劉金亮，繆煜清，李鈺皓

（上海理工大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院，上海 200093）

引言

光學(xué)成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用于生物分子等實時檢測與成像是目前研究的熱點。這種成像方式基于光學(xué)活性物質(zhì)與光學(xué)檢測設(shè)備的進步與發(fā)展。其中用于實時監(jiān)測各種生理活性物質(zhì)的熒光探針物質(zhì)遵循斯托克斯（Stokes）光學(xué)定律，即被高能量（短波長）的光激發(fā)后發(fā)出低能量（長波長）的光，這種發(fā)光方式也稱為下轉(zhuǎn)換發(fā)光[1-3]。換句話說，這些光學(xué)活性物質(zhì)在高能量光子的激發(fā)下發(fā)出低能量的光子。然而這些遵循Stokes定律的發(fā)光物質(zhì)在體內(nèi)應(yīng)用時會受到諸多干擾因素的影響，比如在可見光區(qū)激發(fā)和發(fā)射會造成嚴(yán)重的生物自發(fā)背景光干擾、光穿透深度低和信噪比差等[4]。基于此，上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)在疾病診斷和醫(yī)學(xué)造影成像等領(lǐng)域表現(xiàn)出原位檢測獨特優(yōu)勢。上轉(zhuǎn)換發(fā)光打破了傳統(tǒng)斯托克斯光學(xué)定律，是一種反斯托克斯（anti-Stokes）位移發(fā)光，其發(fā)光過程是指在低能量光（長波長）激發(fā)下，通過多種轉(zhuǎn)換方式發(fā)射出高能量光（短波長）的發(fā)光過程。這種光學(xué)成像方式可很好地解決上述下轉(zhuǎn)換發(fā)光在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用中的不足。

基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光原理的不同，如圖1 所示可將上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料分為以下4 類，包括鑭系元素?fù)诫s的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料（upconversion nanoparticle，UCNP）、單光子頻率上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料（frequency upconversion luminescence，F(xiàn)UCL）、三重態(tài)-三重態(tài)湮滅上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料（triplettriplet annihilation，TTA）和雙光子吸收發(fā)光材料（two-photon absorption，TPA）[5-8]。上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程還需要一些額外的能量才能實現(xiàn)從低能量光激發(fā)后發(fā)射出高能量光的過程。1946 年，Pringsheim等對這一過程的熱力學(xué)背景進行了激烈的辯論，并最終由Landau 在同年解決了此問題[9]。由于其獨特性，除在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用以外，上轉(zhuǎn)換發(fā)光在太陽能電池、顯示設(shè)備、人工照明、人工光合作用和激光冷卻等領(lǐng)域也受到極大的關(guān)注，并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[10]。上轉(zhuǎn)換熒光成像在生物醫(yī)學(xué)成像方面有很大的應(yīng)用價值，優(yōu)良的上轉(zhuǎn)換發(fā)光可以賦予該類材料多模態(tài)成像、光導(dǎo)藥物遞送和疾病治療等多種用途。本文將介紹它們在不同發(fā)光機制基礎(chǔ)上的應(yīng)用以及反斯托克斯發(fā)光材料的進展，以期為上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料應(yīng)用與研究提供新的思路和方法。

圖1 4 類上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料發(fā)光機制Fig.1 Luminescence mechanisms of four upconversion luminescence materials

