王 哲，陳文鳳，王紅芳，胥保華，劉振國

（山東農業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018）

1 分子標記的概念及研究意義

分子標記（Molecular markers）是指可遺傳的、能被定位和識別的DNA序列（廣義的分子標記還包括蛋白質等生物物質），是DNA水平遺傳多態(tài)性的直觀映射。目前分子標記已被廣泛應用于各種生物領域，利用分子標記技術可在分子水平檢測生物體之間的差異，有著準確度高、特異性強、重復性好、易檢測、微量且高效的優(yōu)點[1]，是一類非常實用的技術。隨著分子生物技術的快速發(fā)展和不斷提升，人們對生物基因組結構、物種進化的認識不斷深入[2]，極大地促進了分子標記的研究，為深入開展分子標記選擇提供素材。

根據實際需求選擇合適的分子標記，優(yōu)秀的分子標記應具備重復性好、檢測方法簡潔快速、多態(tài)性好等特征。本文總結了近年來國內外分子標記在蜜蜂上的應用及研究進展，力求為未來蜜蜂分子標記的研究提供借鑒。

2 分子標記的研究技術手段

在蜜蜂中常應用的分子標記技術主要有限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphisms，RFLP）、隨機擴增多態(tài)性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、重復簡單序列（simple sequence repeats，SSR）、單核核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP） 和 線 粒 體DNA標記（mitochondrial DNA，mtDNA）等。以下主要簡單介紹這5種分子標記：

2.1 RFLP

RFLP基于分子雜交，是最早的一代分子標記技術，常應用于鑒別品種、檢測物種不同環(huán)境下的進化水平，其基本原理是利用限制性核酸內切酶酶切生物體的DNA，用凝膠電泳分離DNA，用Southern blots手段分析結果多樣性[3]。RFLP的優(yōu)點在于篩選隱性基因，無表型效應，且標記之間不會互相干擾，結果穩(wěn)定可靠。但RFLP每次只能檢測一個位點，操作復雜，致使工作量較大[4]。

2.2 RAPD

RAPD基于PCR技術，通過PCR用同一引物進行隨意擴增，對擴增片段進行多態(tài)性分析。RAPD有著操作簡單、所需DNA含量較少、引物通用性強的優(yōu)點[5]，因此被廣泛應用，如制作遺傳圖譜、檢驗外源基因和純度鑒定等[6]。但RAPD無法判斷顯性隱性遺傳，對PCR的條件非常嚴格，因此標記重復性不高。

2.3 SSR

SSR也稱微衛(wèi)星DNA，基于PCR技術。SSR一般是100～200 bp的短序列且以1～6個核苷酸為重復單位[7]。SSR具有多態(tài)性，但其兩側序列相對保守，因此可設計特異性引物進行PCR擴增，最終分析擴增所得的DNA片段電泳結果的多態(tài)性[8,9]。SSR標記具有多態(tài)性高、共顯性、結果穩(wěn)定和操作簡捷快速等優(yōu)點被廣泛應用到品種鑒定、親屬關系分析、群體遺傳學等領域[10,11]，因此，SSR是目前最常用的微衛(wèi)星標記之一。

2.4 SNP

SNP基于DNA序列，指的是因生物基因組上某個位點上單個堿基的變化（堿基對的插入、缺失、轉換等）而引起的多態(tài)性[12]。SNP的分析技術有很多種，根據研究對象分類可分為尋找SNP與某遺傳性狀的關系和對不同群體已知SNP進行遺傳多樣性檢測或診斷已知致病基因2種[13]。鑒于SNP分布廣，具有代表性的優(yōu)點，SNP已成為最有前景的分子標記之一[14]。隨著DNA測序技術的發(fā)展，SNP技術快速發(fā)展，已實現高通量、自動化檢測。

