唐名艷，蔣滿貴，唐亮，趙燁蕓，黃深惠，陳小青*

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧市 530007；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院，南寧市 530007）

近年來，腸道微生物對宿主的影響已成為國內(nèi)外研究的熱點。大量研究表明，腸道微生物參與宿主的生長發(fā)育、免疫防御、神經(jīng)信號傳導(dǎo)等重要生理過程，在人體和動物體健康中發(fā)揮著重要作用［1］。分布廣泛且種類繁多的昆蟲與哺乳動物一樣，其腸道微生物也形成了極為多樣的種群結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物在調(diào)節(jié)宿主生長發(fā)育和繁殖［2］、協(xié)助消化食物和解毒［3］、協(xié)同宿主抵御天敵和病原微生物［4-6］、調(diào)節(jié)宿主耐熱性［7］、增強(qiáng)對殺蟲劑的抗性［8］等方面均起著重要的作用。家蠶作為一種重要的經(jīng)濟(jì)資源性昆蟲，在助農(nóng)增收、脫貧攻堅、縣域經(jīng)濟(jì)發(fā)展方面做出了積極的貢獻(xiàn)。深入研究腸道微生態(tài)變化與家蠶健康生長之間的關(guān)系，對提高桑葉轉(zhuǎn)化率、增強(qiáng)家蠶抗病能力提高蠶繭的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。關(guān)于家蠶腸道微生物的研究，最早可追溯到20世紀(jì)60年代日本學(xué)者對家蠶腸道微生物進(jìn)行的初步調(diào)查［9］，之后越來越多的學(xué)者對家蠶腸道微生物的組成成分進(jìn)行了廣泛的研究。本文就近年來國內(nèi)外家蠶腸道微生物多樣性及功能的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，且就當(dāng)前家蠶腸道微生物研究存在的問題進(jìn)行闡述，并對家蠶腸道微生物的研究前景進(jìn)行了展望，以期為未來家蠶腸道微生物的理論和應(yīng)用研究提供參考。

1 家蠶腸道微生物多樣性研究進(jìn)展

1.1 家蠶腸道微生物多樣性組成

腸道微生物指動物腸道中存在的數(shù)萬億共生微生物，由細(xì)菌、真菌、病毒組成，其中細(xì)菌占90%以上［10］。從功能角度講，腸道內(nèi)微生物分為共生、益生和病原微生物三大類，這些微生物之間互利共生又相互制約，形成一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。如同所有的生態(tài)系統(tǒng)一樣，多樣性至關(guān)重要。腸道微生物多樣性即腸道微生物的物種組成及結(jié)構(gòu)特征，多樣性保障了菌群的穩(wěn)定性達(dá)到維持機(jī)體生理平衡。早期家蠶腸道微生物的研究都是從患腸道疾病的家蠶腸道分離細(xì)菌性致病菌，如腸球菌屬（Enterococcus）［11-12］、沙雷氏菌屬（Serratia）［13］、綠葉假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）［14］。正常情況下家蠶腸道內(nèi)的這些致病菌對家蠶本身并無致病作用，與其他正常菌一起維持共生關(guān)系。只有在家蠶體質(zhì)虛弱的前提下，這些致病菌才大量繁殖導(dǎo)致家蠶腸道內(nèi)細(xì)菌比例失調(diào)引發(fā)蠶體發(fā)病。如腸球菌屬中的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）是引起家蠶細(xì)菌性軟化?。ㄋ追Q空頭病或起縮病）的病原。隨著對昆蟲腸道微生物的研究日益深入，越來越多腸道微生物的潛在功能與價值被挖掘，越來越多專家學(xué)者對家蠶腸道微生物的研究也逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閷δc道中微生物多樣性的探究。家蠶和大多數(shù)昆蟲一樣，腸道微生物的多樣性受蠶期、齡期、品系、性別等內(nèi)部因素和食料等外部因素的影響。在門水平對目前現(xiàn)有家蠶腸道微生物多樣性研究進(jìn)行統(tǒng)計分析［15-32］，家蠶腸道內(nèi)的細(xì)菌主要以厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）為主。其次為放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteriodetes）。在屬水平，家蠶腸道中出現(xiàn)頻度最高的為腸球菌屬（Enterococcus），葡萄球菌屬（Staphylococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、短波單胞桿菌屬（Brevundimonas）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、棲熱菌屬（Thermus）、代爾夫特菌屬（Delftetia）、乳球菌屬（Lactococcus）、青枯菌屬（Ralstonia）、甲基桿菌屬（methylbacillus）。目前盧延［33］對不同飼料飼養(yǎng)、不同齡期及不同地區(qū)家蠶腸道中葡萄球菌屬的種群鑒定、分布，以及致病性、產(chǎn)消化酶做了研究。葡萄球菌在家蠶腸道細(xì)菌中的豐度為中低水平，與松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）、雞葡萄球菌（staphylococcus gallinarum）、木糖葡萄球菌（staphylococcus xylosus）、腐生葡萄球菌（staphylococcus saprophyticus）、和琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinis）同源性較高，可產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶，桑葉育的家蠶腸道葡萄球菌物種的種類上明顯高于人工飼料育的家蠶，所分離的葡萄球菌添食家蠶后均未表現(xiàn)出明顯的致病性。其他家蠶腸道中被高頻檢出的菌屬，在家蠶腸道中的種群分布、系統(tǒng)發(fā)育及相關(guān)病理和生理作用的研究鮮有報道。

