任晨吟 付益修

1.杭州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；2.杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053

抗生素耐藥性的演變是一個自然過程，是病原微生物與環(huán)境相互作用的預(yù)期結(jié)果。2017 年世界衛(wèi)生組織公布了首份亟需新型抗生素治療的重點(diǎn)病原體清單，其中大腸埃希菌排名第三位。大腸埃希菌作為臨床分離株中最常見的細(xì)菌，可以分為共生菌和致病菌，其中致病菌又可以分為腸道致病大腸埃希菌（entero pathogenicEscherichia coli，DPEC）和腸道外致病大腸埃希菌（extraintestinal pathogenicEscherichia coli，Ex-PEC）[1]。DPEC 大多為機(jī)會致病菌，在免疫力低下人群中可引起嚴(yán)重后果。另外，近年來ExPEC 感染率呈上升趨勢[2]，在臨床上引起尿路、腹腔、肺部、皮膚和軟組織感染，菌血癥，新生兒腦膜炎等病癥[3]。耐藥性大腸埃希菌在臨床上的普遍性及其引起的嚴(yán)重后果應(yīng)當(dāng)引起重視。研究發(fā)現(xiàn)不同感染性疾病中分離的大腸埃希菌抗生素耐藥性的結(jié)果也不同。為此，本文對臨床常見的大腸埃希菌耐藥現(xiàn)狀、耐藥機(jī)制及治療方法等幾個方面的研究進(jìn)行綜述。

1 致病性大腸埃希菌抗生素耐藥現(xiàn)狀

臨床上常見的致病性大腸埃希菌分離株有尿路致病性大腸埃希菌（urinary tract pathogenicEscherichia coli，UPEC）、侵入性大腸埃希菌（invasiveEscherichia coli，EIEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC）、彌散黏附性大腸埃希菌（diffuse adhesiveEscherichia coli，DAEC）、腸集聚性大腸埃希菌[1]。UPEC 作為臨床上常見的ExPEC，可從正常腸道菌群轉(zhuǎn)移至泌尿道并持續(xù)表達(dá)各種毒力因子，因而引起泌尿系統(tǒng)疾病。近年來，UPEC 抗生素耐藥現(xiàn)狀嚴(yán)峻，特別是第三代頭孢菌素和氟喹諾酮類抗生素耐藥性顯著增加[4]。2018 年，Raeispour等[5]發(fā)現(xiàn)從伊朗德黑蘭尿路感染患者中分離出的多數(shù)大腸埃希菌對頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生耐藥，其中對頭孢吡肟耐藥率已經(jīng)高達(dá)100%。巴斯德研究所Shahbazi等[6]分離的UPEC 對氨芐西林耐藥率達(dá)78.3%。2020 年，Sun等[7]發(fā)現(xiàn)UPEC 對氨芐西林耐藥率高達(dá)100%，四環(huán)素耐藥率達(dá)96.4%，頭孢唑啉、頭孢噻肟等抗生素耐藥率大于92.0%，上述研究表明，UPEC 的耐藥率呈逐年上升趨勢，耐藥抗生素種類不斷增加。此外，EIEC感染性強(qiáng)，可通過血腦屏障侵入腦脊液，從而產(chǎn)生嚴(yán)重后果，臨床多見膿毒菌血癥和新生兒腦膜炎等疾病。Begier等[8]分析了美國2009—2016 年入院就診患者分離出的EIEC 數(shù)據(jù)，表明人群對EIEC 的感染率不斷上升，并發(fā)現(xiàn)EIEC 對超廣譜頭孢菌素的耐藥性呈增加趨勢。STEC 是一種腸道病原體，可導(dǎo)致人患多種胃腸道疾病。Rubab等[9]對取自人類的40 株菌株進(jìn)行了圓盤擴(kuò)散法檢測，結(jié)果顯示74.5%的大腸埃希菌分離株對50%的測試抗生素具有耐藥性。所有菌株都對甲氧西林、青霉素、紅霉素、萬古霉素耐藥，其中98%的菌株對慶大霉素耐藥。在發(fā)展中國家，腹瀉是尤為嚴(yán)重的胃腸道健康問題。研究表明，DAEC 的感染是導(dǎo)致腹瀉的重要原因。Javadi等[10]調(diào)查伊朗南部某醫(yī)院DAEC 的流行率和抗生素耐藥性，在66.9%的糞便樣本中檢測出大腸埃希菌，并對腹瀉性DAEC 分離株進(jìn)行了11 種抗生素的藥敏試驗，其中所測DAEC 對氨芐青霉素全部耐藥，92.8%的DAEC 株對亞胺培南敏感?？股氐牟灰?guī)范使用，不僅使同一種致病性大腸埃希菌對多種抗生素耐藥，又使耐藥的致病性大腸埃希菌種類增加。致病性大腸埃希菌的耐藥形勢嚴(yán)重。

