任哲郯 謝雨瑤 劉安琪

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1.第一臨床醫(yī)學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，錦州 121000)

心血管疾病 (cardiovascular disease，CVD) 是迄今為止世界上的主要死因，每年造成1 770萬人死亡[1]。而我國心力衰竭發(fā)生率居高不下：25歲以上患病率1.1%，總數(shù)超過1 200萬，主要病因?yàn)楦哐獕杭肮谛牟2]。因此心血管疾病的防控仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。一系列損害心室血液充盈或流出的結(jié)構(gòu)或功能障礙可導(dǎo)致心力衰竭 (heart failure, HF)[3]。心力衰竭作為具有多種病因及各種因素影響的臨床綜合征，由于缺乏對發(fā)病率、普遍性和預(yù)后的可靠的基于人群的估計(jì)，一直沒有辦法做到準(zhǔn)確評估HF的程度[4-5]。斑馬魚胚胎期的心臟發(fā)育很迅速，心臟功能容易觀察和量化。對于反向遺傳學(xué)，通過使用嗎啉反義寡核苷酸和CRISPR-Cas9來調(diào)控基因功能，使斑馬魚成為基因選擇性表達(dá)的主要動物模型之一[6]。斑馬魚有很強(qiáng)的心臟再生能力，它們的心肌細(xì)胞能夠通過再生恢復(fù)到不成熟狀態(tài)，然后增殖并替換受損的心臟組織[7]。然而，利用斑馬魚模型來增加對心力衰竭和心臟重塑(包括心臟肥大和增生)的了解，卻沒有得到應(yīng)有的重視。本文將會系統(tǒng)回顧藥物誘導(dǎo)斑馬魚心力衰竭疾病模型的方法，并對其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行對比，以期為斑馬魚模型在研究人類心力衰竭機(jī)制和治療提供新思路。

1 斑馬魚模型可作為人類心力衰竭模型

在過去的研究中，斑馬魚已經(jīng)成為研究心臟疾病的一個強(qiáng)大的脊椎動物模型。越來越多地被用來研究發(fā)育、解剖和生理學(xué)，通過遺傳學(xué)、藥理學(xué)和其他醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[7]，構(gòu)建斑馬魚模型的優(yōu)勢越來越明顯(表1)。斑馬魚模型雖然有些不足之處，但因其具有作為人類心血管疾病模型的諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于人類心血管疾病的病理生理機(jī)制的研究(表2)。斑馬魚的心肌細(xì)胞再生能力和電生理特點(diǎn)也使其成為在心肌損傷和心力衰竭治療的重要突破口。

表1 斑馬魚作為人類一般疾病模型的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of zebrafish as a general disease model in humans

表2 斑馬魚作為人類心血管疾病模型的優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 Advantages and disadvantages of zebrafish as a model for human cardiovascular disease

2 藥物誘導(dǎo)的斑馬魚心力衰竭模型

2.1 異丙腎上腺素

已知β-腎上腺素能受體(β-AR)信號在人類HF中失調(diào)。在嚙齒類動物中，異丙腎上腺素 (isoproterenol, ISO, 又名喘息定) 的急性或慢性β-AR激活會導(dǎo)致心肌損傷,導(dǎo)致心臟功能障礙和心室重構(gòu)，有研究[11-13]依據(jù)此建立了HF模型。在成年斑馬魚中，ISO連續(xù)給藥14 d會引起類似于哺乳動物的嚴(yán)重收縮性心臟功能障礙，伴隨著β-AR成分的轉(zhuǎn)錄變化、ANP和BNP基因表達(dá)的增加、細(xì)胞死亡增加、炎性反應(yīng)加劇和心肌細(xì)胞對Ca2+處理受損等[14]。然而，與哺乳動物模型不同的是，斑馬魚模型沒有檢測到心肌細(xì)胞的纖維化。在胚胎斑馬魚中，ISO連續(xù)給藥5 d誘導(dǎo)收縮性心臟功能障礙以及ANP和BNP基因表達(dá)的增加[14]。因此，給予胚胎和成年斑馬魚ISO刺激對于心臟肥大、心臟重塑和HF的病理生理機(jī)制的研究是可行的。

2.2 去氧腎上腺素

去氧腎上腺素 (phenylephrine, PE, 又名新福林) 是選擇性α1-腎上腺素能受體激活劑。給予小鼠PE會增加血壓并通過增加心室后負(fù)荷導(dǎo)致心臟肥大[15]。用PE處理離體培養(yǎng)成年斑馬魚心臟會誘導(dǎo)其肥大[16]。用鬼筆環(huán)肽染色的肌動蛋白和胚胎心外膜標(biāo)志物WT1提示，經(jīng)PE處理的離體成年斑馬魚心臟可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和心外膜增生。這種離體培養(yǎng)成年斑馬魚心臟肥大模型類似于哺乳動物模型，因其實(shí)驗(yàn)條件簡單，可能在某種程度上為研究心臟肥大提供優(yōu)勢。