1.2 家蠶腸道微生物多樣性研究方法

由于技術(shù)的限制，早期對家蠶腸道微生物多樣性的研究是采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法。由于99%的腸道細(xì)菌是不能體外培養(yǎng)的［34］，而且在分離培養(yǎng)過程中菌株有可能會富集或者減少，所以此方法缺陷較大。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定可以克服以上不足而被廣泛應(yīng)用，主要是依據(jù)細(xì)菌16 S rDNA 核糖體RNA 具有高度的保守區(qū)和高變區(qū)，可以有效地作為原核生物物種分類的分子標(biāo)簽。具體的研究方法包括構(gòu)建16 S rRNA 文庫、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性片斷長度多態(tài)性分析技術(shù)（RFLP）及宏基因組法。其中16 S rRNA 文庫、DGGE、RFLP 屬于早期利用一代測序法的研究方法，成本低和操作方便，但無法獲得整個腸道細(xì)菌組成信息的缺陷，只能反映出優(yōu)勢菌群，對低豐度的菌群無法檢測到［35］。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組法能夠一次性將家蠶腸道中所有的微生物所含的16S rRNA進(jìn)行測序，獲得完整的物種組成信息和豐度信息，使得家蠶腸道微生物的研究步入新的階段。陳勃生［15］對大造（P50）和秋豐白玉（QB）兩個品種的家蠶腸道微生物進(jìn)行鳥槍法宏基因組學(xué)測序，兩個品種分別含有45 505 084 條和69 127 002 條原始序列，P50 家蠶共鑒定出663 種細(xì)菌，QB家蠶共鑒定出322種細(xì)菌，極大地拓展了家蠶腸道微生物多樣性的研究范圍。

