藍(lán)敏煥，龐 娥，趙少靜，潘唐納

(中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410083)

細(xì)胞內(nèi)的生物硫醇，如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)及谷胱甘肽(GSH)，通過氧化還原反應(yīng)參與機體代謝，其濃度的變化與多種疾病有關(guān)[1-2]。例如GSH濃度異常與惡性腫瘤、艾滋病、肝損傷和神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，Cys的濃度變化與生長緩慢、脫發(fā)和肝損傷相關(guān)，而Hcy是心血管疾病和阿爾茨海默病的標(biāo)志物之一[3-5]。因此，生物硫醇的高靈敏檢測對于疾病的早期診斷和評估進(jìn)展具有非常重要意義[6-8]。

近年來，科研人員開發(fā)了多種方法用于檢測細(xì)胞內(nèi)生物硫醇的濃度，包括電化學(xué)發(fā)光法[9]、酶聯(lián)免疫法[10]和比色法[11]等。然而這些方法仍然存在一些不足，例如電化學(xué)發(fā)光法重現(xiàn)性差、酶聯(lián)免疫法容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而比色法靈敏度較低。熒光探針技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好，可以在線監(jiān)測等優(yōu)點，在生物硫醇的檢測領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢。湯等人選擇2'-羥基查爾酮作為熒光團，2，4-二硝基苯磺酸酯基團作為識別基團，設(shè)計合成了一個熒光開啟型熒光探針。該探針與生物硫醇反應(yīng)后釋放出查爾酮并恢復(fù)其熒光，實現(xiàn)了水溶液和細(xì)胞中生物硫醇的高靈敏檢測[12]。張等人以香豆素為熒光團，2，4-二硝基苯磺酰胺為識別單元，基于分子內(nèi)光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移機制，開發(fā)了一種香豆素類新型熒光增強型探針CPH，當(dāng)檢測到苯硫酚后，香豆素?zé)晒鈭F被釋放，溶液的熒光恢復(fù)，從而實現(xiàn)水溶液中苯硫酚的檢測[13]。郭等人制備了氮、硫摻雜的碳點，在碳點水溶液中加入Cu2+后導(dǎo)致熒光猝滅，當(dāng)向碳點-Cu2+體系中加入硫醇衍生物后，由于硫醇與Cu2+具有更強的結(jié)合能力，可以將Cu2+從碳點的表面被移除，碳點的熒光恢復(fù)[14]。然而，很多熒光探針?biāo)苄暂^差，有的需要在較高或較低pH條件下進(jìn)行檢測，有的選擇性較差。因此，開發(fā)一種能夠克服這些缺點的熒光探針具有十分重要的意義[15]。

本文以三苯氨基噻吩基團為強給電子基團，以氰基作為強吸電子基團，合成了一種可檢測生物硫醇的有機小分子熒光探針TTCNPy。進(jìn)一步利用納米沉淀法將其制備成具有良好水溶性的納米顆粒，用于檢測水溶液和細(xì)胞中的生物硫醇。該納米顆粒具有近紅外熒光發(fā)射(λem=727 nm)及較大的斯托克斯位移(260 nm)，能夠在pH=7的緩沖溶液中靈敏地檢測到生物硫醇，并具有較高的選擇性和抗干擾能力。生物硫醇中巰基的強親核進(jìn)攻能力能夠破壞熒光探針的共軛π鍵，導(dǎo)致探針熒光猝滅，從而實現(xiàn)對細(xì)胞中生物硫醇的定量檢測。TTCNPy納米顆粒具有合成簡便、水溶性好、靈敏度高、選擇性高、細(xì)胞毒性低的優(yōu)點[16]。

1 實驗方法

1.1 實驗材料與儀器

實驗中使用的試劑均購自希恩斯和J&K，未進(jìn)行額外的提純。所用溶劑均為高效液相色譜級；所用無水溶劑均按照有機溶劑純化手冊進(jìn)行處理；所用柱層析硅膠為200～300目。在400MHz核磁共振儀器(Bruker)上測試了1H NMR和13C NMR譜。用Xevo G2 QTOF MS(Waters)記錄化合物的高分辨質(zhì)譜(HRMS)。紫外可見吸收光譜在島津UV2600分光光度計上測量；熒光光譜在島津RF-6000熒光分光光度計上測量；細(xì)胞成像實驗使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行。