1 稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料

稀土元素的外層電子結(jié)構(gòu)非常豐富，外部的電子軌道包括5d、6s 和4f 層，其中4f 層中的電子接受能量后實現(xiàn)的電子躍遷可表現(xiàn)出特征發(fā)光[11]。通過不同敏化劑和激活劑共摻雜于同種基質(zhì)材料內(nèi)實現(xiàn)兩者之間的能量傳遞，激活劑4f 電子層中不同電子輻射躍遷回到基態(tài)所發(fā)射出不同能量的上轉(zhuǎn)換光，可由此實現(xiàn)多色發(fā)光。一般情況下基質(zhì)材料的晶體結(jié)構(gòu)需要與摻雜離子緊密匹配且擁有足夠的透明度讓近紅外光子在晶格中自由遷移。目前已報道的鑭系摻雜的基質(zhì)材料有氟化物、氧化物等，但氟化物基質(zhì)仍然是首選材料。四氟釔酸鈉（NaYF4）是常用的氟化物基質(zhì)，由于聲子能量低和鑭系元素能級匹配，被認(rèn)為是較優(yōu)的基質(zhì)材料之一。通過水熱或溶劑熱等方式可合成得到α、β 兩種晶型的NaYF4納米晶，其中α 相為立方相，相比之下，熱力學(xué)穩(wěn)定的六方相也就是β 相的NaYF4作為基質(zhì)材料表現(xiàn)出更優(yōu)的增強發(fā)光的特性。鑭系元素中，鐿離子（Yb3+）是典型的敏化劑，其表現(xiàn)出單一的激發(fā)態(tài)，可與鈥（Ho3+）、鉺（Er3+）、銩（Tm3+）等眾多鑭系激活劑的f-f 躍遷能級匹配較好，因此Yb3+可向這些鑭系離子有效傳遞能量實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光。該類材料在近紅外光通常是980 nm 或者808 nm 光激發(fā)下，在近紅外至可見光區(qū)發(fā)射出半峰寬較窄的特征電子躍遷發(fā)射峰。借助于這種發(fā)光技術(shù)可實時在動物模型中觀察納米材料在組織臟器內(nèi)的分布情況。合成得到的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料結(jié)構(gòu)通常為球形，也有六方形和棒狀等，粒徑可調(diào)并影響發(fā)光強度，幾百納米粒徑的發(fā)光強度優(yōu)于幾納米粒徑的發(fā)光強度。除此之外，發(fā)光強度還受到結(jié)晶度、基質(zhì)物相、摻雜敏化離子和激活離子濃度等因素的影響[12]。如圖2所示，為了降低發(fā)光淬滅，通常將該類材料制成核殼結(jié)構(gòu)以增強其發(fā)光。還可以通過表面修飾包括聚合物修飾和蛋白修飾等以增加親水性和靶向性，由此在材料表面構(gòu)筑的疏水空腔可作為藥物載體實現(xiàn)高效載藥及可控藥物釋放[13]。以下結(jié)合多種治療方式分述舉例該類材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

圖2 中性聚合物修飾的核殼型稀土納米材料示意圖Fig.2 Basic structure of core-shell rare earth nanomaterial modified by polymer

1.1 用于光動力治療

光動力療法（photodynamic therapy，PDT）發(fā)展至今已近百年，在臨床中對部分疾病尤其是在皮膚類疾病的治療中展現(xiàn)出獨特的治療優(yōu)勢[14]。一般來說，需要一個外部光源來激活光敏劑，將光能傳遞給敏化劑使其產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死。該治療方法具有可重復(fù)給藥、光劑量可控、副作用小以及局部治療等優(yōu)點，可很好地解決常規(guī)三大治療方式（手術(shù)、放療和化療）產(chǎn)生的一些治療局限性[15]。為擴大光動力療法在深層腫瘤中的應(yīng)用并增加其生物相容性，可將上轉(zhuǎn)換納米材料用作能量轉(zhuǎn)換器，將“生物窗口”（700～1 300 nm）的近紅外光上轉(zhuǎn)換為更短波長的光[16]，從而增加光對組織的穿透深度，避免使用紫外光對組織造成的二次傷害。Chan等[17]提出了一種新型的多功能納米核殼結(jié)構(gòu)治療平臺。在該設(shè)計方案中，以NaYF4:Yb/Tm@NaYF4:Yb/Nd 為核殼型稀土納米材料，在其表面修飾聚合物聚賴氨酸（PLL）而顯現(xiàn)出電正性，通過靜電作用與表面帶有負(fù)電荷的石墨氮化碳量子點（CNs）結(jié)合形成復(fù)合納米藥劑（UCNP-PLL@CNs）。基于上轉(zhuǎn)換能量傳遞過程，由核殼結(jié)構(gòu)的稀土納米材料吸收808 nm 近紅外光后發(fā)射出紫外至可見光，再被石墨氮化碳量子點吸收而產(chǎn)生對細(xì)胞有毒的活性氧實現(xiàn)光動力治療。

