張雅楠，薛君，董智慧

(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院老年科，內(nèi)蒙古自治區(qū) 包頭 014010)

2015年全球糖尿病患者最多的前10個國家中，中國位列第一，患病人數(shù)高達1.096億人[1]。近幾年，隨著強化降糖理念的推廣，低血糖發(fā)生率普遍升高，葡萄糖是大腦的能量來源，低血糖引起的能量供應(yīng)不足會引起腦的功能性損傷，嚴重時會導(dǎo)致腦組織的不可逆性死亡。研究證實，當(dāng)血糖降至2.8～3.2 mmol/L時，可出現(xiàn)易怒、注意力受損等癥狀；當(dāng)血糖為1.5～2.8時，可出現(xiàn)認知障礙、局部神經(jīng)功能損傷或神經(jīng)元壞死、凋亡等表現(xiàn)；當(dāng)血糖<1.5 mmol/L時，可出現(xiàn)不可逆型神經(jīng)元壞死、昏迷等嚴重后果[2]。另外研究表明，血糖在1.0 mmol/L以下時腦電波消失，在1.2～1.7 mmol/L 時，60 min左右腦內(nèi)葡萄糖將完全耗盡，神經(jīng)元會出現(xiàn)不可逆性損害[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)低血糖發(fā)生后給予升糖的過程中，出現(xiàn)了比低血糖期間更嚴重的神經(jīng)元死亡[4]。另有研究觀察到大鼠在誘導(dǎo)低血糖后給予靜脈輸注葡萄糖的過程中，大腦皮層壞死細胞會在血糖逐漸升高的過程中仍不斷增加，且氧化應(yīng)激指標比低血糖期間更高[5]。學(xué)者們認為低血糖引起腦損傷的過程中葡萄糖再灌注也參與其中，類似于缺血再灌注，因此人們提出了“葡萄糖再灌注損傷”的概念。目前，導(dǎo)致低血糖后葡萄糖再灌注腦損傷的確切分子機制仍不清楚，本文對相關(guān)機制及預(yù)防措施進行綜述。

1 機 制

1.1 氧化-抗氧化防御體系失衡

氧化應(yīng)激是引起神經(jīng)細胞損傷的重要機制，細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成過多可活化炎癥細胞，產(chǎn)生核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、白細胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及其他炎癥因子，從而啟動炎癥反應(yīng)，促進細胞凋亡。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是一種超氧化物生成酶，是產(chǎn)生ROS的主要酶，NADPH氧化酶的過度激活可促進ROS的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的經(jīng)胰島素誘導(dǎo)發(fā)生低血糖的大鼠神經(jīng)細胞，在給予葡糖糖再灌注后出現(xiàn)細胞內(nèi)NADPH氧化酶活性增高及鋅水平升高，并伴有神經(jīng)細胞的繼續(xù)死亡[6]。腦內(nèi)對損傷最敏感的每個區(qū)域都含有高濃度的突觸前囊泡鋅，鋅可以通過涉及蛋白激酶C的信號通路激活神經(jīng)元中的NADPH氧化酶。在給予鋅螯合劑(calcium disodium ethylenediamine tetraacetic acid，CaEDTA)阻止鋅水平升高后，NADPH氧化酶活性降低[6]。在另一個胰島素誘導(dǎo)的低血糖大鼠模型中，給予葡萄糖再灌注后不久就檢測到氧化應(yīng)激標志物硝基酪氨酸生成增多，而這種現(xiàn)象在低血糖期間并未出現(xiàn)[7]。

