向健偉，徐曉瑩，周 志，1b，黃建國，馬 瓊，1b

（1.湖北民族大學，a.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室；b.生物科學與技術學院，湖北恩施 445000；

2.西南大學資源環(huán)境學院，重慶 400715）

松乳菇（Lactarius deliciosus）又稱松樹菌、松毛菌等，為擔子菌亞門層菌綱傘菌目紅菇科乳菇屬的食用菌。松乳菇屬于外生菌根型真菌，不僅味道鮮美，而且具有一定的保健補益作用。但由于其獨特的生長方式，松乳菇只能與松樹的根系共生形成外生菌根，才能發(fā)育成成熟的子實體，因此松乳菇離體人工栽培有難度。目前市售松乳菇主要以野生采摘為主，而近年來松乳菇的市場需求量不斷增加，野生采摘力度也在加大，這在一定程度上造成了生態(tài)環(huán)境的污染和松乳菇資源的破壞［1］。

隨著野生松乳菇產量的逐年下降，人工栽培松乳菇在未來將成為生產松乳菇的趨勢。野生松乳菇的人工栽培馴化最初見于1940年Elias等［2］研究了生物素與根瘤對根系共生型真菌的生長影響，探究了松乳菇的離體培養(yǎng)技術。由于松乳菇子實體化過程中特殊的營養(yǎng)需求和生態(tài)需求，松乳菇由菌絲體階段轉化為子實體階段仍存在難點。為此，本文從松乳菇培養(yǎng)的生態(tài)分布、營養(yǎng)需求、人工栽培技術等方面，研究了目前松乳菇人工栽培技術的發(fā)展現狀，以期為松乳菇的人工栽培提供新思路。

1 松乳菇生態(tài)需求

1.1 空間分布

松乳菇空間分布范圍廣，在野生環(huán)境中松乳菇需要與松樹根系共生，因此在多年樹齡的松林均可發(fā)現其蹤影。從地理位置看，松乳菇在亞熱帶、溫帶分布較為豐富，尤其在北半球范圍較廣。中國多省份均有松乳菇的分布，總體上主要分布在長江中下游地區(qū)。在云南、貴州、湖北、湖南、安徽等地區(qū)，松乳菇更為常見［3，4］。

1.2 生境需求

松乳菇通常以單生或者群生的方式與松科植物形成共生根系，因此植被類型是影響松乳菇生態(tài)分布的主要因素。通過對松乳菇生長地植被類型的實地調查結果來看，在野生松乳菇生長的森林中，植物區(qū)系豐富，表現出喬木、灌木、草本植物、苔蘚的錯綜交雜，在針葉林、針葉闊葉混交林中均有松乳菇分布，但是在這類森林中主要以松屬類植物為主，尤其是馬尾松、黃山松、油松居多［3，4］。松乳菇生長地的降水量、光照、平均溫度也會對松乳菇生長產生影響。相較于正常水分條件，干旱脅迫下的松乳菇菌絲體的生物量有所下降［5］。從外生菌根真菌和宿主植物的共生關系角度來看，干旱脅迫對松乳菇的生長具有雙重效應。一方面，干旱條件會使宿主植物的生長受到抑制，導致宿主提供給真菌的有機物減少，影響真菌的生長。另一方面，水分的減少會直接影響真菌自身的生長發(fā)育。光照和溫度也會影響松乳菇子實體的生長狀態(tài)，一般在16～20℃，光照適中的地區(qū)更適合松乳菇生長。溫度的高低會影響松乳菇子實體的顏色，光照的強弱會影響松乳菇的出菇量［6］。此外，土壤狀態(tài)也會影響松乳菇的生長和分布。在滿足營養(yǎng)需求的條件下，松乳菇可以在多類型的土壤中發(fā)生。在黃壤、黃棕壤、黃紅壤、石灰土、石英砂巖土上均發(fā)現有松乳菇的存在。Satoshi等［7］發(fā)現在頂部混交林中，共生型的乳菇屬真菌子實體的數量會隨著土壤有機質沉積厚度的增加而減少。同時，發(fā)生地有苔蘚或其他如松針等地被物存在時，更加有利于子實體的生長，這一點可能與松乳菇子實體化需要合適的濕度條件有關。

2 松乳菇的營養(yǎng)成分與生理活性

松乳菇味道鮮美，營養(yǎng)豐富。近年來的研究發(fā)現，松乳菇子實體中粗蛋白、多糖、脂類、微量元素等營養(yǎng)物質含量豐富［8］。松乳菇子實體中還含有大量Mg、Ca、Fe等，是優(yōu)質的礦質元素來源。松乳菇子實體含有豐富的氨基酸，尤其谷氨酸含量較其他蘑菇高，這也是松乳菇味道鮮美的重要原因之一。

