王金 蔣慧 鄭建明

海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院病理科，上海 200433

【提要】 循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)作為一種基于血液的生物標志物，在胰腺癌早期診斷、動態(tài)監(jiān)測和預后判斷等方面具有一定優(yōu)勢，但也存在樣本前處理、提取方法等缺乏統(tǒng)一標準及缺少特異性標志物等難題。未來還需要要進行更大規(guī)模的臨床試驗和技術改進來推進ctDNA在胰腺癌診療中的應用。

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤，在男性和女性中的死亡率分別為4.9%和4.2%[1]，并呈逐年增加趨勢，這與胰腺癌早期診斷難、易轉移、對當前治療方案的敏感性較差及自身的組織學特征有關。近年來隨著精準腫瘤學的快速發(fā)展，基因組圖譜結果指導了越來越多癌癥類型的個體化治療。盡管高度異質的胰腺癌表現(xiàn)出獨特的體細胞改變和特征性的驅動基因及突變，但由于胰腺解剖位置較深，組織活檢及取材困難，且患者依從性低而無法進行檢測[2]。與胰腺癌組織活檢相比，循環(huán)腫瘤 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)作為一種非侵入性生物標志物用以揭示腫瘤特異性、個體突變及甲基化譜等遺傳和表觀遺傳學改變，在胰腺癌的早期診斷、治療評估、動態(tài)監(jiān)測及預后評價方面顯示出一定優(yōu)勢，因而近年來備受關注。本文就ctDNA在胰腺癌診療中的研究進展進行綜述。

一、ctDNA 的特征

體液中的循環(huán)游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)指在血液無細胞成分中發(fā)現(xiàn)的降解DNA片段。cfDNA在細胞正常狀態(tài)少量分泌，在細胞損傷或壞死時分泌增加[3]。ctDNA在血液中的含量極低，僅占血液cfDNA的0.01%，長度范圍為90～250 bp，比常規(guī)cfDNA片段短[4]。與腫瘤組織相比，血漿樣本中腫瘤DNA的豐度相對較低，這對基于血漿的檢測靈敏度提出了一定挑戰(zhàn)[5]。ctDNA既可以由壞死或凋亡的原發(fā)性、轉移及循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)釋放，也可以通過正常腫瘤細胞主動分泌外泌體和前體胞外小泡等途徑釋放[6]。由于腫瘤相關基因突變的存在，ctDNA可以有效地與正常cfDNA區(qū)分開來。與單個腫瘤組織樣本相比，ctDNA水平受腫瘤內異質性的影響較小，能夠提供患者腫瘤細胞更全面的基因組信息，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)、微衛(wèi)星位點、雜合缺失、突變、多態(tài)性、甲基化和拷貝數(shù)變異[7]。此外有研究發(fā)現(xiàn)ctDNA可以作為驅動腫瘤轉移的信號分子參與腫瘤的發(fā)生和轉移[8]。一項研究將鼠NIH3-T3細胞與含有KRAS基因突變ctDNA片段的大腸腫瘤患者的血漿一起溫育，隨后注射到小鼠體內，可以觀察到小鼠大腸腫瘤的發(fā)生和轉移，并在小鼠血漿中檢測到KRAS基因突變ctDNA片段[8]。這表明通過監(jiān)測ctDNA不僅可以監(jiān)控腫瘤發(fā)生和轉移，并有作為抑制腫瘤轉移靶點的可能性?；谶@些特征，ctDNA成為目前液體活檢中常用的血源性標志物之一。

與胰腺癌組織活檢相比，ctDNA測序具有明顯的優(yōu)勢。(1)采集外周血液獲得ctDNA是微創(chuàng)操作，可以降低患者痛苦和并發(fā)癥發(fā)生率，而且不受部位的影響；(2)可以在治療過程中的任何時候采集血液，實時和動態(tài)地監(jiān)測腫瘤的分子變化，不依賴于侵入性組織活檢和影像學檢查；(3)通過對ctDNA的監(jiān)測可以發(fā)現(xiàn)影像上不明顯或不確定的胰腺癌組織，例如切除后殘留的胰腺癌組織；(4)ctDNA可能代表了胰腺癌腫瘤的整個分子圖像，可以揭示腫瘤特異性、個體突變及甲基化譜等遺傳和表觀遺傳學改變。

