李曉波 王 吉 王莎莎 李 威 秦 驍 黃宗文 岳秉飛 王淑菁 付 瑞

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)

鴿圓環(huán)病毒(pigeon circovirus, PiCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無囊膜，直徑約20 nm，基因組為單鏈環(huán)狀DNA，大小約為2.0 kb，包含兩個主要開放讀碼框架(ORFs)：V1和C1，前者編碼病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白，后者編碼病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白[1-2]。PiCV既可通過排泄物水平傳播也可通過垂直傳播[3]，是導(dǎo)致幼鴿疾病綜合征(young pigeon disease syndrome, YPDS)的病原體之一，患病鴿多為2～12月齡青年鴿，典型癥狀包括嗜睡、體質(zhì)量減輕、厭食、作物反流、多飲和腹瀉等，病毒也可破壞鴿的免疫系統(tǒng)，使其容易再次感染多種條件致病病原體，引起免疫器官衰退，導(dǎo)致氣管、肝、肺及腸道的炎癥等病理改變[2,4]。

目前PiCV還未能通過體外細(xì)胞成功培養(yǎng)增殖，因此主要依靠PCR方法檢測其抗原[5-6]，本研究選取其polymerase基因保守序列設(shè)計引物探針，建立了TaqMan探針實時熒光定量PCR(FQ-PCR)方法，可實現(xiàn)鴿樣本中PiCV靈敏特異性的檢測。

1 材料和方法

1.1 試劑

FQ-PCR引物探針由ABI公司合成，TaqMan Universal PCR Master Mix為ABI產(chǎn)品；病毒核酸提取試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 病毒株和樣品

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，禽腺病毒 I 型、III 型(FAdv I、III)，禽白血病病毒(ALV)，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)均購自中國獸藥監(jiān)察所；40份鴿肝、脾、肺、法式囊及36份鴿盲腸樣本均采自北京某養(yǎng)殖場。

1.3 方法

1.3.1引物設(shè)計：選擇鴿圓環(huán)病毒(Genbank：NC_002361)基因保守序列設(shè)計引物和探針，序列見表1。

表1 PiCV FQ-PCR引物探針信息Table 1 Primers and probes for PiCV FQ-PCR

1.3.2病毒核酸的提取：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，禽腺病毒I型、III型，禽白血病病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生性病毒，各取0.2 mL病毒液按試劑盒說明提取核酸，最后用150 μL滅菌水洗脫。

1.3.3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備：由上海生工合成PiCV(Genbank：NC_002361)全長(1～2 037 bp)DNA序列，轉(zhuǎn)入pUC57質(zhì)粒，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-PiCV，經(jīng)測定其濃度為3.48×1010copies/μL。

1.3.4PiCV FQ-PCR擴增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：對引物、探針濃度、退火溫度等條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探針(10 μmol/L)0.2 μL，DNA模板1 μL，滅菌ddH2O補足至終體積20 μL。反應(yīng)程序為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；40個循環(huán)。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-PiCV 10倍系列稀釋為3.48×107～3.48 copies/μL，以其為模板，按上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行PCR擴增，每個稀釋度做3 個平行，選取線性較好的7 個稀釋度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5PiCV FQ-PCR方法的敏感性驗證

1.3.5.1 FQ-PCR方法檢測限的驗證：以3.48×107～3.48 copies/μL 10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用優(yōu)化好的反應(yīng)條件進行檢測，每個稀釋度做3個平行，驗證該方法所能檢測的最低質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.3.5.2 與常規(guī)PCR方法敏感性比較：3.48×107～3.48 copies/μL 10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，使用PiCV FQ-PCR方法及文獻報道的常規(guī)PCR法分別進行擴增[7]，比較FQ-PCR方法與常規(guī)PCR方法的敏感性。

1.3.6PiCV FQ-PCR方法特異性驗證：用建立的熒光定量PCR法檢測同為圓環(huán)病毒科的豬圓環(huán)病毒2型及禽腺病毒 I 型、III 型，禽白血病病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒等禽源病毒，驗證方法的特異性。

1.3.7PiCV FQ-PCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性驗證：應(yīng)用優(yōu)化好的反應(yīng)條件，以濃度為3.48×105和3.48×104copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進行FQ-PCR擴增，每個濃度設(shè)置6個重復(fù)，同時選擇不同的3個時間點檢測，計算組內(nèi)和組間Ct值及定量拷貝數(shù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

1.3.8PiCV FQ-PCR方法的應(yīng)用：取鴿肝、脾、肺、法式囊樣本各40份，盲腸36份，提取DNA，用建立的PiCV FQ-PCR方法檢測。

2 結(jié)果

2.1 PiCV熒光定量PCR擴增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用優(yōu)化好的體系擴增3.48×107～3.48×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，各稀釋度擴增曲線間距均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線Slope為-3.381(-3～-3.5)，R2值為1(>0.99)，擴增效率為97.61%(90%～105%)(圖1)。

圖1 PiCV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 PiCV FQ-PCR standard curve

2.2 PiCV FQ-PCR方法的敏感性驗證

如圖2A所示，3.48×107～3.48×101copies/μL各稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)S型擴增曲線，而3.48 copies/μL的3個平行實驗有1個未出現(xiàn)S型擴增曲線，說明本方法最低可定量檢測34.8 copies/μL的樣品。用常規(guī)PCR方法檢測同樣的3.48×107～3.48×101copies/μL系列稀釋的PiCV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，由圖2B可見，常規(guī)PCR最低可檢測到3.48×103copies/μL，表明PiCV FQ-PCR方法敏感性比常規(guī)PCR方法高兩個數(shù)量級。