基于該能量傳遞過程，Guan 等[18]設(shè)計了一種復(fù)合納米粒子（UCNP-PEG-FA/PC70），其中葉酸（FA）配體用于修飾納米顆粒以增強對腫瘤的靶向性和促進內(nèi)化，當(dāng)稀土納米材料將近紅外光轉(zhuǎn)換成紫外可見光時激活一種卟啉結(jié)構(gòu)的光敏劑（PC70），由此可在低氧環(huán)境中產(chǎn)生單線態(tài)氧用于光動力學(xué)治療。再者，Zhang 等[19]等利用核殼結(jié)構(gòu)的納米材料（UCNP@mSiO2）存儲兩種類型的客體分子：可用于化療的阿霉素（DOX）和可用于光動力學(xué)治療的二氫卟吩（Ce6）。通過稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的能量轉(zhuǎn)換可激發(fā)Ce6 產(chǎn)生活性氧聯(lián)合化療對腫瘤產(chǎn)生不可逆損傷。因此，稀土上轉(zhuǎn)換納米材料用于光動力學(xué)治療，主要基于能量傳遞過程實現(xiàn)低能量上轉(zhuǎn)換發(fā)光激活光動力治療中的敏化劑產(chǎn)生活性氧，單獨或聯(lián)合其他治療模式增強腫瘤治療療效。

1.2 用于光熱治療

光熱療法（photothermal therapy，PTT）是一種基于光熱劑，將光能轉(zhuǎn)化為熱能從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不可逆熱損傷而實現(xiàn)熱消融治療的方法[20]。由于稀土離子的消光系數(shù)較低，稀土納米材料在光照下轉(zhuǎn)化為熱能的能力有限，而當(dāng)其與有較強消光系數(shù)的納米粒子，如金（Au）和硫化銅（CuS）等復(fù)合時，可提高光熱療法的有效性。形成復(fù)合結(jié)構(gòu)是將稀土納米材料與光熱性能相結(jié)合的有效方法。通過與CuS 復(fù)合，Zhang 等[21]設(shè)計出粒徑大約120 nm 的透明質(zhì)酸（HA）修飾的UCNP@CuS-HA 復(fù)合材料，實現(xiàn)了超小粒徑的CuS 在腫瘤光熱治療中的協(xié)同應(yīng)用。Cheng 等[22]構(gòu)建了用于分子/磁性雙靶向光熱治療的稀土納米材料，氧化鐵（IONP）多功能納米粒子。在研究中，紫外吸收光譜表明這種納米材料具有較寬的光吸收范圍，其吸收從可見光延伸至近紅外區(qū)，并在近紅外激發(fā)下可以有效地殺死癌細(xì)胞。考慮到在42～45 ℃溫度下，長時間處理可能會損傷正常組織，Zhu 等[23]利用碳?xì)ぃ–arbon）作為光熱劑構(gòu)建核/殼結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)化納米復(fù)合物（NaLuF4:Yb,Er@NaLuF4@Carbon），在實現(xiàn)對體內(nèi)腫瘤有效光熱消融的同時提供溫度反饋，以減少過熱對正常組織的損傷。Xu 等[24]構(gòu)建了一個將上轉(zhuǎn)換納米粒子和染料（IR-1048）共同引入脂質(zhì)適配體納米結(jié)構(gòu)的一體化治療納米平臺（UCILA）。IR-1048 染料移植到脂質(zhì)雙分子層中，可以作為光聲成像、光學(xué)血管成像、光熱成像和第二近紅外窗口光熱治療的治療劑。此外，裝載在UCILA 內(nèi)部的UCNP具有良好的發(fā)光特性和高X 射線衰減系數(shù)，可作為計算機斷層掃描和熱敏上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像的對比劑，實時跟蹤腫瘤代謝活動和溫度反饋。由此可見稀土納米材料與光熱藥劑結(jié)合形成復(fù)合納米藥劑，兩者之間并無能量傳遞等關(guān)系，但仍可發(fā)揮各自的作用實現(xiàn)多模式診斷與協(xié)同治療。