2 致病性大腸埃希菌的耐藥機(jī)制

2.1 移動遺傳元件

移動遺傳元件包括質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子。多重耐藥性大腸埃希菌菌株的流行率不斷增長，移動遺傳元件（mobile genetic element，MGE）中的抗生素抗性基因（antibiotic resistance gene，ARG）的出現(xiàn)是重要原因之一[11]。質(zhì)粒介導(dǎo)的抗生素抗性基因的持續(xù)進(jìn)化和替代導(dǎo)致了新酶的出現(xiàn)和耐藥性的水平傳播[12]。目前，大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)最多的是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-Lactamase，ESBLs）。Asadi Karam等[13]對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的尿路致病性大腸埃希菌基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其耐藥的主要機(jī)制是bla-TEM、bla-SHV 和bla-CTX-M 基因編碼β-內(nèi)酰胺酶，其中TEM-1、TEM-2、SHV-1 基因占主導(dǎo)作用；另外，由質(zhì)粒編碼的五肽重復(fù)序列蛋白Qnr 可保護(hù)DNA 旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶免受喹諾酮類藥物破壞的耐藥機(jī)制也已引起重視。整合子由整合酶基因（intl）、相關(guān)重組位點(diǎn)（atll）、基因盒（GCs）和啟動子（Pc）組成[12]。整合子多功能結(jié)構(gòu)使其可以捕獲，整合，轉(zhuǎn)錄外源基因，最終導(dǎo)致水平基因的轉(zhuǎn)移，從而介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的形成[11]。根據(jù)整合酶基因進(jìn)行分類，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子與細(xì)菌耐藥性有關(guān)，其中Ⅰ類整合子可捕獲大量來自抗生素抗性基因庫的基因盒，成為臨床最常見的整合子，Ⅰ類整合子在UPEC 分離株中流行率達(dá)47%[14]。另外，轉(zhuǎn)座子可借助細(xì)菌染色體、噬菌體或質(zhì)粒復(fù)制插入或轉(zhuǎn)移ARG[15]。

2.2 靶點(diǎn)突變及修飾

細(xì)菌表面有各種抗菌藥物的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)這些結(jié)合位點(diǎn)的靶蛋白發(fā)生突變或經(jīng)一些酶修飾后使抗菌藥物無法識別而失活，從而產(chǎn)生耐藥性。青霉素結(jié)合蛋白（Penicillin binding protein，PBPs）結(jié)構(gòu)改變或合成量增多都可以導(dǎo)致細(xì)菌對β 內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性[16]；DNA 促旋酶GyrA 基因突變導(dǎo)致Ser83 位點(diǎn)的氨基酸改變，酶和藥物的親和力下降，從而導(dǎo)致細(xì)菌對喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥性；16sRNA 甲基化酶修飾30S 核糖體亞基導(dǎo)致氨基苷類抗生素?zé)o法與核糖體結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的合成達(dá)到殺菌效果從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[7]。由此可見，抗生素靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)及數(shù)量變化都可以引起抗生素耐藥性。

2.3 滅活酶

目前研究較多的抗生素滅活酶主要包括β-內(nèi)酰胺酶和氨基苷類的鈍化酶。β-內(nèi)酰胺酶是耐β-內(nèi)酰胺類抗生素細(xì)菌產(chǎn)生的能使藥物結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)水解從而失去活性的一類酶。從1940 年發(fā)現(xiàn)至今已達(dá)200 多種，根據(jù)BJM 分類法以酶作用底物是否相同、是否被酶抑制劑抑制分為4 大類11 小類。目前ESBLs 備受關(guān)注，這類酶能夠水解頭孢菌素如頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟[17]。Asadi Karam等[13]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs 尿路致病性大腸埃希菌分離株對β-內(nèi)酰胺類、氨基苷類和喹諾酮類的耐藥率都很高。另外，細(xì)菌產(chǎn)生的鈍化酶可以滅活氨基苷類抗生素，鈍化酶包括氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷類核苷轉(zhuǎn)移酶和氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶，它們分別將乙?；?、腺苷、磷酸連接到氨基苷類抗生素的氨基或羥基上，使藥物不能與核糖體結(jié)合而失效[7]。

致病大腸埃希菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜，除上述抗性基因的出現(xiàn)、抗生素靶點(diǎn)的變化及滅活酶等機(jī)制以外，外排泵系統(tǒng)、細(xì)胞膜通透性的改變及生物膜都可使大腸埃希菌產(chǎn)生耐藥性。AcrAB-TolC RND 外排泵介導(dǎo)大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類以及氟喹諾酮類抗生素的天然耐藥性[18]。生物膜（biofilm，BF）是細(xì)菌附著在機(jī)體體腔或生物材料表面并分泌多糖蛋白復(fù)合物將自身包裹的黏液層[15,19]。生物膜既可以形成物理屏障產(chǎn)生抗生素耐藥，又通過協(xié)同作用誘導(dǎo)基因產(chǎn)生特異的表型影響抗生素活性。研究表明，產(chǎn)生生物膜的大腸埃希菌的抗生素耐藥性明顯高于不產(chǎn)生生物膜的大腸埃希菌[20]。