A：PiCV熒光定量PCR敏感性；B：PiCV常規(guī)PCR敏感性；1～8：PiCV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為3.48×107～3.48 copies/μLA:The sensitivity of PiCV FQ-PCR; B: The sensitivity of PiCV conventional PCR；1-8:The concentration of PiCV plasmid standard is 3.48×107～3.48 copies/μL respectively圖2 PiCV熒光定量PCR方法與常規(guī)PCR方法敏感性比較Fig.2 Comparison of sensitivity between PiCV FQ-PCR and conventional PCR

2.3 PiCV FQ-PCR方法的特異性驗證

圖3顯示，當(dāng)以PiCV為模板時，出現(xiàn)FAM熒光擴增曲線，以豬圓環(huán)病毒2型，禽腺病毒 I 型、III 型，禽白血病病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生性病毒為模板均無明顯擴增曲線。表明所建立的熒光定量PCR法特異性強，與其他病毒均無交叉反應(yīng)。

注：1～7分別為PiCV，豬圓環(huán)病毒2型，禽腺病毒I型、III型，禽白血病病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒及陰性對照Note: 1-7: PiCV、PCV2、FAdv I、FAdv III、ALV、REV and negative control圖3 PiCV熒光定量PCR方法特異性驗證擴增曲線Fig.3 PiCV FQ-PCR specificity test amplification curve

2.4 PiCV FQ-PCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性驗證

用建立的FQ-PCR方法檢測3.48×105和3.48×104copies/μL兩個濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，由表2可見，其Ct值及定量拷貝數(shù)組內(nèi)變異系數(shù)為0.08%～1.63%，組間變異系數(shù)為5.10%～7.23%，均小于10%，表明方法的重復(fù)穩(wěn)定性良好。

表2 PiCV FQ-PCR方法的重復(fù)穩(wěn)定性驗證結(jié)果Table 2 Repeatability verification results of PiCV FQ-PCR

2.5 PiCV FQ-PCR方法的應(yīng)用

用建立的PICV FQ-PCR方法對鴿肝、脾、肺、法式囊樣品各40份，盲腸樣品36份進行檢測, 肝PiCV陽性率為97.5%(39/40)、脾、肺、法式囊PiCV陽性率均為100%(40/40)，盲腸PiCV陽性率為97.2%(35/36)。肝、脾、肺、法式囊及盲腸病毒含量中位數(shù)(Q1，Q2)分別為3.39×104(2.61×102，2.69×106)，9.53×104(4.74×102，3.90×106)，4.61×104(1.10×103，4.87×105)，3.34×105(5.54×103，1.80×107)，2.69×104(1.82×103，1.15×106)，經(jīng)卡方檢驗，各組織PiCV含量無顯著差異(P>0.05)。對陽性樣本進行PCR擴增測序，與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，顯示與鴿圓環(huán)病毒JF2/JiangSu/2014株同源性最高，一致率為97.85%。

3 討論

熒光定量PCR方法具有靈敏度高，耗時少，特異性強等優(yōu)點，可實現(xiàn)對病原體的快速精準(zhǔn)檢測[8-9]，本研究通過比對NCBI PiCV各分離株序列，選取其polymerase基因保守序列設(shè)計引物和探針，建立了PiCV的熒光定量PCR檢測方法。經(jīng)驗證，在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為3.48×107～3.48×101copies/μL范圍，產(chǎn)生的熒光CT值與質(zhì)粒濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2值為1，擴增效率為97.61%，表明建立的FQ-PCR方法可實現(xiàn)對PiCV的有效定量。用與PiCV同屬的豬圓環(huán)病毒2型及其他禽源病毒，如禽腺病毒、禽白血病病毒等對照病毒進行方法特異性驗證，對照病毒均未出現(xiàn)擴增信號，表明該方法特異性良好；用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行方法敏感性驗證，最低可檢測到的質(zhì)粒濃度為34.8 copies/μL，用傳統(tǒng)PCR方法和建立的FQ-PCR方法擴增同一批系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，傳統(tǒng)PCR方法的檢測限為3.48×103copies/μL，檢測敏感性比FQ-PCR方法低2個數(shù)量級；以兩個不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性進行驗證，其Ct值及拷貝數(shù)值的變異系數(shù)低于2%，批間3個不同時間測定值的變異系數(shù)低于10%，表明該方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

據(jù)報道，鴿群中PiCV的感染率大約為70%，PiCV主要侵染法式囊、脾、胸腺等免疫器官，還可侵染肺、肝、腸、氣管、腎等組織[4,10-14]，本研究用所建立的熒光定量PCR方法對40只鴿的肝、脾、肺、法式囊及盲腸等樣本進行檢測，對方法進行應(yīng)用研究，結(jié)果顯示肝PiCV陽性率為97.5%(39/40)，脾、肺、法式囊陽性率均為100%，這些鴿子來自北京某養(yǎng)殖場，反映出北京地區(qū)鴿群中PiCV有較高的感染率，而這40只鴿子均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，表明PiCV在鴿群中呈隱性感染，這與文獻結(jié)果一致[2,13]；各組織的PiCV定量結(jié)果顯示，法式囊的病毒含量均值雖然比肝、脾、肺及盲腸高兩個數(shù)量級，但由于其個體含量差異較大，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，各組織病毒含量無顯著差異(P>0.05)；對陽性PCR產(chǎn)物進行序列分析，顯示與江蘇株的同源性最高。

目前實驗用鴿還未出臺相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)，本實驗建立的PiCV FQ-PCR檢測方法敏感性高，特異性及穩(wěn)定性好，可有效檢測到鴿組織樣本中的PiCV，為制定實驗用鴿相關(guān)的微生物標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支持和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。