2.5 mtDNA

線粒體是細胞中能量代謝的細胞器，其中含有少量的DNA，這部分遺傳物質較為保守、分子結構簡單、無組織特異性[15,16]，是進行遺傳分析的優(yōu)秀素材。mtDNA還具有母系遺傳的特點，而在同一蜂群中的工蜂具有相同的母系，所以mtDNA在蜜蜂遺傳研究上具有很大的優(yōu)勢。

3 分子標記在蜜蜂研究中的進展及應用

3.1 種類鑒別及地區(qū)內的生物多樣性分析

分子標記被大量地運用在種類鑒別上，利用不同分子標記的優(yōu)點可具體至亞種之間。不同亞種之間的生物學特性和農業(yè)特性不同，而多樣性的增加無疑對蜜蜂及環(huán)境是有益的。

Mikhail等[17]為了鑒定俄羅斯境內的不同蜜蜂亞種，分析了COX1基因的Folmer區(qū)域，確定了亞種特有的SNPs，建立了利用誘變引物進行RFLP的方法用于確定這種蜜蜂亞種，這種方法快速、易行。Samina等[18]利用RAPD技術對巴基斯坦Nankana和Narowal 2個地區(qū)的5個不同采集地點的蜜蜂進行變異和遷移率的分析，結果顯示兩地區(qū)的基因組存在差異，群體內的遺傳多樣性增加，在此基礎上可以進一步研究其他寄生蟲和病原體對多樣性的影響以及這些狀況對蜂群的影響。為保護本地西方蜜蜂資源，Parejo等[19]采集了瑞士幾個地區(qū)的雄蜂的全基因組序列信息，分析了當地的種群結構和遺傳多樣性，評估了本地蜜蜂的基因深入程度，結果顯示50個SNP就足以區(qū)分本地和引入蜜蜂，且各地區(qū)皆有混合個體，管理工作需要加強，由此可見SNP是進行此類工作中準確有效的工具。

3.2 蜂王漿高產群體的篩選

蜂王漿是工蜂頭部咽下腺及上顎腺共同分泌的液體物質，時至今日，對于蜂王漿的生理功能已經有很多研究，是公認的綠色保健品。如何提高蜂王漿的品質和質量一直是大家關注的重點問題，利用分子標記，可以快速篩選到高產量群體。

曹聯飛等[20]人利用5個微衛(wèi)星位點和2段線粒體DNA序列，對3年浙江平湖地區(qū)的漿蜂群體進行遺傳分析，為漿蜂資源保護提供科學依據，結果顯示該地區(qū)漿蜂群體的線粒體單倍型單一化逐年明顯，提醒我們應及時采取必要保護措施，加強監(jiān)管力度。自1956年意大利蜜蜂引入巴西后迅速繁殖，為提高蜂王漿的產量，開始了蜜蜂蜂王選育工作，Ana Paula等[21]利用RFLP和mtDNA的技術手段評估了不同MRJP3微衛(wèi)星標記的多態(tài)性，最終發(fā)現6個等位基因，利用這些等位基因判斷蜂群蜂王的基因型，繼而從中選出在生產蜂王漿上有優(yōu)勢的蜂王并確定蜂王的遺傳來源，驗證育種效率。

3.3 抗逆、抗病群體篩選

在蜂群中存在著微孢子蟲病、白堊病、螨蟲等常見的蜂群病，它們嚴重影響著蜂群的生存繁衍。傳統(tǒng)的蜂藥耗費人力、效果差且會對蜜蜂產生其他消極影響，所以篩選出抗病的優(yōu)秀蜂種對蜂業(yè)的發(fā)展尤為重要。