2.3 馬兜鈴酸

馬兜鈴酸 (aristolochic acid, AA) 是一種常見于馬兜鈴科開花植物中的化學(xué)物質(zhì)。AA是一種中草藥成分，已知對多種器官有毒性[17]。在胚胎斑馬魚中,給予AA會導(dǎo)致心臟肥大和心肌收縮力逐漸減弱。這種病理變化是對動物模型及人類有嚴(yán)重生命危險[18]。取經(jīng)AA處理的胚胎斑馬魚樣本，進(jìn)行石蠟包埋切片染色，電子顯微鏡鏡檢顯示心內(nèi)膜丟失、心肌細(xì)胞肥大和心臟纖維紊亂[17]。該作者還展示了該模型在藥物發(fā)現(xiàn)方面的潛力，并確定了3種可減弱HF的化合物：絲裂原活化蛋白激酶1(MEK-1)、查耳酮衍生物C25和酚類化合物A11[19]。另一項(xiàng)使用相同AA誘導(dǎo)的HF模型的研究表明，使用恩格列凈，一種鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)抑制劑,用于治療II型糖尿病和HF，減弱心臟形態(tài)變化，并降低ANP和BNP基因表達(dá)以及胚胎斑馬魚的病死率[20]。

2.4 多環(huán)芳烴

污染導(dǎo)致的多環(huán)芳烴 (polycyclic aromatic hydrocarbons, PAH) 暴露與心臟病變有關(guān)，例如心臟肥大、心律失常和收縮功能障礙[21]。在斑馬魚中，胚胎發(fā)育過程中接觸多環(huán)芳烴也具有心臟毒性，并對心臟發(fā)育產(chǎn)生不利影響。高環(huán)多環(huán)芳烴、苯并(a)芘 (benzoapyrene, BaP) 在高濃度下會導(dǎo)致心動過緩和心包水腫[23]。有實(shí)驗(yàn)[18]說明，胚胎斑馬魚發(fā)育過程中暴露于低劑量BaP會導(dǎo)致成年斑馬魚心臟肥大，表現(xiàn)為心臟重量與體質(zhì)量比增加、心臟中膠原蛋白沉積以及ANP、BNP和原癌基因c-Myc的表達(dá)升高。同樣，胚胎斑馬魚短暫暴露于低濃度原油會影響后期的心臟功能[22]。

2.5 鹽酸苯肼

鹽酸苯肼 (phenylhydrazine hydrochloride, PHZ) 是一種小分子，可通過裂解紅細(xì)胞引起貧血[24]。有研究[25]證明，慢性貧血導(dǎo)致成年斑馬魚的肥大和增生導(dǎo)致心臟肥大。給予成年斑馬魚PHZ 5周后，短軸縮短率降低，心室直徑增加[26]。然而，由于斑馬魚具有從HF中恢復(fù)的巨大能力，因此在停止給予PHZ 3周后，心臟功能恢復(fù)到給藥前水平。因此，該模型可用于研究心臟修復(fù)機(jī)制。

2.6 維拉帕米

維拉帕米(又名異搏定)是一種鈣通道阻滯劑，用于治療心律失常、高血壓和心絞痛。過量服用維拉帕米會導(dǎo)致人類HF。有研究[27]開發(fā)了一種用于藥物篩選的維拉帕米誘導(dǎo)的胚胎斑馬魚HF模型。給予維拉帕米可引起胚胎斑馬魚心包水腫和靜脈淤血，心輸出量和血流速度降低[27]。該模型通過測試8種人類HF藥物的療效進(jìn)行驗(yàn)證，這些藥物對斑馬魚HF模型均顯示出顯著的治療效果[27]。因此，這種胚胎斑馬魚HF模型可用于體內(nèi)藥物篩選。

2.7 托特羅定

托特羅定是一種M毒蕈堿受體拮抗劑，有研究[28]已確定其為斑馬魚胚胎心臟傳導(dǎo)的抑制劑。托特羅定治療會導(dǎo)致心率減慢、心包水腫和心律失常。此外，它還誘導(dǎo)Tbx18基因的表達(dá)，這對于心肌細(xì)胞分化為起搏細(xì)胞至關(guān)重要。用托特羅定靶向抑制M受體可能會在人類心臟中誘導(dǎo)新的起搏細(xì)胞并改善心律失常起到一定作用[28]。因此，該模型可用于研究心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。