松乳菇具有一定的生理活性。近年來研究發(fā)現乳菇屬和口蘑屬等外生菌根型真菌具有分泌胞外蛋白酶的能力，Nygren等［9］認為胞外蛋白酶活性是外生菌根型真菌的主要生理特性之一。松乳菇含有的多糖具有較強的抗氧化性，能清除自由基，促進巨噬細胞增殖和促進腫瘤細胞的凋亡［10-13］，在抗腫瘤方面效果顯著。

3 松乳菇菌絲體的培養(yǎng)

松乳菇離體人工栽培就是模擬野生的生態(tài)條件和營養(yǎng)條件，進行野生松乳菇的人工馴化，以期脫離共生植物就能產出松乳菇子實體的栽培技術。人工栽培松乳菇的實現需要建立在明確松乳菇從菌絲體生長階段到子實體階段的營養(yǎng)需求基礎上，目前已經有大量的研究工作圍繞松乳菇菌絲體的營養(yǎng)需求展開。

3.1 培養(yǎng)基的選擇

松乳菇菌絲生長較緩慢且組織分離過程中極易被污染，因此篩選合適的培養(yǎng)基配方對組織分離培養(yǎng)菌絲體具有重要意義。PDA培養(yǎng)基被認為是培養(yǎng)松乳菇菌絲體的適宜培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的松乳菇菌絲體生長速度快，長勢好。吳連旺等［14］、Li等［15］分別用固體PDA和液體PDA培養(yǎng)基培育不同來源的松乳菇，結果顯示松乳菇菌絲體在不同PDA培養(yǎng)基上都生長良好。

3.2 營養(yǎng)成分的需求

同大多數食用菌一樣，松乳菇的生長需要合適的碳源和氮源。松乳菇的碳源譜廣泛，能較好地利用蔗糖、果糖、葡萄糖、淀粉等。Zhang［16］研究了4種外生菌根型真菌在離體培養(yǎng)條件下對氮營養(yǎng)的吸收特性，發(fā)現松乳菇對NH4+-N和Glu-N兩種氮源的吸收效率較高，說明松乳菇能夠有效地利用環(huán)境中的氮源，在貧瘠的土壤中也能生長良好。碳源、氮源和磷源的不同也影響著松乳菇對微量元素的吸收。碳源會影響菌絲體對K、Ca的吸收，氮源會影響菌絲體對Fe、Mn的吸收，而磷源會影響菌絲體對P、Mg、Zn的吸收［17］。這說明在優(yōu)勢碳源、氮源及磷酸鹽含量豐富的地區(qū)，松乳菇能夠更好地生長。因為共生菌根的存在，松乳菇與宿主植物發(fā)生信號分子的傳遞和物質交換，研究人員在培養(yǎng)基中添加維生素B1、赤霉素、肌醇等促生長因子來促進松乳菇菌絲體的生長。

3.3 添加共聚物培養(yǎng)

所謂添加共聚物培養(yǎng)，就是在松乳菇培養(yǎng)過程中，除了必需的營養(yǎng)物質外，添加松樹組織或相關物質進行培養(yǎng)。在實驗室培養(yǎng)條件下，失去了宿主植物共生的影響，松乳菇很難完成從菌絲體向成熟子實體轉化這一過程。為了模擬野生環(huán)境，培養(yǎng)料中添加共聚物成為松乳菇人工栽培的一個新思路。在培養(yǎng)基中添加松木屑［8］、松木土、松根浸出液［18］等共聚物來促進松乳菇生長，這種方法在一定程度上能夠促進松乳菇菌絲體的生長，但是否促進子實體發(fā)育還缺少直接證據。詹少華［19］以雜樹葉為共聚物來培養(yǎng)松乳菇，通過后期補料的方式成功培育出了較小的松乳菇菇蕾，但未得到成熟子實體?？梢娝扇楣阶訉嶓w的轉化過程與成熟過程可能需要不同的營養(yǎng)組分，或松乳菇子實體轉化完成后，成熟過程需要某種營養(yǎng)關鍵因子的持續(xù)供應，這在一定程度上加大了松乳菇人工栽培的難度。