1.3 用于智能載藥治療

構(gòu)筑稀土納米材料藥物傳遞系統(tǒng)最簡單的方法是在納米材料表面包裹中性聚合物、DNA、蛋白等。這些聚合物將為藥物提供一個貯存庫，并有助于保持納米材料的膠體穩(wěn)定性。聚乙二醇（PEG）是最常用的包覆于稀土納米材料的聚合物，因其具有高水溶性和良好生物相容性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用[25-27]。Liu 等[28]以此設(shè)計了一種復(fù)合納米顆粒（UCNPs@MIL-PEG），其中以稀土上轉(zhuǎn)換納米材料為核心，含鐵的金屬有機框架結(jié)構(gòu)（MIL）為殼層，PEG 對其進行進一步修飾。核殼納米粒子可以同時呈現(xiàn)出稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒核的近紅外發(fā)光和含鐵元素殼的T2加權(quán)磁共振成像。隨后，裝載阿霉素的UCNPs@MIL-PEG納米粒子可用于潛在的上轉(zhuǎn)換發(fā)光/磁共振雙模式成像，在協(xié)同成像條件下實現(xiàn)對病灶的精準(zhǔn)診斷并同時實現(xiàn)對藥物的可控釋放，達到對癌癥的精準(zhǔn)診療。由于結(jié)構(gòu)中的PEG 對pH 有響應(yīng)，在pH 為7.4 時，聚合物開始收縮，小的藥物分子很難穿透高密度的PEG 殼，被限制在聚合物基體中。而在pH 為5.8 時，PEG 殼層保持膨脹狀態(tài)，導(dǎo)致小分子化療藥物阿霉素從相對松散的網(wǎng)絡(luò)中順利擴散，可促進藥物在癌癥區(qū)域的快速釋放。因此環(huán)境響應(yīng)型聚合物對納米藥物控釋起到很好的作用。又如Dain 等[29]設(shè)計了NaYF4:Yb/Er@SiO2@P(NIPAM-co-MAA)核/殼結(jié)構(gòu)微球，通過層層設(shè)計創(chuàng)造了一種pH 誘導(dǎo)的熱響應(yīng)藥物控釋體系，實現(xiàn)藥物的可控釋放。此外，再比如將DNA 修飾在稀土納米材料表面，基于DNA 的UCNP 能夠?qū)崿F(xiàn)多種功能，并具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，已有多種DNA 修飾的UCNP 復(fù)合材料被開發(fā)用于診斷和治療。Han 等[30]利用一種DNA 修飾UCNP 顯著提高了納米粒子在高鹽緩沖條件下的穩(wěn)定性。此外，這種DNA 還擁有高載藥能力，可在保持溫度傳感能力，控制靶向抗癌藥物遞送的同時實現(xiàn)深部組織成像。

綜上所述，通過形成復(fù)合結(jié)構(gòu)等方式，鑭系元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換納米晶中融入了光動力治療、光熱治療、藥物遞送與可控釋放等功能。但由于材料的發(fā)光量子效率低和對近紅外光的吸收范圍窄，該類材料在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用尚未得到充分應(yīng)用。通過對發(fā)光機理的深入研究，增強該類材料的發(fā)光效率，可使得稀土上轉(zhuǎn)換材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用得到進一步提升與拓展。

2 單光子頻率上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料

FUCL 是通過激發(fā)基態(tài)的熱振動-旋轉(zhuǎn)能級（St）到第一激發(fā)態(tài)（S1）產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光回到基態(tài)的最低能級（S0）[31]。值得注意的是，頻率上轉(zhuǎn)換發(fā)光是一種典型的單光子過程，而需要將低能光子轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芄庾宇~外的能量是由來自于原始玻爾茲曼分布的熱量提供的[32]。圖3 列出了幾種目前已報道的可作為單光子頻率上轉(zhuǎn)換材料的結(jié)構(gòu)。由于頻率上轉(zhuǎn)換材料是有機小分子，與稀土上轉(zhuǎn)換納米材料相比，表現(xiàn)出相對較高的光吸收率和可調(diào)控的激發(fā)和發(fā)射波長，并具有良好的耐氧性和高效率等優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。