在葡萄糖輸注后1 h內(nèi)分別將血糖提升至1～2、5～10、10～15 mmol/L，血糖升高幅度較低組(1～2 mmol/L組)較血糖升高幅度高組(10～15 mmol/L組)超氧化物生成少，伴隨的神經(jīng)元死亡也較少[8]，說明低血糖后血糖升高水平過高會通過激活氧化應(yīng)激引起神經(jīng)元損傷。有研究還觀察到，給予提升血糖后，可溶性細胞間黏附分子1(soluble inter-cellular adhesion molecule-1，sICAM-1)、8異前列腺素F2α(8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α)和IL-6等表示內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激水平的因子較低血糖時進一步升高[9]，提示葡萄糖再灌注后不僅是細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)也增加，共同造成了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種抗氧化酶，可以清除機體內(nèi)超氧陰離子自由基，他包括了含錳超氧化物歧化酶酶(manganese superoxide dismutase, superoxide dismutase，MnSOD)和含銅鋅超氧化物歧化酶(copper zinc superoxide dismutase，CnZnSOD)兩種。MnSOD存在于線粒體基質(zhì)中，有較強的清除超氧陰離子的功能，因此MnSOD活性的增強或減弱都會影響機體氧化-抗氧化防御體系的平衡。體外培養(yǎng)的細胞，給予低血糖誘導(dǎo)后，與未輸注血糖之前相比，伴隨著輸注后血糖濃度的升高，MnSOD活性明顯下降[10]。說明葡萄糖灌注后機體抗氧化能力下降，氧自由基從線粒體膜流出，引起神經(jīng)細胞損傷。

1.2 自噬

自噬是為了適應(yīng)不利的微環(huán)境變化進化而來的一種保守機制，在營養(yǎng)供應(yīng)減少、應(yīng)激或其他代謝紊亂(如缺血、缺氧)的情況下維持細胞穩(wěn)態(tài)。在自噬過程中，細胞成分(包括功能異常的細胞器、脂質(zhì)囊泡或蛋白質(zhì)聚集體)被隔離成雙膜囊泡(自噬體)，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，這些過程稱為自噬通量。自噬體被溶酶體體內(nèi)的酸性水解酶降解，產(chǎn)生的分解產(chǎn)物被循環(huán)用于大分子合成和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的產(chǎn)生，一方面可以為機體合成代謝提供原料，另一方面可以降解功能異常的細胞器或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，維持細胞穩(wěn)態(tài)。

自噬機制的缺陷與許多疾病有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心血管疾病和感染性/炎癥性疾病及代謝性疾病。自噬通量可通過測量微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3Ⅰ)向微管相關(guān)蛋白2輕鏈3(microtubule-associated protein 2 light chain 3，LC3Ⅱ)的轉(zhuǎn)化率和自噬降解的底物水平，如自噬接頭蛋白(sequestosome-1，簡稱p62)來監(jiān)測。LC3Ⅱ及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高與p62水平的升高是自噬及自噬通量被抑制的可靠指標[11]。通過對培養(yǎng)的神經(jīng)細胞進行低血糖誘導(dǎo)，后予葡萄糖再灌注，發(fā)現(xiàn)隨著血糖的升高，p62水平及LC3Ⅱ及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，自噬通量被抑制，同時神經(jīng)細胞死亡增加。因此我們考慮葡萄糖再灌注后，自噬功能受損使神經(jīng)細胞在受到低血糖打擊后無法維持自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，進而出現(xiàn)凋亡。溶酶體功能障礙也會嚴重影響自噬通量功能。溶酶體超載可阻止自噬體與溶酶體融合，或影響溶酶體的降解功能。組織蛋白酶是溶酶體的主要蛋白酶，神經(jīng)細胞內(nèi)組織蛋白酶B、L和D的含量豐富。組織蛋白酶B和D是一種促凋亡蛋白，通過誘導(dǎo)線粒體外膜通透化，引起細胞色素C釋放和半胱氨酸蛋白酶(caspase)活化釋放。其中caspase3是一種凋亡執(zhí)行蛋白酶，激活后可引起與DNA修復(fù)、mRNA(messenger RNA)裂解、類固醇合成及細胞骨架重建等有關(guān)的功能蛋白的降解，導(dǎo)致核質(zhì)濃縮，核膜、核仁碎裂，DNA裂解和mRNA衰變等，引起細胞凋亡。低血糖再灌注過程中組織蛋白酶D和B的表達增加，皮層神經(jīng)元出現(xiàn)進一步死亡[12]。葡萄糖再灌注后溶酶體功能障礙通過影響自噬及通過組織蛋白酶激活caspase3來誘導(dǎo)神經(jīng)損傷。