4 松乳菇人工栽培現狀

4.1 人工馴化流程

松乳菇的人工栽培需要遵循“母種的獲取-菌絲體擴繁-子實體培育”這個傳統(tǒng)步驟。目前主要采用組織分離法和孢子培養(yǎng)法來獲取母種，組織分離方法簡單快捷，是目前主要采用的母種制備方法。在菌絲體培育階段，有觀點認為松乳菇的子實體化與松樹根系形成菌根不是必需的，很可能與菌根化的菌絲體生物量有關。因此通過改變培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件，通過深層液體發(fā)酵等方法來獲得高生物量的松乳菇菌絲體成為一種趨勢。松乳菇子實體培育階段，雖然研究者們進行了大量的工作，但是由于松乳菇菌絲體向子實體轉化的機制還不清楚，目前還沒有取得明顯的進展。目前松乳菇的子實體培育，主要是通過菌根化種植、菌絲體直接接種等方式進行半人工栽培。雖然有松乳菇子實體培育成功的報道，但是培育的子實體數量少，體積小，由此說明在脫離宿主植物的情況下，實現松乳菇子實體的培育具有可行性，但是完全脫離宿主植物實現人工栽培得到成熟子實體仍有難度。

4.2 松乳菇的菌根化栽培

所謂菌根化就是松乳菇菌絲體與宿主植物幼嫩的短根相接觸，形成共生關系，從而得到菌根苗的過程［20］。早期的菌根合成就是在實驗室通過利用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基來實現菌根苗的合成［21］，整個過程耗時久且菌根數量有限。后來Zambonelli等［22］通過不斷改進菌絲體培養(yǎng)和菌根化方法，成功在溫室內合成菌根苗。菌根化一方面會影響宿主幼根對營養(yǎng)素的吸收，另一方面幼根的快速生長會給松乳菇提供有機物，菌根化菌絲體生物量和菌絲體侵染程度影響著菌根的生長。利用菌根苗進行仿野生栽培也取得了一定成果。通過菌根化方式已經成功建立松乳菇菌根苗培育基地和松乳菇菌根人工示范林，可見菌根苗栽培松乳菇是可行的。在新西蘭，松乳菇菌根苗的種植已形成一定規(guī)模，松乳菇半人工種植已經成為一個新產業(yè)。從新西蘭南部到北部地區(qū)，種植園在共生栽培3年后獲得了少量松乳菇子實體。在新西蘭南部一個種植園中，連續(xù)6年30株菌根苗每年可生產100 kg以上的松乳菇［23］。雖然種植菌根苗能夠成功得到松乳菇子實體，但是這些技術并沒有大規(guī)模推廣，說明松乳菇菌根化栽培仍然存在一些技術難點。

5 松乳菇人工栽培的難點

松乳菇菌根共生體構建以后，其菌絲體的延生及菌根的形成和發(fā)展，依賴于菌絲體與植物根系及根系周圍微環(huán)境間的物質交換和信息交換。許多小分子及大分子有機物被分泌到根系周圍土壤中，這些分泌物在調節(jié)共生關系及與其他有機體之間的相互作用時發(fā)揮了極其重要的作用。目前關于這兩者之間的相互作用鮮有報道，松乳菇與宿主植物之間的物質交換和信號傳遞過程還需要深入研究。在分子生物學層面，松乳菇遺傳轉化體系尚未建立，相關功能基因的克隆還未開展。Goh等［24］提取了松乳菇菌株的基因組DNA，進行了基因組測序，發(fā)現該菌株基因組大小估計為54 Mbp，具有12 753個基因。從龐大的基因組中找出關鍵控制基因，是揭示松乳菇子實體轉化的關鍵。此外，松乳菇子實體不同發(fā)育時期的轉錄組有不同的表達情況，松乳菇不同發(fā)育時期的生物代謝表達存在一定的差異。相較于幼菇期，成熟期有16 789個差異表達基因，其中ATP酶、多功能伴侶蛋白等家族基因是松乳菇子實體化各階段高表達的基因［25］。尋找出控制松乳菇子實體轉化和發(fā)育的關鍵基因對松乳菇人工栽培的實現具有重大意義。

6 小結

松乳菇的人工栽培技術是一個具有前景的研究課題，一方面松乳菇營養(yǎng)成分豐富，經濟價值高，其人工栽培技術具有廣闊的市場前景；另一方面，探索松乳菇人工栽培技術也可對其他外生菌根型真菌的人工馴化提供指導意義。目前，松乳菇的栽培技術研究僅停留在半人工栽培階段，關于松乳菇的完全人工離體栽培研究甚少。未來需要對松乳菇的生理生化和生態(tài)學特征、菌絲體和宿主根系之間的物質交換和信號傳遞、松乳菇關鍵基因的挖掘以及菌根與土壤微環(huán)境間的相互作用等方面進行深入研究。將分子生物學技術如核苷酸測序技術、基因組組學關聯分析及生物信息學技術與松乳菇的人工栽培技術緊密結合起來，必將推動松乳菇人工栽培技術的發(fā)展。