王 超，楊長耀，李菲菲，馬小川，陳岳文，肖志偉，尹 韜，葉 麗，李云松，盧曉鵬

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長沙 410128；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，北京 100193；3國家柑橘改良中心長沙分中心，長沙 410128；4湖南省園藝研究所，長沙 410128；5湘西州柑桔科學(xué)研究所，湖南吉首 416000）

0 引言

乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase，EC 6.4.1.2)是一種多亞基復(fù)合酶，其在生物體內(nèi)將乙酰輔酶A羧化進入脂肪酸合成代謝，影響許多其它次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，是生物體脂肪酸合成的關(guān)鍵調(diào)控位點[1]。生物體的ACCase分為主要存在于細(xì)菌、雙子葉植物以及非禾本科單子葉植物質(zhì)體中的異質(zhì)型[2-3]和主要存在于動物、酵母、藻類及高等植物的胞質(zhì)溶膠中的同質(zhì)型2種類型。2種形式的乙酰輔酶A羧化酶存在于大多數(shù)植物中，當(dāng)前已從擬南芥、大豆、小麥[4]、玉米[5]、油菜[6]、煙草、麻風(fēng)樹[7]等多種植物中克隆到了異質(zhì)型ACCase亞基的編碼基因。異質(zhì)型ACCase由生物素羧化酶亞基(BC)、生物素羧基載體蛋白亞基(BCCP)、羧基轉(zhuǎn)移酶α-CT亞基和β-CT亞基組成，這些亞基結(jié)合在一起形成ACC全酶，可能以(BC)2(BCCP)4(α-CT，β-CT)2形式存在[8]，但全酶很不穩(wěn)定，易解離成各種不同的形式。核基因accC、accB、accA分別編碼BC亞基、BCCP亞基和α-CT亞基，葉綠體基因accD編碼β-CT亞基[9]。

ACCase作為脂肪酸合成的限速酶，在植物種子脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用。目前對各種油料作物種子中的乙酰輔酶A羧化酶功能研究比較深入。王寶明等[10]在研究油茶種子發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)，4個ACCase亞基基因轉(zhuǎn)錄量變化的趨勢隨著種子對脂肪酸需求變化規(guī)律具有一致性，表明4個ACCase基因轉(zhuǎn)錄與脂肪酸形成關(guān)系密切。楊婷等[11]研究胡麻異質(zhì)型乙酰輔酶A羧化酶4個亞基的生物學(xué)功能，結(jié)果表明accA、accB、accC和accD4個基因在3個胡麻品種所有時期的不同組織中均有表達，但在種子中的表達量均明顯高于其他組織，異質(zhì)型ACCase基因可能調(diào)控胡麻種子發(fā)育前期油脂的合成積累。Plank等[12]研究表明，種子早期發(fā)育過程中ACC基因表達量的增加與種子成熟時含油量增加呈正相關(guān)。Focks等[13]研究表明，擬南芥和油菜種子在發(fā)育過程中的BCCP蛋白表達量上調(diào)，與ACCase的活性以及種子油脂含量的變化呈正相關(guān)。楊青等[14]以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為研究對象，構(gòu)建了乙酰輔酶A羧化酶BCCP亞基和β-CT亞基重組菌株，并通過誘導(dǎo)表達及響應(yīng)面優(yōu)化，進一步提高了脂肪酸的產(chǎn)量。趙爽等[15]研究發(fā)現(xiàn)‘綠嶺’與‘綠早’2個品種的脂肪含量與ACCase活性呈顯著正相關(guān)，核仁最終脂肪含量與ACCase活性的相關(guān)性較大。王哲等[16]研究了油桐ACCase基因在種子發(fā)育的不同時期的表達，在種子的發(fā)育過程中4個亞基基因都出現(xiàn)了2個轉(zhuǎn)錄高峰，分別為花后145天和花后205天。

