姚景宏，李加歡，劉子建

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 感染科， 湖北 武漢 430022；2.華中科技大學 同濟醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院 解剖學系，湖北 武漢 430030)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染是一個全球公共衛(wèi)生問題，約感染2.5%的人口，是造成肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌等肝臟相關疾病的主要原因[1]。干擾素是臨床上最常用的抗病毒藥物，但慢性丙型肝炎患者接受干擾素α(interferon α, IFNα)治療后有超過20%出現(xiàn)神經精神綜合征，如抑郁癥，其機制仍未闡明[2]。DISC1(disrupted-in-schizophrenia 1)是一種多功能的神經元突觸后致密物蛋白，與神經元干細胞分化、遷移以及神經元可塑性等關系密切，DISC1基因突變或功能異常與家族性精神分裂或抑郁癥等精神疾病的發(fā)生緊密相關[3]。慢性應激和炎性反應是精神疾病的重要致病因素，但炎性反應對DISC1的表達及功能影響尚不清楚。TLR3(Toll-like receptor 3)受體屬于天然免疫受體，能感知病毒感染，啟動抗病毒天然免疫反應。中樞神經系統(tǒng)內多種細胞都表達TLR3，其中神經細胞表達的TLR3激活后可抑制神經前體細胞的增殖、分化，影響神經元突生長錐的生長[4]。聚肌胞苷酸(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid, polyI:C)是人工合成的雙鏈RNA，能與TLR3特異性結合激活天然免疫，誘導合成、釋放炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素，模擬病毒感染[5]。IFNα是細胞感染病毒后首先產生的細胞因子之一，能通過JAK-STAT通路抑制病毒復制，并調節(jié)天然免疫和獲得性免疫反應[6]。在中樞神經系統(tǒng)，外源性IFNα可影響神經內分泌功能、睡眠-覺醒周期，增加神經元興奮性等[7]。本文通過研究polyI:C與IFNα對神經元DISC1表達的影響，探討病毒感染后IFNα治療誘導抑郁癥的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級C57BL/6J孕鼠(同濟醫(yī)學院實驗動物中心，SYXK2016-0057)。重組小鼠IFNα、鼠抗β-actin抗體(Sigma-Aldrich公司)；polyI:C(LMW)、B27、Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；兔抗DISC1多克隆抗體(Santa Cruz生物公司)；兔抗STAT1、磷酸化STAT1(p-STAT1)、兔抗MAPK p38和磷酸化MAPK p38(p-p38)抗體(Cell Signaling Technology公司)；鼠抗PSD-95單克隆抗體(Synaptic System公司)；RNA提取試劑盒、real time PCR試劑盒及引物(Qiagen公司)；PCR引物信息(表1)。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primers used for RT-qPCR

1.2 方法

1.2.1 神經元的分離、培養(yǎng)及分組處理：取C57BL/6J小鼠的E17-E18胚鼠，冰上取腦，解剖顯微鏡下取出海馬組織，0.125%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，拋光的巴氏管機械分離細胞，以2×105/mL種植在24孔培養(yǎng)板，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，促使細胞貼壁后，改用含2% B-27的Neurobasal培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一半，第7天可見典型的神經元，胞體折光性好，突起豐富。經MAP-2免疫細胞化學鑒定，神經元純度≥95%。第9天將神經元分為4組：1)對照組(control);2)polyI:C組;3)IFNα組;4)共刺激組(co-stimulation)，同時用polyI:C 和IFNα處理細胞。IFNα終濃度為1×108IU/L，polyI:C終濃度為1.0 g/L。對各組神經元刺激24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-qPCR檢測mRNA：提取細胞總RNA，取1 000 ng樣本總RNA進行RT-qPCR檢測。實驗結果與管家基因β-actin拷貝數(shù)標準化，所有樣本均作復孔并重復3次，并用Bio-Rad CFX Manager處理結果。

1.2.3 免疫細胞化學染色檢測蛋白：將蓋玻片用0.01 mol/L PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，依次加入含0.125% Triton X-100的PBS液、1∶50的正常小牛血清中封閉30 min。加一抗于4 ℃濕盒內孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，各步驟之間用PBS漂洗3次，Prolong Gold試劑封片。Carl Zeiss Apotome熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.4 Western blot檢測：用PBS緩沖液洗細胞3遍，加入細胞裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L sodium pyrophosphate，1 mmol/L beta-glycerophosphate，1 mmol/L Na3VO4，1 μg/mL leupeptin，100 μg/mL PMSF，pH 7.5)，冰上靜置20 min裂解細胞，裂解液在4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清。部分細胞裂解液中加入磷酸酶混合抑制劑。用BCA試劑盒進行樣品蛋白濃度的測定。每組蛋白15 μg上樣以恒壓(110 V)電泳2.5 h；電轉法將蛋白質從凝膠轉移至PVDF膜，轉移電流300 mA，轉移時間2 h；隨后將PVDF膜用含5% BSA的TBS封閉液于室溫封閉1 h，與一抗在雜交袋內4 ℃孵育過夜，再與HRP標記羊抗兔IgG(1∶12 000)在雜交袋內37 ℃溫育1 h，ECL顯色，F(xiàn)usion FX拍照保存。圖像經軟件Image J進行相對吸光度測定，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 RT-qPCR結果

干擾素刺激基因15(interferon stimulated gene, ISG15)是對IFNα刺激高反應的基因，在IFNα組和共刺激組，ISG15 mRNA表達均顯著升高(P<0.001)，但在共刺激組，經polyI:C和IFNα共同處理24 h后，DISC1 mRNA的表達顯著低于對照組(P<0.05)(圖1)。