圖3 已報道的幾種單光子頻率上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的結(jié)構(gòu)Fig.3 Some reported structures for single-photon frequency upconversion luminescence

2.1 用于離子檢測

有毒有害的金屬陽離子污染物長期以來對環(huán)境和生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因此建立快捷、高靈敏度、高選擇性的檢測方法是目前研究的一個熱門方向。Liu 等[33]利用特定的銅離子（Cu2+）誘導(dǎo)螺旋內(nèi)酰胺開環(huán)，開發(fā)出了單光子頻率上轉(zhuǎn)換探針（NRh）。該探針在水中對Cu2+具有良好的靈敏度和選擇性，成功地檢測了肝豆?fàn)詈俗冃曰颊吣蜚~水平。Yang 等[34]人設(shè)計合成了含有單硫代螺內(nèi)酯基團的羅丹明衍生物近紅外化學(xué)劑量計（FUC-1）。由于汞和硫原子之間的強結(jié)合，F(xiàn)UC-1 經(jīng)歷了從非熒光硫內(nèi)酯形式到近紅外熒光開環(huán)形式的獨特轉(zhuǎn)變，對二價汞離子和甲基汞都表現(xiàn)出高選擇性和高靈敏性。而Xia 等[35]開發(fā)出的探針（rhodamine B hydrazine,RBH）在不同波長的激發(fā)下能同時發(fā)射上轉(zhuǎn)換熒光和下轉(zhuǎn)換熒光，不僅對亞汞離子具有良好的選擇性，而且對NO2-也有較高的靈敏度。由于有機小分子光學(xué)探針具有可修飾性強和檢測簡便等優(yōu)點，在多學(xué)科領(lǐng)域有良好的應(yīng)用。

2.2 用于生理物質(zhì)檢測

酶在生物體中是一種非常重要的催化劑，它可以使生物體中的化學(xué)反應(yīng)在溫和的條件下有效且持續(xù)地進行。因此利用熒光探針檢測酶含量在疾病診斷中發(fā)揮著重要的作用。Zhu 等[36]制備了一種基于羅丹明衍生物（NRh）和3,4-二硝基苯苯胺的近紅外頻率上轉(zhuǎn)換發(fā)光化學(xué)劑量計，以檢測谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性水平。由于光誘導(dǎo)作用，羅丹明衍生物和鄰雙硝基取代苯胺之間可發(fā)生電子轉(zhuǎn)移過程，這會導(dǎo)致羅丹明熒光猝滅。但是在谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的作用下，谷胱甘肽被硝基取代，在850 nm 光激發(fā)下發(fā)出832 nm的光?；罴?xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的pH 值對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡非常重要，如細(xì)胞增殖、新陳代謝、吞噬作用和酶的活性。Chen 等[37]引入甘露糖改善頻率上轉(zhuǎn)換探針的生物相容性和在水溶液中的溶解度，可以靶向溶酶體，從而靈敏地測定溶酶體中pH 的變化。此外，Dong 等[38]也設(shè)計合成了一種頻率上轉(zhuǎn)換探針用于檢測溶酶體中的pH值，由于該探針內(nèi)酰胺環(huán)開閉結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)換，探針的發(fā)射強度提高了近80 倍。缺氧被認(rèn)為是腫瘤微環(huán)境中使得腫瘤對抗治療的主要因素之一，因此可通過提高局部免疫抑制削弱抗腫瘤免疫應(yīng)答。Li 等[4]構(gòu)建了一個基于花菁結(jié)構(gòu)的硝基還原酶頻率上轉(zhuǎn)換探針（Cy7-NO2），該探針可以在近紅外光的作用下通過對硝基還原酶的檢測與成像，可以對乏氧腫瘤進行檢測與成像。此外，Yu等[39]報道了一種線粒體靶向近紅外探針（NRh-O）用于頻率上轉(zhuǎn)換發(fā)光乏氧成像。在低氧條件下，該探針可被誘導(dǎo)還原成相應(yīng)的胺，具有高靈敏度和選擇性。