與胰腺癌常見血液腫瘤標志物及液體活檢指標相比，ctDNA測序具有很好的靈敏度和特異度。CA19-9作為最常見的胰腺癌腫瘤標志物，靈敏度僅為70%～89%，特異度為68%～91%[9]。有研究發(fā)現(xiàn)CA19-9在Lewis血型陰性表型患者容易出現(xiàn)假陰性，而在阻塞性黃疸患者中常表現(xiàn)為假陽性。此外，良性腫瘤、炎癥性腫塊和糖尿病患者CA19-9的水平也會增加[10]，因此目前對于CA19-9水平變化的解釋及其在胰腺癌患者治療中的作用還未達成共識。而利用二代測序技術檢測ctDNA 基因突變靈敏度可以達到91%，特異度為100%[11]。CTC作為另外一種正在發(fā)展的液體活檢技術，在胰腺癌的診斷和檢測效果并不理想，究其原因，一方面胰腺癌具有致密的間質細胞，腫瘤細胞占比僅為30%，常常在疾病晚期才會有更多的CTC；另一方面CTC在釋放后失去了原始免疫抑制微環(huán)境的保護，更容易受到免疫細胞的攻擊[12]，故靈敏度低于ctDNA。

二、ctDNA的檢測方法

由于ctDNA在血液中的含量低，且片段小，高度可變，因此對其檢測要求較高，特別是在ctDNA含量更少的腫瘤發(fā)展早期階段[13]。通過液體活組織檢測腫瘤發(fā)生通常有兩類方法，一類方法是檢測原發(fā)腫瘤中已知的單個或少數(shù)腫瘤特異性突變來監(jiān)測外周血液中的殘留疾病，這類技術以聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)為基礎，包括定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)、癌癥個體化深度測序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)和等位基因特異性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)等[14]。這類方法的缺點是需要關于腫瘤基因組的詳細信息，但優(yōu)點在于有針對性的監(jiān)測可能是極其敏感的，可以在等位基因頻率低至0.01%時仍具有高特異性，以較低成本快速檢測到突變。第二類方法為非靶向篩選，即以第二代測序技術(next-generation sequencing，NGS)為基礎，通過全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)或全外顯子測序(wholeexome sequencing,WES)對全基因組范圍內的拷貝數(shù)畸變或點突變進行分析[15]，并逐漸衍生出深度測序、快速測序系統(tǒng)(fast sequencing,FAST-SeqS)、標記擴增深度測序(tagged-amplicon deepsequencing, TAM-SeqS)、安全測序系統(tǒng)(safe sequencing,SAFE-SeqS)等技術[16]。這類方法的缺點是需要高濃度的ctDNA才能可靠地重建腫瘤特異的全基因組改變,但優(yōu)點在于它能夠識別腫瘤治療過程中發(fā)生的新變化。

總體而言，相對于NGS，基于PCR的分析具有低成本和有效性的優(yōu)勢，是一種很有前景的檢測胰腺癌基因突變的方法，在常規(guī)臨床實踐中具有可行性。NGS作為一項相對昂貴和耗時的技術，需要熟練的生物信息學專家進行分析和解釋單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)畸變、插入和缺失、表觀遺傳學變化或組裝新的基因組[17]，因此更適合于檢測廣泛的癌癥相關基因突變。

三、ctDNA在胰腺癌診治中的作用

近年來雖出現(xiàn)了較多新的胰腺癌治療方案，但胰腺癌患者的預后情況依然嚴峻。新輔助化療、代謝療法、低氧及免疫療法等新興療法的應用亟需要更精準的早期篩查、動態(tài)檢測及預后評價指標作為治療反應監(jiān)測工具，以便臨床醫(yī)師制定更有效的個體化治療方案。ctDNA目前在以下領域顯示出一定的潛力。