2.2 免疫細胞化學染色結果

培養(yǎng)至第9～11天的小鼠海馬神經元突起豐富，胞體折光性好，進一步行MAP2免疫細胞化學鑒定表明：神經元純度>90%。予以IFNα或polyI:C刺激24 h后，未見明顯細胞死亡。Tau-1和DISC1免疫雙標結果顯示：對照組神經元胞體和突起均有Tau-1和DISC1表達，而polyI:C組和IFNα組Tau-1和DISC1的表達與對照組相比無明顯變化。而共刺激組Tau-1表達無明顯變化，DISC1的定位雖無改變，但其表達明顯減弱(圖2)。

圖2 免疫細胞化學染色顯示TLR3激活和IFNα共刺激抑制神經元表達DISC1

2.3 Western blot檢測結果

與對照組相比，polyI:C組和IFNα組神經元DISC1的表達無顯著差異，而共刺激組DISC1蛋白的表達明顯降低(F=24.99，P<0.01)(圖3A)。轉錄因子STAT的磷酸化在IFNα組和共刺激組顯著增加。p38 MAPK是TLR3介導抗病毒狀態(tài)的關鍵下游信號分子，其磷酸化水平在polyI:C組和共刺激組亦顯著增高。此外，各組之間GSK-3β與p-GSK-3β的表達并無改變(圖3B～C)。

A.the protein expression and statistical analysis of DISC1 in different groups;B.the protein expression and statistical analysis of p-STAT1 and STAT1 in different groups;C.the protein expression and statistical analysis of p-p38 MAPK, p38 MAPK, p-GSK-3β, GSK-3β in different groups; *P<0.05 compared with control group

3 討論

丙型肝炎患者接受IFNα、利巴韋林聯(lián)合治療后有超過20%出現(xiàn)抑郁癥表現(xiàn)，其分子機制尚不清楚[2]。DISC1基因是目前已知的與精神分裂癥、抑郁癥等精神疾病密切相關的遺傳風險基因之一，其發(fā)生點突變或表達異常與精神分裂癥患者的認知功能損害存在一定關聯(lián)[3]，但其機制仍待闡明。

DISC1是一種多功能的突觸后腳手架蛋白，在神經元的細胞核、胞質、中心體、線粒體、細胞骨架、神經突起以及突觸等部位廣泛表達[8]。在成年鼠，DISC1主要在海馬齒狀回、海馬下托、內嗅皮層及嗅球高表達，以齒狀回表達最高[9]。研究表明DISC1參與調節(jié)神經干細胞的增殖、分化和新生神經元的遷移，并可通過調節(jié)GABA受體或NMDA受體信號影響神經元的突起生長、突觸形成。腹腔注射NMDA受體拮抗劑鹽酸美金剛胺可降低成年小鼠海馬DISC1蛋白表達，并使齒狀回新生神經元發(fā)生異位遷移[10]。本實驗結果顯示，在polyI:C和IFNα共同刺激下，培養(yǎng)神經元DISC1 mRNA和蛋白水平均顯著下降，而單獨polyI:C或IFNα刺激，DISC1的表達無顯著變化，說明只有天然免疫受體激活聯(lián)合IFNα刺激下才會影響DISC1的表達。

IFNα是一種抗病毒細胞因子，臨床常用于某些病毒感染(如HCV)或腫瘤治療。在中樞神經系統(tǒng)中，IFNα與細胞表面的Ⅰ型IFN受體結合后，通過激活JAK/STAT信號，誘導神經細胞產生更多的IFNα和其他細胞因子，如IL-6、IL-1、TNFα等，抑制神經元長時程增強和興奮型突觸后電位[11]。polyI:C是天然免疫模式識別受體TLR3的合成配體，能激活TLR3受體及其下游信號通路，如NFκB、p38 MAPK和ERK信號，模擬病毒感染激活天然免疫[12]。在中樞神經系統(tǒng)中，TLR3激活參與神經干細胞的增殖、分化調節(jié)，影響神經元可塑性[13]。本實驗中，在polyI:C和IFNα共刺激組，神經元內p38 MAPK和STAT1磷酸化水平均顯著升高，提示p38 MAPK和JAK/STAT1信號通路激活參與了DISC1表達的調節(jié)。

GSK-3β是重要的信號分子，參與調節(jié)神經系統(tǒng)發(fā)育、神經遞質功能和突觸可塑性，其功能失調與老年癡呆、精神分裂癥、抑郁癥等神經精神疾病的發(fā)生密切相關[14]。由DISC1的基因多態(tài)性產生的突變體可干擾Wnt/ GSK-3信號，進而影響神經發(fā)育[15]。DISC1蛋白通過GSK-3β相互作用可抑制其活性，但本實驗結果顯示GSK-3β的表達及磷酸化水平在各組之間無顯著差異，提示在polyI:C和IFNα的炎性刺激下，神經元的DISC1表達雖受到抑制，但GSK-3β表達及功能尚未受影響，說明可能存在其他代償機制維持神經元GSK-3β的功能。

綜上，本研究證實了TLR3激活聯(lián)合IFNα刺激可通過激活p38 MAPK和JAK/STAT1信號通路，抑制DISC1的表達，為闡明病毒感染和細胞因子在神經精神疾病(如抑郁癥)發(fā)生中的分子機制提供了實驗依據(jù)。