1.3 誘導(dǎo)細胞凋亡

凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因包括Bcl-2家族、caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等。凋亡過程的失控可能與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中調(diào)節(jié)細胞凋亡的兩個重要基因，Bax對細胞凋亡有促進作用，而Bcl-2可抑制凋亡，延長細胞壽命。當(dāng)Bax蛋白被激活時，其功能是結(jié)合并誘導(dǎo)線粒體膜通透化。這種通透性導(dǎo)致線粒體腫脹和破裂，隨后膜內(nèi)蛋白(尤其是細胞色素c和核酸內(nèi)切酶G)從線粒體膜流出，激活caspase，誘導(dǎo)細胞凋亡。

研究顯示，低血糖后血糖升高過快和過慢都會使Bax/Bcl-2的比值明顯升高[13]。不合適的升糖速度使Bax和Bcl-2這兩個凋亡蛋白的表達失衡，加速了神經(jīng)細胞的凋亡進程。叉頭框O(forkhead box O3，F(xiàn)OXO)轉(zhuǎn)錄因子已成為神經(jīng)系統(tǒng)中細胞命運和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。FOXO的作用范圍包括神經(jīng)干細胞的維持，激活ROS的抑制，細胞凋亡的誘導(dǎo)，通過自噬的參與和兒茶酚胺生物合成的調(diào)節(jié)來促進生存。FOXO活性的主要調(diào)節(jié)劑之一是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/ 蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)途徑。研究顯示，與未給予再灌注的細胞相比，將PC-12(nerve cell line-12)細胞暴露于葡萄糖剝奪/再灌注的培養(yǎng)基內(nèi)(含有0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基持續(xù)6 h，然后含有25 mmol/L葡萄糖的DMEM持續(xù)18 h)，細胞活力降低及死亡增多，磷酸化Akt和Bcl-2的表達降低以及caspase-3裂解表達的升高[14]。在抑制PI3K/Akt途徑后，F(xiàn)OXO轉(zhuǎn)錄因子位于細胞核中，這會導(dǎo)致細胞周期停滯，應(yīng)激抗性和細胞死亡。激活的PI3K/Akt途徑將FOXO蛋白從細胞核重新定位到細胞質(zhì)，并抑制FOXO依賴性轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細胞增殖，應(yīng)激敏感性和細胞存活。反復(fù)的葡萄糖剝奪/再灌注引起的PC-12細胞死亡與FOXO轉(zhuǎn)錄因子易位有關(guān)，F(xiàn)OXO易位通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、caspase-3)的表達誘導(dǎo)凋亡。

1.4 鈣離子超載及鈣蛋白酶激活

有研究顯示，低血糖后血糖升高幅度過高(>9 mmol/L組)和過低(1～3 mmol/L組)都可以使細胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，誘發(fā)神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子超載[13]。胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子具有多種功能，參與細胞的跨膜蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及以鈣離子為介導(dǎo)的神經(jīng)弧反應(yīng)。當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度快速升高，出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象時，細胞內(nèi)增多的鈣離子會激活包括磷脂酶、鈣蛋白酶及核酸內(nèi)切酶等在內(nèi)的多種酶，引起神經(jīng)細胞磷脂雙分子層分解及細胞蛋白骨架結(jié)構(gòu)的破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞的永久性損傷[15]。在低血糖后葡萄糖輸注的第1小時，觀察到鈣離子濃度增加，鈣蛋白酶激活，由鈣蛋白酶介導(dǎo)溶酶體膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP2)降解，導(dǎo)致溶酶體膜通透化(link Manager Protocol，LMP)，LMP會引起自噬通量受損和細胞存活率降低。且溶酶體內(nèi)容物組織蛋白酶B及組織蛋白酶D釋放增加，組織蛋白酶B可以移位到細胞核并引起核損傷和染色質(zhì)凝結(jié)，導(dǎo)致細胞死亡[16]。組織蛋白酶B或D通過切割Bid(Bid gene)介導(dǎo)caspase依賴性細胞凋亡[17]。運用鈣蛋白酶抑制劑后，溶酶體膜通透性降低，組織蛋白酶B及D釋放減少，且增加了含有溶酶體和自噬體的神經(jīng)元量數(shù)，從而增加細胞活力[18]。另外鈣離子的超載可以損害線粒體膜的完整性，使線粒體膜通透性增加，ATP合成酶活性降低，引起細胞能量合成障礙[19]。