1.2 TTCNPy的合成及表征

TTCNPy分子的合成路線如圖1所示。

圖1 TTCNPy的合成路線Fig.1 Synthetic route of TTCNPy

1.2.1 TTCN-Br的合成

將1 mmol對溴代苯乙腈和1.5 mmol t-BuOK依次加入到10 mL無水乙醇中，常溫攪拌10 min后，將0.5 mmol的TT-CHO加入到該溶液中，90 ℃回流4 h后，冷卻到室溫，旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠純化，正己烷/乙酸乙酯梯度洗脫可以得到黃色固體，產(chǎn)率約為75%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)，δ 7.60(s,1H)，7.58～7.48(m,7H)，7.24～7.34(m,5H)，7.26(s,8H)，7.16～7.11(m,4H)，7.07(d,J=11.8,4.9 Hz,4H).

1.2.2 TTCNPy的合成

將0.2 mmol TTCN-Br，0.5 mmol CH3I溶解到5 mL乙腈中，90 ℃回流8 h，冷卻到室溫，加入25 mL乙醚，收集過濾固體，在真空干燥箱中烘干后，溶解于10 mL丙酮，5 mmol KPF6溶于2 mL水中后，加入丙酮溶液中，混合液室溫攪拌24 h，旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠純化，CH2Cl2/CH3OH=8/1作為洗脫劑，分離得到深紅色固體，產(chǎn)率約為50%。1H NMR(400 MHz,CD3CN),δ 8.52(d,J=6.9 Hz,2H),8.18(d,J=7.0 Hz,2H),8.01(s,1H),7.94(d,J=8.6 Hz,2H),7.85(d,J=8.6 Hz,2H),7.63(d,J=4.0 Hz,1H),7.57～7.52(m,2H),7.36(d,J=4.0 Hz,1H),7.27(d,J=10.6,5.3 Hz,4H),7.06(t,J=7.8 Hz,6H),6.94(d,J=8.7 Hz,2H),4.19(s,3H).紅外光譜，1 635，1 573，1 496和1 429 cm-1為苯環(huán)骨架C=C環(huán)呼吸振動峰。615 cm-1為噻吩環(huán)上的C-S鍵振動。2 206 cm-1為C≡N的紅外吸收峰。

1.2 TTCNPy納米顆粒的制備

TTCNPy納米顆粒通過納米沉淀法制備。首先將1 mmol TTCNPy溶于2 mL THF中，在超聲下加入到50 mL超純水中，2 h后轉(zhuǎn)入到100 mL燒瓶中，并在室溫下不斷攪拌24 h除去溶液中的THF，得到橙紅色液體，然后用0.22 μm的水相濾膜過濾，得到制備好的TTCNPy熒光探針納米顆粒[17]。

1.3 紫外可見吸收光譜和熒光光譜

用空白溶劑校準(zhǔn)后，向比色皿中加入TTCNPy納米顆粒的水溶液。用移液槍吹勻后，加入不同濃度的生物硫醇，并在測試前再次吹勻，收集其紫外可見吸收光譜和熒光光譜。

1.4 探針的檢測限計算

計算好不同比例的生物硫醇所需要母液的體積，取10 μL濃度為2 mmol的TTCNPy納米顆粒母液加入2 mL緩沖溶液中，然后用移液槍移取一定體積的生物硫醇滴加到含TTCNPy納米顆粒的緩沖溶液中。測試TTCNPy探針溶液的熒光光譜，按照下式計算探針的檢測限。

LOD =Kσ/κ

上述符號的含義：K代表置信水平系數(shù)，光譜測試中K=3；σ代表空白樣品測量20次以上信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差；κ是727 nm處探針的熒光強度與生物硫醇濃度之間的線性關(guān)系的斜率。

1.6 選擇性實驗

在探針溶液中分別加入相同濃度的Hcy、Cys、GSH或其他不含巰基的氨基酸中，反應(yīng)相同的時間后，分別檢測其熒光光譜。

1.7 細(xì)胞毒性實驗

通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)分析評估TTCNPy納米顆粒對4T1細(xì)胞的毒性。將4T1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中，在37 ℃下，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2和95%空氣環(huán)境中培養(yǎng)，將細(xì)胞接種在96孔板中，24 h后更換含(2～10 μmol)的TTCNPy納米顆粒的培養(yǎng)基，再經(jīng)過24 h孵育后添加200 μL帶有MTT(5 mg/mL)溶液的新鮮培養(yǎng)基。在37 ℃下孵育4 h后，棄去MTT溶液，并加入200 μL DMSO。在酶標(biāo)儀下測量每個孔在490 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 TTCNPy納米顆粒的表征