1.3 影響家蠶腸道微生物多樣性的因素

1.3.1 食料對家蠶腸道多樣性的影響 家蠶是以桑葉為食的寡食性昆蟲，也能吃柘和萵苣等非桑植物，部分選育的家蠶品系能攝食人工飼料，但在攝食性和飼育成績方面與桑葉育相比較差。食料對家蠶腸道生物種類及豐度的影響已經(jīng)有一些研究報道。相輝等［16］用桑葉、含桑葉粉的飼料與不含桑葉粉飼料飼養(yǎng)專食性品系C108 家蠶和廣食性品系SCN2家蠶，兩個品系的優(yōu)勢菌腸球菌屬（Enterococcus）的組成沒有變化，但腸球菌中優(yōu)勢菌種的種類有差異，E.mundtii和E.casseliflavu在桑葉及含桑飼料處理組中是優(yōu)勢種，但是在無桑飼料喂養(yǎng)條件下優(yōu)勢種是E.saccharolyticus。SCN2 品系食無桑飼料時中腸還出現(xiàn)新的次優(yōu)勢菌葡萄球菌（Staphylococcus）。董惠玲［17］和郝長富等［18］研究后都發(fā)現(xiàn)，對人工飼料攝食性具有差異的家蠶不同品系之間，桑葉育時腸道微生物的組成和多樣性差異不明顯，同一品種經(jīng)桑葉飼育的家蠶腸道微生物物種多樣性高于經(jīng)人工飼料飼育；人工飼料攝食性都很好的不同品系家蠶，人工飼料育后腸道微生物的組成和多樣性也有差異。董惠玲［17］還用PICRUSt對家蠶腸道微生物群的功能進(jìn)行預(yù)測，桑葉育家蠶的腸道微生物主要參與宿主消除毒素、清除異生素的功能，而人工飼料育家蠶腸道菌群參與宿主適應(yīng)性的微生物則顯著增多。向蕓慶［19］采用純培養(yǎng)分離檢測技術(shù)對桑葉和柘葉飼養(yǎng)的家蠶進(jìn)行腸道微生物優(yōu)勢菌群多樣性差異性研究，發(fā)現(xiàn)桑葉飼養(yǎng)家蠶的腸道優(yōu)勢菌群有9 個，柘葉飼養(yǎng)家蠶腸道中的優(yōu)勢菌群類有6個，其中有4個菌群為共有菌群。以上研究均為從腸道微生物群變化解釋人工飼料育家蠶的體質(zhì)差、絲蛋白合成效率低以及在廣食性品系的篩選培育過程中注意其腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)的改變奠定基礎(chǔ)。

1.3.2 高溫對家蠶腸道多樣性的影響 溫度是影響家蠶生長發(fā)育的主要環(huán)境因子。家蠶在高溫高濕環(huán)境下飼養(yǎng)，抗病能力和抗逆性都會下降，從而導(dǎo)致家蠶細(xì)菌性疾病和病毒病的發(fā)生［36］。孫振麗［37］對短暫高溫處理（37℃，8 h）后正常飼養(yǎng)的家蠶腸道細(xì)菌的多樣性變化進(jìn)行了試驗研究。結(jié)果顯示，家蠶腸道細(xì)菌的多樣性增加，并且隨正常溫度飼養(yǎng)時間的延長高溫刺激所引起的效應(yīng)減弱。短暫高溫同時影響腸道細(xì)菌的豐度，大腸埃氏菌屬、腸球菌屬、不動桿菌屬、志賀氏菌屬、Incertae_Sedis、Anderseniella豐度變化幅度最明顯，對高溫處理較敏感。其中腸球菌豐度下降，但其影響隨發(fā)育進(jìn)度而減小，48 h豐度與對照家蠶相似，96 h、144 h后，分別比對照下降99.25%、91.90%。PCA分析顯示，腸球菌屬、葡萄球菌屬的豐度與其他優(yōu)勢菌豐度成負(fù)相關(guān)。同時還對高溫處理→基因表達(dá)變化→腸道菌群變化之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期和細(xì)胞大小調(diào)節(jié)有關(guān)的Hippo 通路受到抑制，從而推測Hippo 通路因高溫刺激受到抑制導(dǎo)致腸道的生理狀態(tài)改變影響腸道細(xì)菌種群。杜貝貝［38］對持續(xù)高溫作用對家蠶腸道微生物組成及功能的影響做了研究。發(fā)現(xiàn)持續(xù)高溫處理（34℃處理72 h），引起家蠶腸道微生物豐度顯著降低，且存在性別差異，主要是對雌性影響較大。雌性家蠶顯著降低的微生物為25種，雄性家蠶11種。并對已測微生物基因組基因全長序列進(jìn)行功能預(yù)測，并且也存在性別差異。高溫環(huán)境下雌性家蠶腸道微生物膜轉(zhuǎn)運功能顯著上調(diào)，雄性家蠶腸道微生物膜轉(zhuǎn)運功能與對照組無顯著差異。此研究為深入研究家蠶抗性性別差異提供了一個新的視角。