1.5 PARP-1改變

聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]充當(dāng)DNA損傷傳感器，它識別DNA損傷并通過募集DNA修復(fù)機器(DNA修復(fù)蛋白和核酸酶)到損傷部位來促進DNA修復(fù)。在DNA修復(fù)中，PARP-1使組蛋白發(fā)生聚腺苷二磷酸核糖基化，使DNA或染色體的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生松弛改變，從而促進DNA的修復(fù)及調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄[20]。研究顯示PARP-1酶的缺失使DNA的損傷加劇，體外和體內(nèi)研究表明抑制PARP-1可降低DNA修復(fù)功能[21]。實驗研究顯示，大鼠被誘導(dǎo)低血糖后升高血糖至>9 mmol/L時，可以觀察到神經(jīng)細胞中PARP-1的含量明顯減少，低于未予升糖處理的大鼠[13]。因此，葡萄糖再灌注后降低了PARP-1水平，損傷了細胞的DNA修復(fù)功能。

1.6 α-酮戊二酸脫氫酶

α-酮戊二酸脫氫酶(alpha ketoglutarate dehydrogenase，α-KGDHC)是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，包含E1、E2和E3三個亞基，α-KGDHC催化α酮戊二酸氧化脫羧為琥珀CoA，參與細胞的能量代謝。E3亞基又稱二氫脂酰胺脫氫酶(dihydrolipoyl dehydrogenase，LADH)，是一種黃素酶，是α-KGDHC中一個重要的亞基，被認為是α-KGDHC產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的原因。與衰老、缺血再灌注、神經(jīng)退行性疾病和癌癥相關(guān)的氧化損傷有關(guān)。研究顯示神經(jīng)元細胞的變性，腦梗死后血流再灌注損傷及其他神經(jīng)病理變化與α-KGDHC功能的失活及其產(chǎn)生的ROS密切相關(guān)[22]。ROS的產(chǎn)生同時與細胞凋亡有關(guān)系，ROS可以使神經(jīng)細胞線粒體膜上細胞凋亡信號受體激活，從而啟動內(nèi)源性細胞凋亡途徑。ROS的產(chǎn)生還可以激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細胞-小膠質(zhì)細胞，介導(dǎo)一系列免疫應(yīng)激反應(yīng)，釋放炎癥因子[23]。低血糖后過快的升糖速度會減少神經(jīng)細胞中α-KGDHC的含量，不利于神經(jīng)細胞的能量供應(yīng)。同時會導(dǎo)致神經(jīng)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，促進神經(jīng)細胞的凋亡[13]。