Ostroverkhova等[22]研究了幾種微衛(wèi)星位點變異與微孢子蟲病的關系，并篩選出AC117位點的等位基因“177”、Ap243位點的“263”和SV185的“269”3個遺傳標記可用于鑒定意大利蜜蜂的微孢子病抗性，但是亞種之間在基因位點上的差異還未解決，需要進一步的研究將不同蜜蜂亞種考慮進診斷標記物的特異性。聶紅毅等[23]對人工飼養(yǎng)的意大利蜜蜂幼蟲進行蜜蜂球囊菌的接種，以篩選抗病和不抗病的蜜蜂個體，而后發(fā)現了第十一號染色體LOC100578413染色體的非編碼區(qū)的SNP（T14570310C）與抗白堊病相關，可為我們檢測蜂群白堊病和篩選抗白堊病蜂種有重要意義。吳黎明等[24]以卡尼鄂拉蜂、高加索蜂和平湖意蜂為素材，建立了3個純系，以RAPD為工具分析找出與抗螨、高產能力相應的基因片段，在此基礎上選育出“HYR”和“JYR”2個高產、可穩(wěn)定遺傳的抗螨雜交蜂種。

3.4 行為相關的基因篩選

在蜂群中，蜂王、工蜂、雄蜂有著明確的分工，工蜂之間同樣有著明確分工。對于意大利蜜蜂而言，在2～3周之前的工蜂常擔任巢內的清潔哺育工作，其他蜜蜂負責采集花粉花蜜，而蜜蜂行為的調控除了受到環(huán)境、激素的調控外，還會受到基因的調控。

Hunt等[25]利用RAPD和其他工具確定了2個基因座（pln1和pln2、LOD3.1和LOD2.3）與蜂群的采集行為相關，2個基因座的等位基因對覓食行為有不同影響，pln1和pln2都對蜂群的采集花粉量相關，pln2相關的標記的替代等位基因的個體在采集花蜜的濃度上存在差異。對于行為等復雜特征的研究，確定定量性狀位點（QTL）是比較困難的，Rueppell等[26]結合蜜蜂基因組、SNP、AFLP、SSR和已被確定與蜜蜂初次覓食年齡的QTL，最終確定了2個QTL及其位置，提示第十一號染色體上的1個新的基因組區(qū)域影響首次覓食的年齡，并進一步確定了Ank2、PKC、Erk7和amontillado在復雜社會特征“首次覓食的年齡”自然行上的功能。

4 分子標記在蜜蜂研究中的展望

分子標記是在遺傳標記研究過程中被發(fā)現的一種趨向微觀、較準確的標記，被應用在研究各類生物的遺傳圖譜建立、種類鑒定、選種育種等方面。雖然分子標記出現的時間不長，但發(fā)展迅速，分子標記也在向更簡便、更準確的方向發(fā)展。隨著各類生物基因庫的建立，分子標記的開發(fā)必定更加多樣，應用更加廣泛，如新興的分子標記手段：基于內含子擴增多態(tài)性（IBAP）、基于外顯子擴增多態(tài)性（EBAP）等。雖然分子標記是一種剛剛發(fā)展起來的技術手段，但從其他植物、微生物、動物、昆蟲上看，分子標記已顯露出它獨有的優(yōu)越性，在蜜蜂方面的研究仍有很大的發(fā)展空間。

蜜蜂是重要的傳粉昆蟲，具有重要的社會價值和生態(tài)價值。蜜蜂隸屬于蜜蜂科、蜜蜂屬，目前世界上公認的有9種，具體又可分為不同亞種，在形態(tài)結構、生產性能和抗病性能等方面各具特色，是寶貴的育種素材。蜜蜂面臨復雜多變的生態(tài)環(huán)境，受到多種生物和非生物脅迫。因此，選擇繁育具有高抗逆抗病、高產漿性狀的群體是必要的，在篩選出擁有優(yōu)良性狀的群體后，物種的保留和延續(xù)也是我們應當關注的方向。篩選特定形狀的分子標記是開展蜜蜂品種培育和配套系組合的有效途徑，蜜蜂全基因組的建立和高效的測序技術都為我們提供了技術基礎。廣泛學習不同的分子標記方法，與時俱進，靈活地把各種分子標記技術結合利用在蜜蜂的基因研究、特定性狀選育、適應性進化、蜜蜂保種、腸道微生物功能等領域也是未來可以努力的方向。