李 賀，陳紅旭，牛勝男，陳建光

(北華大學藥學院，吉林 吉林 132013)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，習稱“北五味子”，又稱“玄及”“會及”“山花椒”“五梅子”等[1].《新修本草》記載其“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”，故名五味子[2].在傳統(tǒng)中醫(yī)學理論中，可用于久嗽虛喘、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴和心悸失眠等病癥[1]，還具滋補強身之力，有很高的藥用和食用價值[3].

目前，五味子的食藥部位主要為果實，其研究也集中于五味子果的炮制加工[2]、活性成分提取及藥理功效[3]等.為實現(xiàn)果實的高產(chǎn)率和高品質(zhì)，藤莖作為非藥用部位常被減掉，除少部分作為調(diào)料粉被使用外，絕大多數(shù)則被直接丟棄[4].然而，現(xiàn)代藥物分析研究[5]發(fā)現(xiàn)，五味子藤莖多糖具有和果實相似的有效成分，有研究[6]表明，藤莖多糖具有與果實多糖相似的作用，如藤莖多糖可通過抑制細胞凋亡對D-gal誘導衰老小鼠產(chǎn)生抗疲勞作用，抑制ACC、FAS等蛋白表達對非酒精性脂肪肝大鼠發(fā)揮治療作用[5].因此，五味子藤莖作為五味子果實的補充資源應該深入開發(fā)[7]，在確定其藥用價值的同時，對其進行毒理學安全性評價尤為重要.目前國內(nèi)外尚未見有關藤莖多糖的安全性報道.

本研究通過測定小鼠MTD，可為后續(xù)進行藤莖多糖的研究提供毒理學基礎.五味子藤莖若能作為五味子的補充資源進行開發(fā)，實現(xiàn)全株的高效利用，將有利于五味子的可持續(xù)發(fā)展及非藥用部位的綜合開發(fā)利用.

1 材料與儀器

1.1 動 物

ICR小鼠(長春億斯實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(吉)-2020-0001)20只，體質(zhì)量19～21 g，飼養(yǎng)溫度21～24 ℃，濕度40%～60%，12 h晝夜循環(huán)，給予鼠糧5 g/只，自由飲水，適應環(huán)境7 d進行實驗.本實驗通過北華大學實驗動物倫理委員會批準.

1.2 材 料

五味子藤莖多糖(吉林省五味子開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化工程研究中心)，碳水化合物含量為28.1%；多糖提取率為6%.

1.3 儀 器

ZZ-6小鼠自主活動測試儀、YLS-13A型大小鼠抓力測定儀、BA-200小鼠避暗儀(成都泰盟科技有限公司).

2 實驗方法

2.1 動物分組

按照隨機平均分組的原則將ICR小鼠分為空白組(CON，蒸餾水灌胃)、藤莖多糖組(SCP，24 g/kg五味子藤莖多糖水溶液灌胃)，藤莖多糖的最大水溶量即為灌胃劑量，灌胃容積0.4 mL/10 g，灌胃2次/d，并記錄體質(zhì)量，連續(xù)7 d.

2.2 小鼠一般狀態(tài)觀察

觀察實驗期間小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、皮膚及眼的一般狀態(tài).

2.3 小鼠行為學變化觀察

實驗第7天，于給藥后40 min后進行避暗實驗、自主活動實驗、抓力實驗，觀察藤莖多糖對小鼠行為學的影響.

1)避暗實驗：實驗第6天，將小鼠放入避暗試驗箱，打開明暗箱通道，自主活動5 min適應環(huán)境.實驗第7天，正式進行避暗實驗，記錄5 min內(nèi)避暗潛伏期及避暗錯誤次數(shù)[8].

2)自主活動實驗：將小鼠置于自主活動測試儀中，觀察并記錄5 min內(nèi)活動和站立的次數(shù).

3)抓力實驗：根據(jù)小鼠喜用爪抓物的習性進行前肢抓力測試，小鼠抓握金屬桿，將前爪穩(wěn)定地從金屬桿拖出，小鼠可接受的最大張力即為前肢抓力.

2.4 臟器變化及臟器指數(shù)

實驗第8天，應用戊巴比妥鈉給小鼠麻醉后眼球取血，并取出小鼠臟器，肉眼觀察臟器變化，對心、肝、脾、肺、腎、腦進行稱重，計算臟器指數(shù)(mg/g)：臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量(mg)/動物體質(zhì)量(g).

2.5 小鼠組織病理學觀察

將小鼠心、肝、脾、肺、腎和腦組織浸入10%甲醛固定液中固定用于制作石蠟切片；HE染色后進行400×的圖像采集.

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結(jié) 果

3.1 體質(zhì)量曲線

由圖1可知，SCP組與CON組小鼠體質(zhì)量生長曲線均呈自然穩(wěn)定的上升趨勢，且兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05).

圖1 小鼠體質(zhì)量曲線

3.2 小鼠存活情況

本研究結(jié)果顯示：7 d內(nèi)小鼠全部存活，無一例死亡，也無中毒癥狀發(fā)生.見表1.

