張力國(guó)

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110030）

牛病毒性腹瀉，又稱粘膜?。˙ovine viral diarrhoea/Mucosaldisease），屬法定二類動(dòng)物傳染病，是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的傳染病。該病在臨床上以6～18月齡牛高發(fā)，雖發(fā)病率不高約5%，但病死率高達(dá)90%～100%。我國(guó)于1980年首次從國(guó)外引進(jìn)牛的流產(chǎn)胎兒脾臟中分離并鑒定出BVDV，截至目前，我國(guó)已有20多個(gè)省市自治區(qū)報(bào)道牛群發(fā)生牛病毒性腹瀉，因本病具有持續(xù)感染，免疫耐受等特點(diǎn)，在牛群中污染率很高，個(gè)別牛群高達(dá)60%以上，近些年呈逐步上升趨勢(shì)。該病已成為危害牛群健康的主要傳染病之一。

1 發(fā)病情況及臨床癥狀

2021年下半年，我省某地牛場(chǎng)新生犢牛陸續(xù)開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，在斷奶前后進(jìn)行補(bǔ)飼過程中尤其明顯，該場(chǎng)共飼養(yǎng)120頭，成牛100頭、犢牛20頭，期間約有1/3犢牛出現(xiàn)腹瀉，成牛未見明顯癥狀?；疾倥３跗诔霈F(xiàn)急性腹瀉、脫水、精神沉郁、厭食等癥狀，后期糞便中帶有膠凍樣分泌物或糞便中帶有血絲，期間患病犢牛注射慶大霉素、鏈霉素、磺胺類藥物，癥狀未見有明顯改善，并有犢牛開始陸續(xù)死亡。

2 流行病學(xué)調(diào)查及剖檢變化

該飼養(yǎng)場(chǎng)周圍無其他規(guī)模牛飼養(yǎng)場(chǎng)，有個(gè)別散戶飼養(yǎng)，但未見相關(guān)癥狀出現(xiàn)，據(jù)場(chǎng)主介紹，該場(chǎng)近期陸續(xù)從其他地區(qū)引進(jìn)牛，且未經(jīng)隔離直接混群。對(duì)病死牛進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，病牛皮下干硬，眼窩深陷，機(jī)體消瘦，脫水癥狀較為明顯，心包少量積液，肺臟充血，皺胃黏膜出血，腸道黏膜脫落，黏膜下呈現(xiàn)條索狀出血，腸系膜淋巴結(jié)出血腫大，直腸及肛門出血。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 血清學(xué)診斷隨機(jī)采集場(chǎng)內(nèi)20頭成牛以及全部犢牛（20頭）的血液，共計(jì)40份，并離心取血清，使用牛病毒性腹瀉病毒抗體檢測(cè)試劑盒（IDEXX）進(jìn)行抗體檢測(cè)。

3.1.1 操作步驟（1）洗滌液制備 將10倍濃縮的洗液置于18～26℃,混旋后確定析出的鹽類全部溶解。將濃縮洗液用去離子水作1:10稀釋，配置100mL。

（2）取出包被板 并在操作記錄表上標(biāo)記樣品的位置，每孔中加100μL樣品稀釋液。1A、1B各加入25μL陽(yáng)性對(duì)照，1C、1D加入25μL陰性對(duì)照，其余各孔對(duì)應(yīng)加入25μL樣品。用振蕩器振蕩反應(yīng)板，將反應(yīng)板中的溶液混勻,在18～26℃孵育90min，吸出反應(yīng)孔中的液體物質(zhì)并棄入廢液缸中。

（3）用300μL左右的洗滌液洗滌每個(gè)板孔5次。每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μL酶標(biāo)抗體，在18～26℃孵育30min后，用300μL左右的洗滌液洗滌每個(gè)板孔5次。

（4）在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μLTMB底物N.12，在18～26℃孵育10min，在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μL的終止液N.3終止反應(yīng)。

（5）使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定和記錄樣品以及對(duì)照的吸光值。判斷方法：陽(yáng)性對(duì)照OD值≤0.250，且陰性對(duì)照OD值-陽(yáng)性對(duì)照OD值≥0.150，實(shí)驗(yàn)有效。計(jì)算S/P值，S/P＝（樣品OD值-陽(yáng)性對(duì)照OD值）/（陰性對(duì)照OD值-陽(yáng)性對(duì)照OD值），當(dāng)S/P≤0.20，判定為陰性；當(dāng)0.20≤S/P≤0.30，判定為可疑；當(dāng)S/P≥0.30，判定為陽(yáng)性。

3.1.2 結(jié)果

表1 牛病毒性腹瀉病毒抗體檢測(cè)樣品布局

經(jīng)計(jì)算，陰性平均OD值為0.201，陽(yáng)性平均OD值為0.54，全部樣品S/P≥0.30，均為陽(yáng)性。

3.2 病原學(xué)診斷分別采集6頭發(fā)病犢牛的糞便樣品，放入無菌采樣管中，使用牛病毒性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（世紀(jì)元亨）進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。