1.3.3 氟化物及農(nóng)藥對家蠶腸道多樣性的影響昆蟲腸道作為接觸有毒物質(zhì)的主要屏障之一，與腸道內(nèi)廣泛多樣的微生物共同維持了宿主的健康狀態(tài)。近年來，由于多種因素使桑葉遭到污染，進(jìn)而導(dǎo)致區(qū)域性家蠶中毒事件時有發(fā)生，嚴(yán)重地影響了蠶業(yè)的正常生產(chǎn)。生產(chǎn)上最常見的為氟化物中毒和農(nóng)藥中毒。研究有毒物質(zhì)引起的家蠶腸道微生物組成和結(jié)構(gòu)變化，可為家蠶中腸毒理學(xué)研究提供新的思路，為蠶業(yè)生產(chǎn)中中毒事件提供應(yīng)對策略和解決方法。李冠楠［39］對家蠶腸道微生態(tài)環(huán)境與家蠶耐氟性之間的關(guān)系做了研究。對氟脅迫下耐氟家蠶品種T6 和不耐氟品種734 的腸道微生物多樣性、優(yōu)勢菌群的變化、產(chǎn)消化酶菌群組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比對。不耐氟品種734 受氟脅迫后腸道微生物多樣性有顯著性變化；優(yōu)勢菌群葡萄球菌屬（Staphylococcus）的細(xì)菌增多，而腸球菌屬（Enterococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌菌群減少；產(chǎn)酶菌組成和消化酶種類變得單一，主要為產(chǎn)脂肪酶的葡萄球菌屬（Staphylococcus）細(xì)菌。而耐氟品種T6 在腸道微生物多樣性、優(yōu)勢菌群的變化、產(chǎn)消化酶菌群組成結(jié)構(gòu)變化均不顯著，推測腸道菌群的動態(tài)變化與家蠶的耐氟性相關(guān)，耐氟家蠶品種T6 可能是由于腸道內(nèi)留存的產(chǎn)酶菌種類多，能提高宿主家蠶的消化吸收能力使其對氟離子的排泄加快或者腸道內(nèi)的產(chǎn)酶菌對氟離子具有富集作用，從而耐氟性強(qiáng)。研究結(jié)果為蠶業(yè)生產(chǎn)中解決氟中毒事件提供新的思路，即可通過利用生物富集原理提高家蠶自身對氟化物的抗性。

有機(jī)磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大量使用。辛硫磷是有機(jī)磷類農(nóng)藥中其中的一種廣泛使用的殺蟲劑。有研究發(fā)現(xiàn)，家蠶長期暴露于辛硫磷亞致死水平會改變家蠶食物消化、營養(yǎng)吸收和代謝，導(dǎo)致家蠶幼蟲體重下降，同時家蠶的免疫應(yīng)答受到抑制，從而增加對疾病的敏感性［40］。LI F C［25］研究了家蠶幼蟲暴露于辛硫磷亞致死水平下腸道微生物的變化。結(jié)果表明，暴露于辛硫磷亞致死水平的家蠶腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，優(yōu)勢細(xì)菌甲基桿菌和金黃色葡萄球菌豐度顯著降低，葡萄球菌等非優(yōu)勢菌的豐度顯著升高，而且腸道內(nèi)細(xì)菌群落的均勻度明顯提高。此外還發(fā)現(xiàn)，暴露于辛硫磷后，抗菌肽mRNA水平的表達(dá)受到抑制，家蠶的免疫應(yīng)答受到抑制，對陰溝腸桿菌的易感性增加。因此，辛硫磷暴露引起的腸道微生物組成和結(jié)構(gòu)的改變可能會影響家蠶腸道的正常功能，提示關(guān)注農(nóng)藥脅迫下中腸細(xì)菌變化的重要性，為研究家蠶接觸農(nóng)藥后的中腸損傷機(jī)制提供了新的方向。