1.ctDNA在胰腺癌篩查中的作用：早期胰腺癌通常在臨床上沒有癥狀，只有在腫瘤侵犯周圍組織或轉移到遠處器官后才會出現(xiàn)相應的癥狀，臨床診斷過程中超過60%的胰腺癌患者已為晚期[18]。胰腺癌基因組測序表明，基因突變到腫瘤轉移至少需要15年時間[19]。全基因組和外顯子組測序分析表明，胰腺癌腫瘤細胞中常見的4個起始突變基因分別為KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4[20-22]。如何用更好的篩查手段來發(fā)現(xiàn)這些起始基因突變，是胰腺癌臨床診療面臨的一個難題。

Zill等[23]對26例胰腺癌患者的腫瘤組織和ctDNA中的5個基因(KRAS、TP53、APC、FBXW7和SMAD4)進行前瞻性分析，在17例測序成功的患者中，90.3%(95%CI73.1%～97.5%)的腫瘤組織檢測到的突變也在ctDNA中檢測到，ctDNA測序診斷準確率為97.7%，5個基因的平均靈敏度為92.3%，特異度為100%，ctDNA的變化與腫瘤標志物的動態(tài)變化具有良好的相關性(r=0.93)。這項研究證明在事先不知道腫瘤基因型或ctDNA豐度的情況下，ctDNA測序在識別腫瘤衍生基因突變方面是可行、準確和靈敏的。liu等[24]利用開發(fā)的單鏈文庫制備和基于雜交捕獲測序技術(single-strand library preparation and hybrid-capture-based cfDNA sequencing，SLHC-seq)檢測KRAS基因突變有效地區(qū)分了胰腺癌患者與健康對照者(AUC=0.863，95%CI0.830～0.898)，且KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4基因的組合檢測對胰腺癌具有更高的診斷準確率(AUC=0.921，95%CI0.890～0.956)，靈敏度為80%，特異度為100%。此外這項研究發(fā)現(xiàn)顯性峰值為75～85 bp突變片段在Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌患者中普遍存在，這有助于提出一種基于基因突變片段大小的早期胰腺癌檢測方法。DNA甲基化發(fā)生在腫瘤發(fā)生的最早階段，檢測ctDNA的DNA甲基化有利于腫瘤早期篩查。Eissa等[25]將一種新開發(fā)的珠子甲基化技術用于胰腺癌診斷，發(fā)現(xiàn)分別用含Ⅰ型血小板反應蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶、鋅指蛋白巴松素1以及兩者聯(lián)合檢測ctDNA甲基化的靈敏度分別為87.2%、64.1%和97.4%，對于Ⅰ～Ⅱ期適合手術切除并具有治愈潛力的胰腺癌患者，雙基因聯(lián)合的靈敏度為94.8%，特異度為91.6%。目前ctDNA在早期胰腺癌患者的檢出率仍然明顯低于晚期患者，因此提高檢出技術或采用聯(lián)合蛋白標志物或多個突變位點等策略可能有助于胰腺癌的早期篩查。

2.ctDNA在胰腺癌治療療效監(jiān)測中的作用：目前臨床上胰腺癌治療療效的評價多通過CT、MRI、超聲內鏡及磁共振胰膽管成像等影像技術對術后殘留腫瘤或放化療、免疫治療后腫瘤大小的測量來進行簡單的分級。這些方法一方面不能進行動態(tài)性的檢測，檢測次數(shù)在短期內受到限制，另一方面靈敏度低于80%，微小病灶及轉移病灶難以及時檢測到。而胰腺癌的異質性及轉化影響并決定著治療手段的選擇和最終的治療效果。因此需要特異度和靈敏度更強且易于檢測的腫瘤生物學指標來監(jiān)測治療效果。