我們首先通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察確定TTCNPy納米顆粒的尺寸。如圖2a所示，TTCNPy納米顆粒呈球狀結(jié)構(gòu)，直徑約為20～30 nm左右，這種尺寸的納米顆粒有利于細(xì)胞吞噬。具有近紅外熒光且大斯托克斯位移的熒光材料在生物成像

λ/nm

應(yīng)用中具有背景干擾低、對生物樣品的光損傷小、樣品穿透性強、檢測靈敏度高等優(yōu)點。TTCNPy納米顆粒水溶液的紫外可見吸收光譜和熒光光譜如圖2b所示，其在467 nm處有最大吸收峰，在727 nm處有熒光發(fā)射峰，斯托克斯位移達(dá)到260 nm。

1.5 TTCNPy納米顆粒在不同pH條件下對生物硫醇的光譜響應(yīng)

在不同pH條件下，不同熒光探針對生物硫醇的響應(yīng)有一定規(guī)律性[18]。我們系統(tǒng)研究了TTCNPy熒光探針在不同pH條件下對3種生物硫醇的響應(yīng)，如圖3所示，在相同時間內(nèi)，加入10 μmol的Hcy、Cys、GSH后TTCNPy納米顆粒的熒光強度顯著降低；并且隨著pH的增加，TTCNPy納米顆粒的光譜對生物硫醇的響應(yīng)也逐步增加(如圖3d)，這是由于在堿性條件下，巰基變成了親核能力更強的硫負(fù)離子，更容易進(jìn)攻碳碳雙鍵，導(dǎo)致TTCNPy探針的熒光被更高效地猝滅。

λ/nm λ/nm

2.3 TTCNPy納米顆粒對不同濃度生物硫醇的吸收和熒光光譜響應(yīng)

為了探究TTCNPy納米顆粒與生物硫醇識別過程的響應(yīng)時間，向配制好的10 μmol TTCNPy納米顆粒中加入相同濃度的Hcy、Cys、GSH，每隔10 min測試1次TTCNPy納米顆粒的紫外可見吸收光譜和熒光光譜。如圖4所示，隨著時間的延長，TTCNPy納米顆粒的熒光逐漸被猝滅，在100～150 min熒光強度幾乎沒有變化，說明此時反應(yīng)已經(jīng)基本結(jié)束，則可以確認(rèn)TTCNPy納米顆粒與生物硫醇的反應(yīng)時間約為100 min[19-20]。

2.4 TTCNPy納米顆粒對生物硫醇的靈敏度測試

為了考察TTCNPy納米顆粒對生物硫醇的靈敏度測試，我們通過紫外吸收變化及熒光光譜滴定實驗來進(jìn)行評價(圖5)[21-22]。在配制好的TTCNPy探針(10 μmol)中逐漸滴加Hcy、Cys、GSH(1～8 μmol)，可以觀察到隨著生物硫醇的加入，納米顆粒在467 nm的吸光度和727 nm處熒光逐漸降低。當(dāng)加入8 μmol的生物硫醇時，熒光強度不再降低。通過對TTCNPy納米顆粒在727 nm處的熒光發(fā)射與生物硫醇滴加的濃度進(jìn)行線性擬合，可以觀察到熒光發(fā)射與濃度在0～6 μmol的生物硫醇之間有良好的線性關(guān)系(插圖)。根據(jù)實驗結(jié)果，可以計算出熒光探針TTCNPy納米顆粒對Hcy、Cys、GSH的檢測限分別為0.479，0.429，0.480 μmol。上述結(jié)果表明TTCNPy納米顆粒對生物硫醇具有較高的檢測靈敏度[12]。

λ/nm λ/nm

λ/nm λ/nm

2.5 TTCNPy納米顆粒對生物硫醇的選擇性和檢測機理解釋

我們考察了TTCNPy納米顆粒對生物硫醇或常見不含巰基氨基酸的熒光響應(yīng)[23-25]。如圖6a所示，向配制好的TTCNPy納米顆粒(10 μmol)中分別加入相同濃度的Hcy、Cys、GSH、Lys、Pro、Tyr、Arg、Leu、Ala、Thr、His、Asp、Trp、Glu、Cystine、Gly、Ser、Met、Pre、Val，等待反應(yīng)100 min。通過對比，可以觀察到只有加入生物硫醇，TTCNPy納米顆粒的熒光才會被顯著猝滅，在加入其他不含巰基的氨基酸時，TTCNPy納米顆粒的熒光強度幾乎沒有明顯變化。上述結(jié)果表明TTCNPy探針對生物硫醇具有良好的選擇性。