2 家蠶腸道微生物的生物學(xué)功能

2.1 輔助消化功能

基于微生態(tài)學(xué)理論，從昆蟲到人體，腸道微生物是宿主代謝的重要參與者，均需要腸道微生物提供多種酶幫助消化和代謝木聚糖、纖維素等難以消化的營養(yǎng)物質(zhì)。高繪菊等［41］對家蠶腸道菌進(jìn)行了分離，并對分離到的菌株進(jìn)行了產(chǎn)胞外消化酶測定，發(fā)現(xiàn)在家蠶腸道中存在著可以分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶的菌株，產(chǎn)酶菌占比達(dá)到60%，證實了腸道菌在家蠶腸道內(nèi)參與消化的重要性，但該試驗并未對分離到的菌株進(jìn)行種屬鑒定。不同于白蟻，家蠶基因組中沒有纖維素酶基因，研究表明，對于桑葉中富含的木聚糖、果膠、纖維素的消化很有可能由腸道普通肺炎桿菌（Proteusvulgaris）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、肺炎克桿菌（Klebsiella pneumoniae）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和歐文氏菌（Erwinia spp.）這些細(xì)菌協(xié)助消化［42］。目前從家蠶腸道內(nèi)分離到的產(chǎn)酶菌還有不動桿菌屬（Acinetobacter）［43］、蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus）［44］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［34］、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）［45］、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）［46］、毛霉屬（Mucor）真菌［47］。

2.2 防御和解毒功能

昆蟲腸道微生物可直接或間接協(xié)助宿主抵御天敵捕食或者病原菌的感染［4-6］。近些年的研究表明，家蠶腸道微生物在抵御病原體侵害時扮演著重要的角色。如家蠶（Bombyx moriL.）腸道內(nèi)細(xì)菌經(jīng)抗生素處理消除后，家蠶對桿狀病毒（Baculo virus）以及沙雷氏菌屬的Serratia piscatorum的抵抗力顯著下降［48］。目前家蠶腸道微生物對宿主的抵御功能研究主要集中在對腸球菌和脂肪酶產(chǎn)生菌的研究上。魯興萌等［49］最先發(fā)現(xiàn)分離自家蠶腸道內(nèi)的腸球菌在體外對家蠶微孢子蟲的發(fā)芽具有較強(qiáng)的抑制作用。接著汪方煒等［50］對腸球菌體外抑制微孢子蟲發(fā)芽的動力學(xué)機(jī)制進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)腸球菌的外分泌蛋白是延緩微孢子蟲發(fā)芽的活性物質(zhì)，且具有較好的熱穩(wěn)定性。而宋連花［51］進(jìn)一步分離純化抑制微孢子蟲發(fā)芽的家蠶來源腸球菌外分泌蛋白，并進(jìn)行了家蠶添食試驗，結(jié)果表明腸球菌外分泌蛋白在家蠶體內(nèi)能抑制微孢子蟲發(fā)芽。WEI等［52］分別用拓葉和桑葉飼養(yǎng)家蠶來構(gòu)建抗家蠶核型多角體病毒（BmNPV）敏感和不敏感模型。結(jié)果顯示，柘葉飼養(yǎng)敏感家蠶其腸道脂肪酶產(chǎn)生菌的多樣性遠(yuǎn)不如桑葉飼養(yǎng)不敏感家蠶的豐富，因此推測脂肪酶產(chǎn)生菌分泌的脂肪酶可能參與了家蠶對BmNPV 的抗性。后續(xù)研究者的研究證實了這一點。為了驗證家蠶腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)生的脂肪酶在宿主防御系統(tǒng)中是否發(fā)揮了作用，有研究者給家蠶添食腸道產(chǎn)脂肪酶的優(yōu)勢菌株發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)能降低家蠶核型多角體病毒的感染率［53］。LIU 等［54］對家蠶腸道短小芽孢桿菌（Bacillus pumilusSW41）的脂肪酶基因進(jìn)行了鑒定，用大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化的重組脂肪酶孵育家蠶核型多角體病毒BmNPV，發(fā)現(xiàn)相對高濃度的重組脂肪酶降低了BmNPV的體外感染家蠶卵巢細(xì)胞的能力，提示短小芽孢桿菌SW41 的脂肪酶可能是家蠶抗BmNPV的潛在抗病因子。