作為ACCase 4個亞基之一，accA編碼的α-CT亞基在脂肪酸含量調(diào)控中也有著重要的作用。Ye等[17]鑒定了一個編碼與α-CT亞基相互作用并參與光抑制FAS的羧基轉(zhuǎn)移酶相互作用物(CTI)基因家族，光可以在促進α-CT與CTI之間相互作用的同時減弱脂肪酸合成，說明該亞基在調(diào)控脂肪酸合成中有重要的作用。崔燕等[18]克隆棉花accD基因和擬南芥CAC3基因（α-CT亞基）轉(zhuǎn)化到擬南芥和煙草中，結(jié)果顯示T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片脂肪酸含量和擬南芥單株結(jié)籽量有所提高，同時認(rèn)為正向調(diào)控accD基因可能會對擬南芥植株的生理形態(tài)產(chǎn)生影響。Chen等[19]在綠藻中克隆并過表達了ACCa，發(fā)現(xiàn)CW15-24和CW15-85菌株的不飽和脂肪酸含量分別為55.45%和56.15%，與野生型CW15(48.39%)相比顯著富集，在萊茵衣藻中ACCa的過表達可以直接增加脂肪酸的合成。目前，異質(zhì)型乙酰輔酶A羧化酶參與脂肪酸合成以外的功能特點還不十分清楚，accA基因在果實發(fā)育中的功能特點研究甚少。

近期，Curtolo等通過‘Murcott tangor’和‘Pera’甜橙雜交群體定位到了一系列品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL位點，預(yù)測其中編碼ACCase的α-CT亞基的CsaccA與柑橘果實糖酸品質(zhì)相關(guān)[20]。本研究將甜橙果實的CsaccA基因在番茄中進行異源轉(zhuǎn)化，擬鑒定該基因在調(diào)控果實品質(zhì)和植株生長發(fā)育等過程中的功能，以期為下一步調(diào)控柑橘樹體發(fā)育和果實品質(zhì)形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2018年9月—2021年9月在國家柑橘改良中心長沙分中心完成。

1.2 試驗材料

Micro-Tom番茄種子購自南京豐碩園藝有限公司。試驗用工程菌菌株和PBI121載體均為本實驗室保存，大紅甜橙盆栽于國家柑橘改良中心長沙分中心大棚。

農(nóng)桿菌懸浮液：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，鐵鹽(200×)5 mL/L，有機成分(200×)5mL/L，麥芽提取物0.5g/L，谷氨酰胺1.5g/L，蔗糖40g/L，pH 5.83，121℃15 min高壓滅菌，備用。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，鐵鹽(200×)5 mL/L，肌醇100 mg/L，鹽酸硫胺素1.3 mg/L，2,4-D 0.2 mg/L，KH2PO42 mg/L，KT 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂7.4 g/L，pH 5.83，121℃15 min高壓滅菌，備用。

篩選培養(yǎng)基：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，有機成分(200×)5 mL/L，鐵鹽(200×)5 mL/L，蔗糖30 g/L，瓊脂7.4 g/L，pH 5.83，121℃ 15 min高壓滅菌，備用。用時加IAA 0.1 mg/L，ZR 2 mg/L，Kana 100 mg/L，特美汀360 mg/L。

繼代培養(yǎng)基：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，鐵鹽(200×)5 mL/L，有機成分(200×)5 mL/L，蔗糖30 g/L，瓊脂7.4 g/L，pH 5.83，121℃ 15 min高壓滅菌，備用。用時加ZR 1 mg/L，Kana 100 mg/L，特美汀360 mg/L。

生根培養(yǎng)基：大量元素(20×)50 mL/L，微量元素(200×)5 mL/L，有機成分(200×)5 mL/L，鐵鹽(200×)5mL/L，有機成分(200×)5mL/L，IBA2mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂7.4 g/L，pH 5.83，121℃15 min高壓滅菌，備用。用時加Kana 50 mg/L，特美汀360 mg/L。

1.3 目的基因獲得

通過查找甜橙基因組數(shù)據(jù)庫獲得該基因序列。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物(CsaccA-F:ATGGCTACGATTTCACATTCT/CsaccA-R:AGCAAAG CTACGGTTT)，同時引入載體的酶切位點設(shè)計基因擴增引物CsaccA-F:acgggggactctagaATGGCTACGATTTC ACATTCT/CsaccA-R:gactgaccacccgggAGCAAAGCTA CGGTTT。從大紅甜橙幼嫩葉片提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物擴增時PCR程序為：94℃ 1 min，94℃30 s，58℃ 1 min，72℃ 90 s，72℃ 10 min，4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后低溫保存目的基因。

1.4 植物表達載體構(gòu)建

以重組連接法構(gòu)建過量表達載體。用Saml和Xbal雙酶切PBI121質(zhì)粒，回收酶切片段，檢測濃度。重組連接體系在16℃條件下連接14 h。采用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，挑取單菌落由擎科公司測序。將測序正確的載體命名為PBI121-accA，擴繁后質(zhì)粒和甘油菌于-80℃冰箱保存。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌時，50 μL農(nóng)桿菌感受態(tài)中加入5 μL重組質(zhì)粒，冰浴25 min，液氮速凍45 s，立即放入37℃水浴5 min，加入0.5 mL LB培養(yǎng)液，28℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)3 h，取出菌液涂布在含抗生素的LB平板上，在28℃培養(yǎng)箱倒置2天培養(yǎng)。挑取單菌落進行菌落PCR，將陽性菌株用甘油-80℃冰箱保存。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄遺傳轉(zhuǎn)化