為了探究TTCNPy納米顆粒對生物硫醇具有選擇性的原因，我們通過TTCNPy與Cys反應(yīng)前后的質(zhì)譜進(jìn)行了驗證。由于氰基的吸電子能力極強，導(dǎo)致碳碳雙鍵上的電子分布不均，而生物硫醇中巰基中的硫原子含有一對孤對電子，具有強親核能力，發(fā)生Michael加成反應(yīng)，破壞了TTCNPy探針的共軛，從而導(dǎo)致熒光猝滅(圖6b、6c)。為了進(jìn)一步研究其熒光猝滅機理，對TTCNPy納米顆粒與生物硫醇反應(yīng)前后的熒光壽命進(jìn)行了測試。結(jié)果顯示，反應(yīng)前的TTCNPy納米顆粒的熒光壽命為1.25 ns，而與Hcy、Cys和GSH生物硫醇反應(yīng)后，其壽命均降低至0.78 ns左右，說明這是一個靜態(tài)猝滅的機制。

圖6 (a)在HEPES緩沖液(pH=7)中TTCNPy納米顆粒對常見氨基酸的選擇性測試，(b)TTCNPy 與生物硫醇反應(yīng)機理示意圖。(c)TTCNP納米顆粒的自組裝以及檢測生物硫醇的示意圖。Fig.6 (a) Selectivity test of TTCNPy nanoparticles and common amino acids in HEPES buffer(pH=7),(b) schematic representation of the reaction mechanism of TTCNPy with biothiols.(c) Schematic diagram of self-assembly of TTCNP nanoparticles and detection of biothiols.

2.6 細(xì)胞毒性

鑒于TTCNPy納米顆粒對生物硫醇有著的良好識別功能，我們進(jìn)一步通過MTT檢測法探究了TTCNPy納米顆粒的生物相容性[26]。如圖7所示，隨著納米顆粒濃度的增加，4T1細(xì)胞的存活率只有很微小的降低，在濃度高達(dá)10 μmol時，4T1的細(xì)胞存活率均可以達(dá)到95%以上。這些結(jié)果說明TTCNPy探針具有很好的生物相容性。

Concentration/μmol圖7 不同TTCNPy納米顆粒濃度下的細(xì)胞存活率Fig.7 Cell viability at different TTCNPy nanoparticle concentrations

2.7 TTCNPy納米顆粒的細(xì)胞熒光成像

通過熒光倒置顯微鏡采集經(jīng)TTCNPy納米顆粒孵育的4T1細(xì)胞的熒光圖像，以驗證探針對檢測細(xì)胞內(nèi)生物硫醇的能力。將4T1細(xì)胞分為A、B、C、D四組，向培養(yǎng)基中分別加入10 μmol的TTCNPy納米顆粒，在孵育4 h后，向B、C、D三組中再分別加入10 μmol Hcy、Cys、GSH，并繼續(xù)孵育100 min，在PBS緩沖液沖洗兩遍后，用熒光倒置顯微鏡觀察并采集細(xì)胞圖像[26]，如圖8所示，A組顯示出強烈的紅色熒光，B、C、D組只能觀察到微弱熒光，細(xì)胞成像實驗證明了生物硫醇可以有效地猝滅TTCNPy納米顆粒的熒光。

圖8 4T1細(xì)胞與僅含TTCNPy納米顆粒、 TTCNPy與Hcy孵育、TTCNPy與Cys孵育和 TTCNPy與GSH孵育后的細(xì)胞成像照片。

3 結(jié)論

本文合成并制備了一種可檢測生物硫醇的小分子TTCNPy熒光探針，進(jìn)一步制備了水溶性納米顆粒。該納米顆粒具有近紅外熒光發(fā)射(λem=727 nm)，和較大的斯托克斯位移(260 nm)。能夠在pH=7的緩沖溶液中靈敏地檢測到生物硫醇，對Hcy、Cys、GSH的檢測限分別為0.479，0.429，0.480μmol。基于生物硫醇中巰基的強親核進(jìn)攻能力破壞熒光探針的共軛π鍵的原理，導(dǎo)致探針熒光猝滅，TTCNPy與GSH/Hcy/Cys作用后展現(xiàn)出明顯的熒光“開-關(guān)”的變化，從而實現(xiàn)對細(xì)胞中生物硫醇的可視化檢測。