2PN來源胚胎，而這些0PN來源胚胎很可能源自于正常受精，因原核消失得早，導(dǎo)致固定時間原核評估時未觀察到原核。有研究認(rèn)為，發(fā)育速度快的胚胎擁有更高的發(fā)育能力[15]。Fu等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，快速發(fā)育的0PN來源胚胎有更好的發(fā)育潛能。Kobayashi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，原核消失較早的胚胎其囊胚形成率(75.0% vs. 67.1%)及優(yōu)質(zhì)囊胚率(47.2% vs. 44.5%)均略高于原核消失較晚的胚胎，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。我們的研究結(jié)果與之一致，如表2中數(shù)據(jù)顯示：0PN來源胚胎的囊胚形成率和可利用囊胚率均顯著高于2PN來源胚胎(P<0.05)，其優(yōu)質(zhì)囊胚率略高于2PN來源胚胎，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

胚胎基因組激活開始于4～8細(xì)胞時期，經(jīng)過3 d的體外培養(yǎng)，胚胎逐漸表達(dá)自身基因[17]。卵裂期胚胎發(fā)育并形成囊胚，表明胚胎基因組已經(jīng)激活，能夠發(fā)育至囊胚的胚胎其染色體異常率較低，因此可以通過延長體外培養(yǎng)時間來篩選出異常受精的0PN來源胚胎[18]。我們臨床常規(guī)策略是將0PN來源胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，若形成可利用囊胚則冷凍保存，在患者無2PN來源囊胚可移植的情況下，移植0PN來源囊胚以增加妊娠機會。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，源自于正常受精的0PN來源胚胎，其囊胚形成率較高；而源自于異常受精的0PN來源胚胎，其囊胚形成率很低?；谝陨辖Y(jié)論和我們的結(jié)果推測，部分0PN來源胚胎很有可能來自于2PN受精卵。因此，我們對這些0PN來源囊胚進(jìn)行了染色體檢測并與臨床同一時期的PGT-M周期中2PN來源囊胚進(jìn)行比較，結(jié)果表明，IVF-0PN來源囊胚的染色體整倍體率略高于PGT-M-2PN來源囊胚，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(76.2% vs.75.7%，P>0.05)，這證實了大部分0PN來源胚胎的起源不是異常受精，而是沒有觀察到原核的正常受精卵。

0PN來源胚胎的臨床應(yīng)用仍然是一個有爭議的話題。Chen等[6]研究認(rèn)為，考慮到0PN為異常受精，所以0PN來源胚胎移植應(yīng)該盡可能地結(jié)合植入前遺傳學(xué)檢測。同樣，我們的結(jié)果顯示，0PN來源囊胚存在23.8%(10/42)的染色體非整倍體率。因此，在胚胎移植前對0PN來源胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測是很有必要的，可以確保移植染色體正常的0PN來源胚胎，以避免不良妊娠結(jié)局。本研究的一個優(yōu)點是對所有納入研究的0PN來源囊胚進(jìn)行植入前遺傳學(xué)檢測，獲得了明確的染色體整倍體結(jié)果，能夠為這些胚胎的后期臨床應(yīng)用提供準(zhǔn)確的遺傳學(xué)支持。但我們的研究也有一定的局限性：首先，納入的0PN來源囊胚數(shù)量較少；其次，由于入組患者均未進(jìn)行0PN來源囊胚移植，所以無法隨訪臨床妊娠及新生兒出生結(jié)局。

綜上，在本研究中，使用固定時間原核評估方法獲得的0PN來源胚胎，其發(fā)育速度及發(fā)育潛能優(yōu)于2PN來源胚胎，并且0PN來源囊胚的染色體整倍體率也略高于同期PGT-M-2PN來源囊胚。提示大部分0PN來源胚胎可能源自于正常受精卵，因而在常規(guī)IVF中，對于固定時間原核評估為0PN的胚胎來說，直接丟棄非明智之舉，其臨床應(yīng)用價值需要結(jié)合植入前遺傳學(xué)檢測進(jìn)行重新評估和加以重視。