番茄種子播種于MS培養(yǎng)基中，6天以后長出2片子葉，真葉未展出，挑取子葉中段剪為長0.4 cm左右，葉背面朝上置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，(25±2)℃暗處預(yù)培養(yǎng)24 h。

將農(nóng)桿菌EHA105在含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，用接種環(huán)蘸取單菌落涂布新的LB平板，28℃培養(yǎng)24～36 h。無菌手術(shù)刀刮取菌體于50 mL MS液體懸浮液中重懸菌體，加入50 mg/LAS，在搖床28℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)30 min～1 h，測得OD600值為0.3～0.6，用于子葉侵染。

1.5.1 侵染 將暗培24 h后的子葉放入無菌錐形瓶中，倒入懸浮的菌液，輕微搖晃5 min。侵染結(jié)束后用無菌濾紙吸干子葉表面殘留菌液。

1.5.2 預(yù)培養(yǎng) 將侵染后的子葉接種于新的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，(25±2)℃黑暗預(yù)培養(yǎng)48 h。

1.5.3 篩選培養(yǎng) 將預(yù)培養(yǎng)2天后的子葉正面朝上接種在篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基充分接觸子葉切口，25℃光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7天左右，番茄葉片邊緣長出白色愈傷組織，12天后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基。10～14天愈傷組織分化出芽點，約1個月后將疑似陽性苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，生根后根據(jù)需要移到培養(yǎng)土中培養(yǎng)。

1.6 轉(zhuǎn)基因番茄陽性鑒定

利用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因和野生番茄的DNA，以轉(zhuǎn)基因植株番茄DNA為模板，未轉(zhuǎn)化植株的番茄DNA為對照，用35S做上游引物，擴增目的基因的下游引物進行PCR擴增，同時用卡那霉素基因的上下游引物進行PCR擴增，所需引物序列為Kan-F(GAGCGGCGATACCGTAAA)、Kan-R(GGTGCCCTG AATGAACTGC)、35S-F(GACGCACAATCCCACTA TCC)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。本載體含有GUS標(biāo)記基因，取轉(zhuǎn)基因和野生型番茄果實使用GUS進行染色，37℃過夜處理，70%酒精進行脫色處理，葉片或果實出現(xiàn)穩(wěn)定藍色斑點的為陽性植株。

1.7 高效液相色譜法(HPLC)測定番茄果實中有機酸和糖含量

取野生型和轉(zhuǎn)基因番茄株系果實進行品質(zhì)分析，野生株系6個生物學(xué)重復(fù)，轉(zhuǎn)基因株系8個生物學(xué)重復(fù)。每個樣的果實留取種子后用液氮研磨，稱取3 g果肉，加入4 mL超純水，70℃水浴30 min，室溫放置10 min，再水浴0.5 h，然后室溫放置冷卻之后放到-40℃預(yù)冷0.5 h，然后放到凍干機濃縮24 h，壓縮成干粉，然后取樣加2 mL水稀釋。采用HPLC方法檢測樣品中的糖酸組分含量，具體分析方法參考Lu等[21]的方法進行。

1.8 轉(zhuǎn)基因植株生物學(xué)性狀統(tǒng)計

選取相同培養(yǎng)條件下的野生型和轉(zhuǎn)基因植株，用游標(biāo)卡尺測量野生番茄植株和轉(zhuǎn)基因植株的株高、主莖粗度、冠幅等，測量每個指標(biāo)時相對方向測量2次取平均值，各指標(biāo)每周進行1次測量。果實采收結(jié)束后，將整個植株取出清洗和分離根、莖、葉組織，放置60℃烘干至恒重，測量轉(zhuǎn)基因植株和野生植株的葉片、莖和根干重。各項統(tǒng)計均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)整理和作圖，采用SPSS 26.0軟件進行顯著性差異比較，用Photoshop進行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)CsaccA基因番茄植株及轉(zhuǎn)基因表型