一項通過KRAS突變反映晚期胰腺癌患者ctDNA檢測的臨床相關性研究[26]，從14例預期招募的患者在接受吉西他濱或FOLFIRINOX化療之前和隨后的每個月治療期間分別采集血樣，然后用肽-核酸鉗PCR檢測KRAS突變(在>90%的胰腺癌中存在)，作為ctDNA的替代標志物，并以29名健康者的血漿樣本作為對照組，中位隨訪時間為3.7個月。結果顯示10例患者化療前采集的血漿樣本中有KRAS陽性，表明了ctDNA的存在，其中9例在隨訪期間經(jīng)歷了疾病進展，同時多例患者在化療過程中ctDNA水平發(fā)生變化，與其放射學隨訪數(shù)據(jù)和CA19-9水平相一致；而4例ctDNA陰性患者中只有1例經(jīng)歷了疾病進展(P=0.01)。治療前ctDNA水平是無進展和總存活率的顯著預測因子(P值分別為0.014和0.010)。這項初步研究支持這樣一種假設，即ctDNA可以作為監(jiān)測胰腺癌患者治療效果和疾病進展的標志物。目前這項研究正在招募更多患者以證實上述發(fā)現(xiàn)。

3.ctDNA在評估胰腺癌患者預后中的作用：胰腺癌惡性程度高，5年生存率低于10%[27-28]，手術及放化療等傳統(tǒng)療法對提高患者生存率的作用有限，目前缺乏準確的臨床指標來判斷胰腺癌患者的預后。

一項研究采用液滴數(shù)字聚合酶鏈反應檢測罕見突變的腫瘤源性KRAS基因。105例在同一機構接受胰十二指腸切除術的PDAC患者中，33例(31%)血漿ctDNA陽性，患者中位生存期為13.6個月，而ctDNA陰性患者的中位生存期為27.6個月，顯示ctDNA陽性患者較ctDNA陰性患者預后差(P<0.0001)[29]。這一結果表明，血漿樣本中ctDNA的存在可能是PDAC患者生存不良的一個預測因子。另一項研究收集17例轉移性PDAC患者，從血漿中提取ctDNA，使用NGS進行KRAS基因突變分析，并與血清CA19-9水平、影像學和生存期進行關聯(lián)分析。結果顯示17例患者中有5例(29.4%)檢測到KRAS基因突變，且與患者較短的生存期相關，在ctDNA陽性患者中，ctDNA作為監(jiān)測治療反應的標志物與CA19-9相當，ctDNA的變化與患者生存期呈負相關[30]。這一結果表明ctDNA中突變的KRAS基因可以作為胰腺癌患者預后不良的標志物，用于評估患者生存期。

四、目前存在的難題

2016年美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug admini-stration, FDA)批準了第1個通過分析ctDNA來檢測非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變的試驗[31]。胰腺癌的相關試驗標準至今還未提出。許多臨床醫(yī)師使用更全面但未經(jīng)FDA批準的ctDNA液體活檢技術診療胰腺癌及其他實體瘤，這些技術方案多由公司提供并用于指導應用。如何對胰腺癌患者進行ctDNA采集缺乏統(tǒng)一的標準，因此需要進行更多的研究來證明臨床有效性和實用性。此外，在處理血液樣本的技術層面上也具有很大困難，ctDNA半衰期短，保存困難，容易降解且豐度較低，樣本處理方式的不同，有可能將顯著的可變性引入ctDNA分析中。有研究表明采集血管的類型、處理樣本所需的時間、白細胞溶解等因素會導致ctDNA被正常細胞DNA稀釋進而會影響ctDNA的檢測[32-33]。不同平臺檢測技術的靈敏度及特異度也存在較大差異。因此關于血液的ctDNA應該如何提取、處理、儲存及分析，都需要大量的臨床試驗和數(shù)據(jù)進行驗證以證實其臨床實用性。未來有必要進行更大規(guī)模的前瞻性獨立隊列研究并推動技術改進，以驗證基于ctDNA的液體活檢標志物對胰腺癌患者的非侵入性診療作用。

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