越來越多的研究表明，昆蟲的農(nóng)藥抗性出現(xiàn)了一種新機(jī)制，部分是由昆蟲腸道內(nèi)共生的微生物介導(dǎo)的，昆蟲腸道內(nèi)微生物可協(xié)助宿主代謝化學(xué)農(nóng)藥［55-59］。有研究通過建立無菌家蠶模型，發(fā)現(xiàn)家蠶與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）的組合能增強(qiáng)宿主對毒死蜱的抗性，進(jìn)一步腸道代謝組學(xué)分析，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌不是直接降解腸道殘留的毒死蜱，而是該細(xì)菌與家蠶幼蟲腸道產(chǎn)生較高水平的必需氨基酸相關(guān)聯(lián)，這種關(guān)鍵的營養(yǎng)供應(yīng)顯著提高了宿主的適應(yīng)性，從而使幼蟲能夠更有效地規(guī)避這些有毒化學(xué)物質(zhì)的有害影響［60］。昆蟲的農(nóng)藥抗性在作物蟲害防治上是一個難題，但對于家蠶在防治農(nóng)藥中毒是一個新的視角。

3 家蠶腸道微生物的應(yīng)用研究

3.1 微生態(tài)制劑開發(fā)

家蠶作為一種經(jīng)濟(jì)昆蟲，研究者比較關(guān)注通過調(diào)節(jié)腸道微生物來改善家蠶的消化吸收和健康狀況進(jìn)而提高蠶繭產(chǎn)量。近年來，隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，畜禽腸道中的有益菌被開發(fā)成微生態(tài)制劑在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，并且在提高畜禽飼料利用率和增強(qiáng)免疫力方面取得了較好的效益。微生態(tài)制劑又稱微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，是指被攝入宿主內(nèi)并且能夠有效參與腸道微生態(tài)平衡、調(diào)整微生態(tài)失調(diào)、促進(jìn)腸道消化吸收和提高機(jī)體免疫力的益生菌或者或益生菌的促生長物質(zhì)的總稱。而蠶業(yè)生產(chǎn)上，蠶用微生態(tài)制劑的研究與應(yīng)用進(jìn)展相對緩慢。在蠶業(yè)生產(chǎn)上最早使用活菌制劑的是九十年代引入EM 原露噴灑桑葉和直接喂蠶，可以提高家蠶的抵抗力，降低發(fā)病率，提高產(chǎn)繭量［61］。EM（Effective Microorganisms）是有益微生物菌群的英文縮寫。它是由日本琉球大學(xué)比嘉照教授于80 年代初研制而成，主要由乳酸菌、光合細(xì)菌、放線菌、醋酸桿菌、酵母菌等近5 科10 屬共80 多個菌組成的新型活性復(fù)合微生物菌劑。隨后匡英秋等［62］、磨長寅［63］、杭柏林等［64］也探索了EM 在家蠶生產(chǎn)上的效果。1996 年，國內(nèi)研究者孫雪奇等［29］最早探索從家蠶腸道分離優(yōu)勢菌制成混合菌液給5 齡起蠶開始添食，發(fā)現(xiàn)添加活菌微生物制劑后不僅可以能夠降低家蠶的發(fā)病率，全繭量和繭層量同時也有較大提高。隨后不少研究者對家蠶微生態(tài)制劑的研究做了一些嘗試。王曉強(qiáng)［53］發(fā)現(xiàn)給家蠶添食從家蠶腸道中分離出的脂肪酶產(chǎn)生菌能降低家蠶核型多角體病毒的感染率。李冠楠［39］從家蠶腸道中篩選出體外能富集氟離子以及能分泌多種胞外酶的枯草芽孢桿菌，并給氟脅迫家蠶添食，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能明顯降低氟脅迫對家蠶的影響。在探索中，也發(fā)現(xiàn)外來菌群在家蠶中腸中生長繁殖受到嚴(yán)重抑制，易發(fā)平［65］給不同齡期家蠶添食來自桑粒肩天?！睞priona germari（Hope）〕幼蟲腸道的纖維素分解菌，結(jié)果表明，三齡前給家蠶添食，能夠在蠶中腸內(nèi)少量繁殖，而三齡后添食，卻不能檢出?？梢姀募倚Q腸道內(nèi)篩選有價值的益生菌是開發(fā)蠶用微生態(tài)制劑的前提。