2.3 用于生物成像及腫瘤治療

在生物成像和腫瘤診療中，使用低能量近紅外光激發(fā)是首選，這樣可以避免使用紫外光激發(fā)進而避免了對活體生物的光損傷，同時也有利于增加光在組織中的穿透深度并有利于提高信噪比[32]。Liu 等[7]開發(fā)了一個分子熒光團（NRh-1）在體內(nèi)成像，可以在808 nm 激發(fā)下產(chǎn)生730 nm的強近紅外發(fā)射。結(jié)果表明該探針不僅提高了體內(nèi)信噪比，而且相比于稀土上轉(zhuǎn)換材料，可以很容易地在72 h 內(nèi)從體內(nèi)清除。Tian 等[40]設(shè)計合成了一種有機分子上轉(zhuǎn)換敏化劑（FUCP-1）并且首次報道了基于腫瘤內(nèi)部光動力治療的頻率上轉(zhuǎn)換機制。重原子（常用非金屬碘原子）的引入顯著促進激發(fā)態(tài)能級從單重激發(fā)態(tài)向三重激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)變，促進了產(chǎn)生對細(xì)胞有損傷的單線態(tài)氧，可有效抑制腫瘤生長。Zhou 等[41]構(gòu)建了一系列具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光的供體-受體結(jié)構(gòu)的新型硫代吡啶染料，不僅能快速、有效地對骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)的線粒體成像，在成像時還可利用非輻射躍遷實現(xiàn)光能到熱能的轉(zhuǎn)變，因此該物質(zhì)在成像引導(dǎo)下還能產(chǎn)熱對線粒體進行熱損傷達到兼具診療效果。除上述結(jié)構(gòu)外，氟硼熒吡咯結(jié)構(gòu)（BODIPY）具有優(yōu)秀的量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性，因此Jia 等[42]利用水溶性的硅納米顆粒摻雜BODIPY 實現(xiàn)高性能的生物成像且上轉(zhuǎn)換的量子產(chǎn)率達到了6.9%。這些工作擴展了單光子頻率上轉(zhuǎn)換材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，也為這類材料的研究提供了有力的理論依據(jù)。

綜上所述，相比于傳統(tǒng)有機熒光分子的小轉(zhuǎn)換發(fā)光，頻率上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像技術(shù)將具有結(jié)構(gòu)可調(diào)、無光損傷、抗光漂白性好、檢測靈敏度高、穿透深度優(yōu)等特點，在生物成像中極具優(yōu)勢。但該類材料報道較少，對于何種有機染料結(jié)構(gòu)具有頻率上轉(zhuǎn)換特性目前還尚無規(guī)律可循。增加對頻率上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料分子結(jié)構(gòu)和發(fā)光特性的研究可促進該類材料在生物醫(yī)學(xué)檢測與成像中的應(yīng)用。

3 三重態(tài)-三重態(tài)碰撞能量湮滅型上轉(zhuǎn)換材料

三重態(tài)-三重態(tài)碰撞能量湮滅型上轉(zhuǎn)換（TTA）發(fā)光有著非常獨特的光物理過程，其光學(xué)特性為非線性。圖4 列舉了一些常見的TTA材料結(jié)構(gòu)。該組合中主要由兩部分組成，包括了光敏劑（作為一種能量供體）和湮滅劑（作為一種能量受體）。上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程主要基于光敏劑在三重激發(fā)態(tài)將能量傳遞給湮滅劑并由兩個湮滅劑分子在三重激發(fā)態(tài)碰撞產(chǎn)生更高能量的單重激發(fā)態(tài)進而發(fā)射出高能光子。近期，利用三重態(tài)湮滅能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，Askes 等[43]以630 nm 臨床級激光器作為激發(fā)源，構(gòu)建了具有藍光發(fā)射的聚乙二醇化脂質(zhì)體復(fù)合物，該研究結(jié)果有效地驗證了雙組份能量轉(zhuǎn)移上轉(zhuǎn)換發(fā)光復(fù)合物可實際應(yīng)用。此外Li 等[44]構(gòu)筑了一種上轉(zhuǎn)換發(fā)光的比率型溫度探針。該探針是采用了一種對溫度敏感的雙親性聚合物同時包裹光敏劑與湮滅劑而形成基于能量湮滅轉(zhuǎn)移的納米膠束。研究結(jié)果表明上轉(zhuǎn)換的發(fā)光比率對溫度具有較靈敏的響應(yīng)，并在一定范圍能呈現(xiàn)出線性范圍，可用于納米測溫。在性能優(yōu)異的同時還具有較好的對空氣的低敏感性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。因此，通過封裝技術(shù)制備上轉(zhuǎn)換比率型的納米光學(xué)溫度探針，可以很好的消除生物背景干擾，在生物體的高靈敏局域成像和疾病診療中有著潛在的研究和臨床價值。