2.8 特非那定

特非那定是一種常用的H1受體阻斷藥，用于治療過敏。然而，特非那定治療過敏常常伴有發(fā)生心律失常的風(fēng)險。有研究[29]開發(fā)了特非那定誘導(dǎo)胚胎斑馬魚的擴(kuò)張性心肌病DCM模型。給予特非那定后，胚胎斑馬魚表現(xiàn)出循環(huán)血量減少、心率和心肌收縮力降低、房室傳導(dǎo)阻滯、心包水腫和心室體積擴(kuò)大[29]。此外，心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，BNP基因表達(dá)增加。這種快速而簡單的模型可用于非缺血性HF的藥物篩選和毒性測定。

2.9 蒽環(huán)類藥物

蒽環(huán)類藥物是常用的抗癌藥物，具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，這其中就包括嚴(yán)重的心臟毒性。有研究[30]已經(jīng)在胚胎斑馬魚中研究了蒽環(huán)類藥物對心臟發(fā)育的毒性，其對心臟的影響與哺乳動物模型相似。阿霉素是一種高效的蒽環(huán)類化療藥物，有研究[31]利用阿霉素誘導(dǎo)胚胎斑馬魚的CM心肌病模型概括了人類患者中觀察到的心肌細(xì)胞凋亡和收縮力下降。該模型可用于篩選心臟保護(hù)藥物和研究心臟保護(hù)機(jī)制。

3 討論

心功能不全分為兩種類型，其一是常見于冠心病和心肌病等引起的心臟收縮力降低【射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭 (heart failure with a reduced ejection fraction, HFrEF)】，另一類是常見于高血壓伴左室肥厚和肥厚型心肌病等引起的心肌舒張功能異?！旧溲?jǐn)?shù)保留的心力衰竭 (heart failure with preserved ejection fraction, HFpEF)】[32]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，HFpEF正在成為HF的主要存在形式[33]。HFpEF的病因尚不完全清楚，并且缺少改善預(yù)后的藥物。因此，在構(gòu)建HF動物模型時，盡可能準(zhǔn)確地表述不同的心功能不全類型非常重要。目前，斑馬魚HF模型仍然不能準(zhǔn)確區(qū)分心臟收縮或舒張功能障礙。然而，隨著超聲動態(tài)心動圖的發(fā)展和可用性，成年斑馬魚HF亞型的特征變得越來越普遍[34-36]。而在成年斑馬魚超聲動態(tài)心動圖中，建立一套完整標(biāo)準(zhǔn)化成像條件(麻醉、水溫等)指南和表征心臟功能的標(biāo)準(zhǔn)等對于HF亞型分型顯得尤為重要。另外，目前胚胎斑馬魚HF模型在說明HF亞型分型中也有一定進(jìn)展[37]。

隨著心臟負(fù)荷的逐漸增大，心臟重塑也在緩慢發(fā)展。成人心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不能隨著壓力的增大而數(shù)量增加。相反，心肌細(xì)胞的體積會發(fā)生代償性增大(心臟肥大)來維持足夠的心臟功能滿足機(jī)體的需求。隨著時間的推移，這種適應(yīng)性肥大變得不適應(yīng)并通過許多分子信號通路發(fā)展為HF，這其中的機(jī)制在很大程度上仍然不清楚[38-39]。目前已知這些導(dǎo)致心臟重塑的機(jī)制包括細(xì)胞生長和增殖調(diào)控、基因表達(dá)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞代謝、線粒體功能、纖維化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子處理受損、細(xì)胞死亡等[40]。心臟肥大對機(jī)體是有益的還是有害的問題目前仍不清楚[41]。與人類不同，斑馬魚的心臟能夠通過心肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞大小的增大(肥大)來應(yīng)對心臟負(fù)荷的增大，這為心臟重塑研究提供了新思路。而且胚胎斑馬魚心臟中心肌細(xì)胞數(shù)量和大小的量化相對簡單。這使得斑馬魚成為研究代償性與失代償性心臟重塑具體機(jī)制的重要模型。

4 結(jié)論

本文系統(tǒng)回顧了藥物誘導(dǎo)斑馬魚心血管疾病模型的方法。這對于斑馬魚作為人源化動物模型具有十分重要的意義，斑馬魚模型目前已用于體內(nèi)高通量藥物和藥物毒性的篩選、藥物誘導(dǎo)的心臟毒性以及納米顆粒作為載體對于機(jī)體毒性的研究[42-43]。并且，在心電圖中藥物對QT間期的影響也顯示出人和斑馬魚之間良好的相關(guān)性[44]。在胚胎斑馬魚HF模型中，用于治療HF的藥物已被證明可以預(yù)防急性HF[45]。另外，基于斑馬魚體積小、繁殖速度快等特點(diǎn)，一些物理構(gòu)建模型的方法也有待探究。因此，相信在不久的未來，斑馬魚模型將會在各個領(lǐng)域?yàn)槿祟惣膊〉难芯孔龀鼍薮筘暙I(xiàn)。