3.2 家蠶農(nóng)藥慢性中毒生物防治

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展，吡丙醚等靶向性調(diào)節(jié)昆蟲生長的新型農(nóng)藥以及霧炮機(jī)、無人機(jī)自動化噴灑農(nóng)藥在種植業(yè)上的廣泛應(yīng)用，周邊其他種植業(yè)使用農(nóng)藥遠(yuǎn)距離漂散交叉污染桑葉，雖然新型農(nóng)藥對人畜安全無毒，對環(huán)境也無毒，但家蠶作為昆蟲，長期受到人類馴化，對農(nóng)藥等化學(xué)品卻十分敏感，所以近年來在蠶業(yè)生產(chǎn)中家蠶的中毒事件頻發(fā)，且呈逐年加劇的趨勢。特別是家蠶受微量農(nóng)藥危害的慢性中毒，在小蠶時并不表現(xiàn)出癥狀，直到大蠶時才表現(xiàn)為生長發(fā)育不齊，體質(zhì)虛弱，易發(fā)生胃腸道疾病及不結(jié)繭等，造成蠶桑業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失。一旦發(fā)生農(nóng)藥中毒，沒有特效解毒藥。如何防治家蠶中毒，是當(dāng)前蠶業(yè)安全生產(chǎn)迫切需要解決的重大難題。當(dāng)前，相關(guān)研究已經(jīng)證實腸道微生物在10種昆蟲中直接或間接參與宿主的解毒代謝［66］，其中包含協(xié)助宿主代謝化學(xué)農(nóng)藥增強(qiáng)對農(nóng)藥的抗性。如褐飛虱體內(nèi)的殺雄菌屬（Arsenophonus）通過影響褐飛虱解毒代謝基因的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)對農(nóng)藥吡蟲啉的抗性［55］；桔小實蠅腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌（Citrobacter sp.）可編碼磷酸羥化酶，在敵百蟲（三氯磷酸酯）的降解中起著關(guān)鍵作用，導(dǎo)致宿主對敵百蟲產(chǎn)生抗性［57］；果蠅腸道內(nèi)的乳酸桿菌（Lactobacilli）也通過分泌活性氧增強(qiáng)宿主解毒代謝基因的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)對百草枯的抗性［58］。由此借助特定的腸道微生物可降低害蟲對農(nóng)藥的抗性，為控制害蟲開辟了新的防治途徑。目前已有研究者在家蠶腸道微生物基因組測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)家蠶腸道微生物降解農(nóng)藥等外源有害化合物的基因，并進(jìn)行了體內(nèi)驗證，篩選出能增強(qiáng)家蠶毒死蜱抗性的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas），并解釋了其可能的作用機(jī)制［60］。因此，尋找對家蠶農(nóng)藥抗性有積極影響的細(xì)菌并加以應(yīng)用能夠為家蠶農(nóng)藥中毒問題提供新的解決辦法。

4 家蠶腸道微生物研究存在的問題

目前家蠶腸道微生物無論在基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究方面尚處于較初步的階段，遠(yuǎn)落后于其他昆蟲，研究不夠深入。在多樣性方面，雖然前人已通過純培養(yǎng)方法、16 S rRNA 多樣性測序、宏基因組測序開展了家蠶腸道微生物組成在不同品種、不同發(fā)育時期、不同飼料及環(huán)境因子等情況下的變化，但還存在著以下問題。一是家蠶腸道微生物多樣性數(shù)據(jù)不夠豐富。腸道微生物的研究雖然在人和動物以及其它昆蟲上是研究熱點，但在家蠶上的關(guān)注度和研究力度還處于起步階段。二是在種類組成上，停留在測序數(shù)據(jù)的分析，缺乏分析是否是路過菌以及有沒有代謝活性，分離培養(yǎng)法得到的微生物種類較少。三是在結(jié)構(gòu)上，僅停留在相對豐度的變化，差異變化不夠精準(zhǔn)，對一些低豐度的菌群無法檢測到。