圖4 典型的三重態(tài)-三重態(tài)碰撞能量湮滅型上轉(zhuǎn)換材料的光敏劑與湮滅劑Fig.4 Typical sensitizer and annihilator structures of triplettriplet annihilation type upconversion energy transfer material

對于構(gòu)筑TTA 發(fā)光體系通常要求有機光敏劑中存在重原子，利用重原子效應(yīng)引起強自旋軌道耦合，可有效地實現(xiàn)系間穿越并增加到達三重激發(fā)態(tài)的幾率。構(gòu)筑TTA 上轉(zhuǎn)換發(fā)光體系，還要求光敏劑和湮滅劑之間具有匹配的三重激發(fā)態(tài)能級。該發(fā)光過程還受到分子氧的影響，其光敏劑和湮滅劑的三重激發(fā)態(tài)對分子氧敏感，可淬滅上轉(zhuǎn)換過程。為了克服這一限制，應(yīng)設(shè)計具有高阻隔性能的抗氧保護機制。Huang 等[45]利用上述特性開發(fā)了TTA 核殼結(jié)構(gòu)的前藥物傳遞納米顆粒，該納米顆粒包含預(yù)載TTA 分子的介孔二氧化硅納米顆粒為核心，封裝抗癌前藥分子的兩親性聚合物為外殼。系統(tǒng)中強烈的TTA 上轉(zhuǎn)換藍光在遠(yuǎn)紅光刺激下激活抗癌前藥分子，在體內(nèi)表現(xiàn)出有效的腫瘤生長抑制作用。同樣，Lv 等[46]將前藥和光敏劑封裝在兩親性嵌段共聚物高分子膠束中免受氧分子的攻擊，有效地釋放藥物用于癌癥治療。這些工作不僅為癌癥治療提供了一個新的納米平臺，也為新的有機TTA 上轉(zhuǎn)換技術(shù)應(yīng)用于腫瘤診療奠定了基礎(chǔ)。

TTA 上轉(zhuǎn)換發(fā)光體系是光敏劑和湮滅劑通過碰撞，實現(xiàn)能量傳遞發(fā)出上轉(zhuǎn)換光，因此該體系的發(fā)展受到光敏劑和湮滅劑研究的雙重制約。此外，該上轉(zhuǎn)換發(fā)光體系對氧敏感，用于生物成像或檢測藥物遞送時，需要使用聚合物等包裹技術(shù)實現(xiàn)與氧氣隔離，這也是限制該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此，如何提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率、開發(fā)更多的TTA 發(fā)光體系和隔絕氧氣的封裝技術(shù)均是本領(lǐng)域的研究熱點與難點。這些技術(shù)的進步與發(fā)展將有助于推動TTA 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