2 預(yù)防措施

2.1 調(diào)整血糖升高速度及水平

有學(xué)者在減輕低血糖后葡萄糖再灌注腦損傷方面做了一些相關(guān)研究。徐周偉等[13]觀察輸注血糖1 h后，血糖上升的程度對腦組織的影響，結(jié)果顯示，血糖升高過快(>9 mmol/L)和過慢(<1～3 mmol/L)都可加速神經(jīng)細胞的損傷進程。他們認為，低血糖后，過慢、過快的升高血糖都會加重葡糖糖再灌注腦損傷。余愛勇等[24]實驗中將大鼠誘導(dǎo)低血糖后，分為快速再灌注組(以2.8～3.0 ml/h灌注25%葡萄糖，在5～10 min內(nèi)將血糖水平升至5～6 mmol/L)和慢速再灌注組(以1.2～1.4 ml/h灌注25%葡萄糖，在20～30 min內(nèi)將血糖水平升至5～6 mmol/L)，結(jié)果顯示慢速再灌注組大鼠腦組織神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu)損害更輕。另有一項國外動物實驗研究表明，在低血糖后的第1小時內(nèi)將血糖恢復(fù)到1～2 mmol/L，與恢復(fù)到較高的葡萄糖水平(>5 mmol/L)相比，減少了超氧化物的產(chǎn)生，并減少了神經(jīng)元的死亡[25]。這些數(shù)據(jù)表明，低血糖昏迷患者逐漸校正血糖可能比更快速的校正更為可取，如何選擇適當(dāng)?shù)墓嘧⑺俣冗€有待進一步研究。值得肯定的是，相比較于迅速糾正血糖甚至造成高血糖，逐漸糾正低血糖更有助于減輕葡萄糖再灌注損傷。

2.2 低溫及藥物干預(yù)

Shin等[26]研究顯示，葡萄糖再灌注后，隨著大鼠顱內(nèi)溫度由40 ℃降至33 ℃，Zn2+釋放減少，過氧化物產(chǎn)生減少，其神經(jīng)膠質(zhì)細胞死亡明顯減少，由此我們推測這種腦損傷可能是溫度依賴性的，適度降低顱內(nèi)溫度可能減輕損傷。溫度降低3 ℃～5 ℃就可以顯著降低代謝率，降低耗氧量及能量消耗，保存能量底物。這已被應(yīng)用于能量輸送中斷的心臟手術(shù)中以減少大腦損傷。對中風(fēng)患者實施低溫治療也可以減少損傷，因此，在代謝損傷(中風(fēng)、低血糖)發(fā)生后實施低溫治療在臨床上是有益的。有研究表明，在37 ℃時，經(jīng)過1 h的低血糖和1 h的再灌注后，大腦白質(zhì)受損神經(jīng)元大約恢復(fù)49%[27]。另有研究證實，使用維拉帕米可通過阻斷鈣離子內(nèi)流減輕低血糖引起的海馬和皮層損害，同時可以防止嚴重低血糖引起的記憶障礙[28]。故維拉帕米可作為一種神經(jīng)保護劑，減輕糖尿病患者發(fā)生嚴重低血糖后引起的腦功能障礙?？寡趸瘎┚S生素C具有清除氧自由基的作用，可通過改善低血糖后高血糖引起的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，從而減輕腦損傷及血管內(nèi)皮功能損傷。Ceriello等[29]研究中發(fā)現(xiàn)給予胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)類似物干預(yù)低血糖后葡萄糖再灌注過程，會使內(nèi)皮氧化應(yīng)激指標sICAM-1、8-iso-PGF2α、硝基酪氨酸和IL-6明顯降低，提示GLP-1類似物可減輕此過程中內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，對腦損害起一定保護作用。維生素C和GLP-1同時注入能更好地緩解再灌注引起的腦損傷[29]。

3 小 結(jié)

類似于缺血再灌注，低血糖后給予葡萄糖再灌注導(dǎo)致了腦組織的二次損傷。這種損傷的發(fā)生可能與氧化應(yīng)激、自噬、細胞凋亡、鈣離子超載、鈣蛋白酶的激活、PARP-1改變、α-酮戊二酸脫氫酶有關(guān)。葡萄糖再灌注腦損害的發(fā)現(xiàn)讓臨床醫(yī)師在糾正低血糖時有進一步的思考。目前對于葡萄糖再灌注腦損傷沒有明確有效的方法，減少這種損傷的根本預(yù)防措施是減少低血糖的發(fā)生。未來我們應(yīng)該在低血糖后血糖的提升速度及水平方面多加研究，選擇一個適宜的范圍，為臨床醫(yī)師能更科學(xué)地糾正低血糖提供參考。