3.2.1 操作步驟（1）核酸提取 在操作記錄表上標(biāo)記樣品的位置，使用病毒RNA/DNA提取試劑盒（天隆科技-磁珠法），分別吸取無菌采樣管各200μL樣品，按順序加入試劑盒配套96孔板的1A～6A列孔內(nèi)，7A加入200μL陽(yáng)性對(duì)照，8A加入200μL陰性對(duì)照，同時(shí)各孔分別加入20μL蛋白酶K溶液，放入核酸提取儀，并運(yùn)行RNA核酸提取程序，進(jìn)行自動(dòng)化提取。

（2）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè) 取27μL無菌無核酸酶水，100μLRT-PCR反應(yīng)液，4μL酶混合液，19μL熒光探針充分混合后，分裝8個(gè)反應(yīng)管中各15μL。

（3）分別取3.2.1.2中提取的樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照RNA各5μL，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混均并作好相應(yīng)標(biāo)記，使用abi7500熒光PCR儀進(jìn)行以下反應(yīng)：45℃15min，95℃1min;95℃5s,60℃35s,在每個(gè)循環(huán)第二步（60℃35s）收集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。（報(bào)告基因“FAM”，淬滅基因“None”）。

表2 牛病毒性腹瀉病毒抗體檢測(cè)樣品OD值

3.2.2 結(jié) 果

經(jīng)檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤30，陰性對(duì)照無Ct值并且無特異性擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立，全部被檢樣品Ct值≤30，結(jié)果判定為BVDV陽(yáng)性。

3.3 寄生蟲鏡檢采集患病牛及場(chǎng)內(nèi)新鮮糞便稀釋后，壓片在顯微鏡下檢查，未觀察到球蟲及其他寄生蟲蟲體和蟲卵，排除寄生蟲感染可能。

4 診斷

根據(jù)臨床癥狀并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果綜合判斷，確診該場(chǎng)犢牛腹瀉原因是牛病毒性腹瀉病毒感染所致。

5 治療及預(yù)防

圖1 牛病毒性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

5.1 目前無特效的治療方法對(duì)癥治療和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理可以減輕癥狀，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，促使病?？祻?fù)。首先要預(yù)防因腹瀉導(dǎo)致脫水，及時(shí)補(bǔ)液，糾正電解質(zhì)平衡和酸堿平衡，患該病犢牛會(huì)因?yàn)閲?yán)重脫水、電解質(zhì)丟失和酸中毒導(dǎo)致休克和心力衰竭而死亡，補(bǔ)液采用口服或靜脈補(bǔ)液，補(bǔ)液量根據(jù)犢牛脫水程度而定。其次要預(yù)防細(xì)菌性繼發(fā)感染，合理選擇抗菌藥物，及時(shí)使用抗生素。

5.2 懷孕母牛分娩前2～4周接種疫苗可增加初乳中特異性抗體的含量，有利于預(yù)防犢牛腹瀉。對(duì)同群未發(fā)病犢牛接種疫苗，疫苗選擇上減毒活疫苗存在散毒或毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)引起犢牛免疫力下降，因此推薦選擇滅活疫苗。

6 防控措施

6.1 加強(qiáng)健康管理保障妊娠母牛特別是妊娠后期母牛的營(yíng)養(yǎng)，保持母牛乳房衛(wèi)生健康，母牛產(chǎn)犢過程中的排出物和產(chǎn)后母牛排出的污物要及時(shí)處理。犢牛注意保暖，減少因環(huán)境改變、運(yùn)輸?shù)纫蛩貙?dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。

6.2 加強(qiáng)衛(wèi)生管理該病的主要傳染源就是患病的畜禽，無論是分泌物、排泄物，還是血液、脾臟等，都含有病毒，潛伏期通常7～10d，因此放牧場(chǎng)所和圈舍要定期清掃，糞尿及時(shí)清理，每周堅(jiān)持至少消毒一次，犢牛發(fā)病圈舍可使用2%氫氧化鈉或5%～10%生石灰消毒。飼喂?fàn)倥５乃泄ぞ弑仨毟蓛粜l(wèi)生，且用后要立即沖刷干凈，避免因用具、環(huán)境不衛(wèi)生導(dǎo)致犢牛發(fā)生腸道疾病、免疫力下降。

6.3 增強(qiáng)犢牛免疫力確保犢牛及時(shí)吃到母乳，犢牛斷奶早期少量多次采食優(yōu)質(zhì)干草，逐漸增加采食量但不宜過多。日常飼喂要提供充足的蛋白質(zhì)、VE及亞硒酸鈉，飼料或飲水中添加黃芪多糖，提高機(jī)體抗病能力。

6.4 牛群凈化場(chǎng)內(nèi)牛群全部檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒，及時(shí)淘汰陽(yáng)性牛，控制傳染源。嚴(yán)格把關(guān)引進(jìn)牛，禁止引入病?；驇Ф九＃霗z測(cè)合格后，隔離觀察21d，方可合群。