4 雙光子吸收材料

此外，許多金屬配合物具有重原子效應(yīng)，可有效實現(xiàn)系間穿越過程，促進體系內(nèi)的單重態(tài)到三重態(tài)的躍遷。例如Zhao 等[53]開發(fā)了一種多肽偶聯(lián)靶向腫瘤細(xì)胞中線粒體的Ru（II）光敏劑（RuC-RGD）。研究結(jié)果表明，RuC-RGD 在癌細(xì)胞的線粒體中大量積累而且觸發(fā)了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，顯示了良好的雙光子PDT 特性。因為癌細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）水平明顯高于正常細(xì)胞，Zeng 等[54]報道一種新的GSH 激活的雙核Ru（II）復(fù)合物作為雙光子光動力治療的光敏劑，因配體具有很強的吸電子性導(dǎo)致熒光猝滅，而GSH 是可以通過還原偶氮配體來大大提高Ru(II)配合物的發(fā)光性能，在癌癥治療中表現(xiàn)出良好的光毒性。與Ru(II)配合物相比，銥(III)配合物具有更高的配體場強和更強的自旋軌道耦合。Tian 等[55]探索了一系列環(huán)金屬銥(III)配合物的雙光子光動力抗癌活性，該配合物的配體被推/拉電子基團取代，以調(diào)節(jié)其電子性質(zhì)和生物親和力。結(jié)果顯示，銥(III)配合物可在線粒體中定位并在癌細(xì)胞中表現(xiàn)出較高的光毒性。

此外，細(xì)胞內(nèi)黏度變化也可用于觸發(fā)探針，實現(xiàn)響應(yīng)型檢測。Zhang 等[56]構(gòu)建了兩個對細(xì)胞內(nèi)黏度變化響應(yīng)的可用于檢測的雙光子成像探針。其中一個探針（Lyso-TA）不但在細(xì)胞中動態(tài)監(jiān)測到溶酶體的融合與遷移，還監(jiān)測到了可自噬的線粒體。該探針可以在簡單的室溫反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為另一種探針（Mito-QA）用于研究線粒體的功能紊亂與失控。細(xì)胞在環(huán)境的有害刺激下產(chǎn)生氧化應(yīng)激時，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶含量會明顯上調(diào)。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平的檢測對于腫瘤細(xì)胞的鑒定和細(xì)胞氧化應(yīng)激的研究具有重要意義。Du 等[57]構(gòu)建了一種新型的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶雙光子熒光探針（Glu-TPAN），通過將S 構(gòu)型谷氨酸連接在熒光染料的萘環(huán)上，使得染料的發(fā)光被抑制。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶可以特異性切斷谷氨酸，恢復(fù)熒光染料結(jié)構(gòu)，并且產(chǎn)生強烈的雙光子熒光信號。該探針通過檢測細(xì)胞內(nèi)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶含量，可以準(zhǔn)確區(qū)分正常細(xì)胞與癌細(xì)胞，同時能夠檢測細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。

然而在實際應(yīng)用中，TPA 要想能夠?qū)崿F(xiàn)良好的空間限域激發(fā)效果，激發(fā)光源通常采用功率密度很高的飛秒脈沖激光器，在價格上比較昂貴且被激發(fā)的染料分子往往需要具有較大的雙光子吸收截面，此類染料的種類并不多，所以TPA效應(yīng)存在一定的應(yīng)用局限性。如何優(yōu)化雙光子吸收上轉(zhuǎn)換各能量傳遞過程并降低能量損失以獲得大的反斯托克斯位移與高的上轉(zhuǎn)換效率是該領(lǐng)域的研究難點與熱點。

5 展 望

生物光學(xué)成像就是通過光學(xué)技術(shù)并利用直觀的圖像表達小到微觀細(xì)胞大到生物體中的特定區(qū)域的信息分子，對其進行實時監(jiān)控、功能測定等。由于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)有效消除了生物組織的自發(fā)熒光，可獲取高靈敏和低噪音的高質(zhì)量成像圖像，是一種理想的生物成像方式。這種成像方式的光源通常在可見光至近紅外波長范圍且波長可調(diào)、激發(fā)光功率低、對活體組織幾乎沒有損害，在生物醫(yī)學(xué)疾病診斷與治療領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。除此之外，上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)還易于與其他生物成像或治療技術(shù)復(fù)合，通過構(gòu)建復(fù)合納米材料實現(xiàn)診療多功能化。雖然這種技術(shù)具有很多的優(yōu)點，但如何提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率并開發(fā)多種上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料一直是該領(lǐng)域中的研究熱點與難點。通過技術(shù)的積累，上轉(zhuǎn)換光學(xué)成像正飛速發(fā)展?？梢灶A(yù)見該類材料將在疾病診斷、基因篩查、蛋白質(zhì)分析、生物評價、新藥篩選、在體實時成像等生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。