表1 小鼠中毒及死亡情況Tab.1 Poisoning and death of mice (n=10)

3.3 小鼠一般狀態(tài)

本研究結(jié)果顯示：SCP組與CON組比較，給藥7 d ICR 小鼠內(nèi)未出現(xiàn)臥伏、對外應激反應減少的現(xiàn)象，大小便正常，同時也未見其他異常反應.見表2.

表2 小鼠一般狀態(tài)Tab.2 General status of mice

3.4 小鼠行為學實驗

3.4.1 自主活動實驗

自主活動是正常動物的生理特征，可反映中樞興奮或抑制狀態(tài).大腦皮層興奮性與小鼠活動、站立次數(shù)成正相關關系[9].由圖2可知，SCP組與CON組比較，小鼠活動次數(shù)和站立次數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05).

圖2SCP對小鼠自主活動的影響Fig.2Effect of SCP on autonomous activity in

3.4.2 避暗實驗

避暗實驗是利用小鼠具有趨暗避明習性設計的，分為明室和暗室，在暗室中給予電擊，小鼠將被迫逃回明室[10].觀察5 min內(nèi)進入暗室的次數(shù)(避暗次數(shù))及首次進入暗室的時間(避暗潛伏期)，考察小鼠的學習記憶力，判斷小鼠行為狀態(tài).本研究結(jié)果顯示：與CON組比較，SCP組小鼠的避暗潛伏期和避暗次數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05).見圖3.

圖3SCP對小鼠避暗實驗的影響Fig.3Effect of SCP on mouse avoidance

3.4.3 抓力實驗

抓力測試可評價藥物對小鼠肢體力量及對肌肉力量的影響，同時也可作為小鼠衰老、神經(jīng)及肌肉損傷的判定標準[11].測定小鼠前肢抓力值結(jié)果顯示：與CON組比較，SCP組小鼠的抓力差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05).見圖4.

圖4SCP對小鼠抓力的影響Fig.4Effect of SCP on mouse

3.5 臟器指數(shù)及病理學觀察

本研究結(jié)果顯示：SCP組與CON組小鼠的臟器指數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3).SCP組與CON組小鼠各組織器官顏色及形態(tài)正常，肉眼觀察均無病變、出血點與壞死.各臟器組織切片HE染色結(jié)果見圖5.SCP組與CON組小鼠心肌形態(tài)正常，無淋巴細胞浸潤；肝臟細胞排列緊密，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索清晰，間質(zhì)無增生水腫；脾臟狀態(tài)良好，未見出血、水腫、壞死等病理變化；肺結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)無增生，無水腫、充血狀況，形態(tài)良好；腎臟組織腎小球結(jié)構(gòu)及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，管壁清晰，未見明顯增生；腦組織海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，并未發(fā)現(xiàn)排列紊亂及壞死情況.

表4 臟器指數(shù)Tab.4 Organ index

圖5組織病理學觀察Fig.5Histopathological observation

4 討 論

本研究通過五味子藤莖多糖的最大溶解量及最大灌胃量觀察實驗小鼠MTD.在灌胃7 d內(nèi)，未見SCP組小鼠死亡，小鼠體質(zhì)量曲線呈穩(wěn)定上升趨勢，全身狀態(tài)無明顯變化，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸及心血管系統(tǒng)、腸胃系統(tǒng)、眼及毛發(fā)等未出現(xiàn)異常，心、肝、脾、肺及腎等臟器指數(shù)也無明顯區(qū)別.

為初步探究SCP對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)、學習記憶能力以及運動耐力等方面的影響，我們進行了自主活動、避暗以及抓力實驗.在自主活動中，與CON組相比，SCP組小鼠活動次數(shù)和站立次數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在避暗實驗中，SCP組與CON組小鼠的避暗潛伏期和避暗次數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在抓力實驗中，未見SCP對小鼠前肢握力產(chǎn)生影響.可見，SCP對小鼠的基本活動、基本學習記憶行為以及運動耐力無顯著影響.除上述指標外，本研究還通過觀察組織形態(tài)學及臟器重量來判斷藥物影響[12].臟器指數(shù)可在一定程度上反映藥物對機體產(chǎn)生的毒性及藥物產(chǎn)生毒性的靶器官的影響[13]，例如，肺臟指數(shù)不但可以反映機體肺部炎癥情況，也可反映小鼠肺的損傷程度；脾臟指數(shù)則反映機體免疫功能；肝臟作為解毒器官，其質(zhì)量變化可能與外源化合物脅迫所導致的能量支出多少有關，可將肝臟指數(shù)作為一個指標觀察SCP對小鼠肝臟功能的影響.在本實驗中，SCP組與CON組小鼠臟器指數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05).臟器病理學組織切片能更直觀地觀察各臟器的病理變化，在一定程度上能夠反映動物生長發(fā)育及損傷情況[14-15].兩組小鼠病理切片顯示心、肝、脾、肺、腎及腦組織均無壞死及水腫等病變，肉眼觀察SCP組小鼠器官形態(tài)與CON組基本一致，說明SCP對小鼠主要臟器未見損傷.

綜上所述，在SCP的小鼠經(jīng)口MTD為24 g/kg，是五味子臨床推薦使用量的184倍，SCP在該劑量下對小鼠的生長、生理狀態(tài)及行為無影響.