在功能性研究方面，微生物在家蠶腸道中功能的研究還不夠深入，具體的功能停留在細(xì)菌基因功能預(yù)測上，沒有相關(guān)驗證。如在其他昆蟲上已有實驗證明腸道微生物參與宿主的糖類、氨基酸、維生素代謝，但在家蠶上雖然在對已測微生物基因組基因全長序列進(jìn)行功能預(yù)測，也參與糖類、氨基酸、維生素代謝，但缺乏相關(guān)驗證的報道。在家蠶腸道微生物對宿主的抵御功能研究方面，目前只是將菌群變化和宿主疾病抵抗力進(jìn)行簡單的關(guān)聯(lián)，腸道微生物是直接影響家蠶腸道微環(huán)境進(jìn)而導(dǎo)致家蠶免抵抗力的變化，還是間接影響家蠶參與相關(guān)功能基因的表達(dá)導(dǎo)致家蠶免疫功能的差異，兩者之間的因果關(guān)系仍缺乏相關(guān)實驗驗證和數(shù)據(jù)支撐。

在微生物態(tài)制劑研發(fā)方面，目前微生態(tài)制劑開發(fā)階段仍處于起步的階段，微生態(tài)制劑真正用于家蠶生產(chǎn)上仍有很漫長的路要走。目前從家蠶腸道內(nèi)分離具有消化酶的種類少，添食家蠶后對于其在腸道內(nèi)的定殖能力、定殖時間都未涉及，益生作用機(jī)制不明確。

5 研究展望

利用家蠶腸道微生物來維護(hù)家蠶健康，是繼家蠶育種改良、提高桑葉質(zhì)量來達(dá)到蠶業(yè)高產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)的又一思路。未來可從以下幾個方面開展研究。一是建立更加豐富的家蠶腸道微生物多樣性數(shù)據(jù)庫。通過對不同品種、不同食料、不同生存環(huán)境以及不同健康程度等的家蠶腸道微生物進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計，如調(diào)查對人工飼料適應(yīng)性有差異的家蠶品種的腸道微生物組成及結(jié)構(gòu)，為構(gòu)建出健康家蠶的腸道微生物結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。二是傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序法相結(jié)合，對高通量測序中家蠶腸道中豐度高的菌群或者不同狀態(tài)下豐度差異變化大的菌群進(jìn)行分離培養(yǎng)，分離培養(yǎng)獲得微生物是后續(xù)各種功能驗證的基礎(chǔ)。三是闡明腸道菌在維護(hù)家蠶健康和抗病方面的機(jī)制，特別是與重要家蠶病害的關(guān)系。家蠶腸道微生物功能基因及其代謝產(chǎn)物與宿主免疫功能的互作機(jī)制知之甚少，未來應(yīng)利用宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組及代謝組等手段，進(jìn)一步闡明腸道菌群結(jié)構(gòu)與免疫通路基因的互作機(jī)制。四是開發(fā)蠶用微生態(tài)制劑，提高桑葉、人工飼料利用率。理想的益生菌應(yīng)該來源宿主自身胃腸道已經(jīng)得到學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)可，篩選在體內(nèi)外易于繁殖且高效產(chǎn)酶的菌株。對菌株進(jìn)行基因改造，幾種菌株聯(lián)合使用，以及研究其在腸道內(nèi)的定殖能力、定殖時間，在不斷加強(qiáng)應(yīng)用研究的同時也加強(qiáng)對腸道微生物相互作用的分子機(jī)制的深入研究，明確微生態(tài)制劑的作用機(jī)理，必將極大地推動家蠶微生態(tài)制劑的開發(fā)和應(yīng)用。五是識別家蠶腸道內(nèi)與殺蟲劑抗性相關(guān)的細(xì)菌種類，以及解析潛在的機(jī)制，達(dá)到能利用腸道特定的細(xì)菌種類能有效地化解家蠶農(nóng)藥中毒風(fēng)險。

此外家蠶不僅是一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲，同時也是鱗翅目昆蟲的模式生物，發(fā)育周期各個階段特征明顯，便于在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖，是科研工作者研究鱗翅目害蟲的極好材料。研究其腸道微生物，對于研究整個鱗翅目昆蟲的腸道生態(tài)以及農(nóng)作物的鱗翅目害蟲防控等方面都具有重要意義。