3 致病性大腸埃希菌耐藥菌株治療方法

致病性大腸埃希菌耐藥菌株的出現(xiàn)給感染性疾病的預(yù)防治療提出挑戰(zhàn)。為緩解致病性大腸埃希菌的耐藥現(xiàn)狀，應(yīng)遵循抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則[21]，此外，也應(yīng)拓展新的非抗生素治療方式。

3.1 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)利用噬菌體有效遞送編碼sgRNA 和Cas9 的基因，其中sgRNA 與靶基因序列互補(bǔ)，可選擇性地定位于靶基因上，結(jié)合Cas9 蛋白的核酸內(nèi)切酶活性，當(dāng)靶基因位于耐藥質(zhì)粒上，Cas9 蛋白的切割會導(dǎo)致質(zhì)粒丟失，使耐藥菌再敏化；當(dāng)靶基因位于細(xì)菌基因組上時，Cas9 蛋白的切割會導(dǎo)致雙鏈斷裂，直接使耐藥菌死亡[22]。目前，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)已在細(xì)菌耐藥領(lǐng)域取得較大進(jìn)展。Kim等[23]應(yīng)用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)殺死產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌。Hao等[24]基于CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，靶向耐碳青霉烯酶大腸埃希菌中耐藥基因或質(zhì)粒，使其恢復(fù)對碳青霉烯類抗生素的敏感性。

3.2 中藥

研究表明，中藥可以產(chǎn)生抗菌作用且不易產(chǎn)生耐藥性或降低已有的耐藥性[25]。李海華等[26]對45 味中藥進(jìn)行了多重耐藥大腸埃希菌的抑菌效果檢測，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌對博落回、黃連、五味子等十味中藥高度敏感。在某單味中藥存有抗菌作用的基礎(chǔ)上，與其他中藥制備成方劑效果更佳，寧官保等[27]發(fā)現(xiàn)黃連若與其他中藥制備成三黃湯和黃連解毒湯，對大腸埃希菌耐藥性消除率高于單味中藥，并可以抑制ESBLs 的活性，從而降低致病性大腸埃希菌的耐藥性[28]。此外，中藥復(fù)方清熱顆?？稍黾涌椎鞍譕mpF 改變細(xì)胞膜通透性[29]，川貝母可抑制多重耐藥大腸埃希菌生成生物膜[30]，兩者在聯(lián)合抗生素使用的情況下，可使抗生素充分發(fā)揮效能，降低致病性大腸埃希菌的耐藥性。

除上述CRISPR-Cas 系統(tǒng)、中藥等新的非抗生素療法以外，噬菌體-抗生素的聯(lián)合療法、光動力療法也都具有良好的應(yīng)用前景[31]。Moradpour等[32]對耐藥大腸埃希菌0157 采用了噬菌體-抗生素聯(lián)合療法，兩者協(xié)同抑制大腸埃希菌耐藥性的產(chǎn)生。另外，有研究表明，光動力療法通過破壞抗生素滅活酶、外排泵系統(tǒng)或者改變抗生素靶點(diǎn)、ARG，還原大腸埃希菌對抗生素的敏感性[33]。Feng等[34]首次證明，使用抗菌光動力療法可以防止碳青霉烯類抗生素被碳青霉烯酶降解，從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生碳青霉烯酶的耐藥菌對碳青霉烯類抗生素再敏感化。

4 討論

致病性大腸埃希菌作為臨床上常見的致病菌，可引起多種組織器官的感染。致病性大腸埃希菌抗生素耐藥狀況日益嚴(yán)重，耐藥致病性大腸埃希菌種類增加，并出現(xiàn)一種致病性大腸埃希菌對多種抗生素耐藥的現(xiàn)狀。致病性大腸埃希菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，移動遺傳元件、滅活酶、藥物靶點(diǎn)的突變或修飾均可介導(dǎo)致病性大腸埃希菌耐藥的發(fā)生，但耐藥機(jī)制的新研究也為新藥研發(fā)提供了方向。在后抗生素時代，新型抗生素的研發(fā)速度緩慢，耐藥致病性大腸埃希菌的出現(xiàn)給臨床治療提供了新的挑戰(zhàn)，隨著中藥學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展及多學(xué)科交叉融合，研究人員提出了許多新型的抗菌方法，CRISPR-Cas 系統(tǒng)為耐藥致病性大腸埃希菌抗生素再敏感化提供了新機(jī)會，中藥在耐藥致病性大腸埃希菌的治療中表現(xiàn)出良好的作用，這些新方法新技術(shù)為治療耐藥致病性大腸埃希菌感染性疾病指明新方向，但將這些新方法運(yùn)用到臨床，還需要更多的研究及努力。