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄進行遺傳轉(zhuǎn)化，連續(xù)進行2代鑒定，篩選培養(yǎng)后獲得了純合轉(zhuǎn)基因株系。PCR鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株（泳道1～4）和野生植株（泳道5）都擴增出了目的基因(2322 bp)；轉(zhuǎn)基因植株擴增出卡那抗性基因（約500 bp），而野生型植株未擴增出卡那抗性基因。以構(gòu)建的PBI121-accA載體（泳道6和12）做陽性對照，轉(zhuǎn)基因植株擴增條帶均與陽性對照一致（圖1A）。對果實進行GUS染色結(jié)果表明，CsaccA基因在果實中高量表達，不同植株果實均可檢測到GUS信號（圖1B）。

圖1 轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定

轉(zhuǎn)基因植株的生物量與野生型植株存在顯著性差異。轉(zhuǎn)基因植株的長勢明顯優(yōu)于野生型植株，其植株整體和各組織部位均表現(xiàn)出巨大性（圖2）。植株各組織部位的生物量統(tǒng)計表明，轉(zhuǎn)基因植株根系鮮重是野生型的約10倍，干重是野生型的約4倍；轉(zhuǎn)基因植株莖鮮重約是野生型的5倍，干重約是野生型的7倍；轉(zhuǎn)基因植株葉鮮重約是野生型的3倍，干重約是野生型的4倍（表1）。

圖2 野生型與轉(zhuǎn)基因植株比較

表1 轉(zhuǎn)基因與野生番茄不同組織干重和鮮重 g

2.2 轉(zhuǎn)CsaccA基因番茄植株發(fā)育特征

轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育過程明顯優(yōu)于野生型。轉(zhuǎn)基因和野生型植株均于播種后4天發(fā)芽，轉(zhuǎn)基因植株播種后28天開花，野生型35天開花。轉(zhuǎn)基因植株播種后42天開始座果，播種后第73天開始轉(zhuǎn)色，播種后第77天開始成熟；而野生植株播種后56天開始坐果，播種后84天開始轉(zhuǎn)色，播種后91天開始成熟。轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育物候期及果實成熟期提前（圖3A）。

轉(zhuǎn)基因番茄植株觀察顯示，轉(zhuǎn)基因植株在播種后14天內(nèi)與野生型無顯著差異，之后普遍強于野生型。轉(zhuǎn)基因植株莖粗在番茄播種21天后到果實成熟整個生長發(fā)育過程中顯著大于野生型（圖3B），轉(zhuǎn)基因植株株高在播種35天始顯著高于野生型植株（圖3C），轉(zhuǎn)基因植株的冠幅在播種后21～70天顯著大于野生型植株，之后兩者相似（圖3D）。

圖3 轉(zhuǎn)基因和野生型番茄發(fā)育過程

2.3 轉(zhuǎn)CsaccA基因番茄果實糖酸含量分析

番茄果實中主要的糖是果糖和葡萄糖，檸檬酸是主要的有機酸。轉(zhuǎn)CsaccA基因番茄果實中果糖和葡萄糖含量顯著高于野生型，而蔗糖含量顯著低于野生型。轉(zhuǎn)CsaccA基因番茄果實檸檬酸含量顯著低于野生型（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)基因與野生番茄果實糖酸含量分析

3 結(jié)論

筆者以Micro-Tom番茄異源轉(zhuǎn)化研究了柑橘CsaccA基因的功能，結(jié)果表明該基因可顯著加快轉(zhuǎn)基因植株的生物量和生長速度，同時可以顯著增加果實的糖酸比。因此，柑橘CsaccA基因參與脂肪酸合成和乙酰輔酶A的消耗，在調(diào)控柑橘果實品質(zhì)方面有重要作用。在本研究的基礎(chǔ)上，下一步需深入研究其調(diào)控果實品質(zhì)的機理。

4 討論

ACCase是脂肪酸合成的關(guān)鍵和限速步驟，反應(yīng)過程催化消耗掉乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A是聯(lián)系糖、脂和蛋白質(zhì)氨基酸等各種生物分子相互轉(zhuǎn)化的橋梁物質(zhì)和調(diào)節(jié)物質(zhì)。ACCase調(diào)控脂肪酸含量的同時，乙酰輔酶A的消耗對于需要其參與代謝的過程也產(chǎn)生較大影響。

王伏林等[22]將大腸桿菌ACC各亞基的編碼基因在油菜中過表達，研究表明串聯(lián)表達載體轉(zhuǎn)化油菜獲得的陽性轉(zhuǎn)化株系比對照植株含油量平均提高了5.7%。Klaus等[23]在馬鈴薯塊莖的淀粉體中過量表達擬南芥的ACCase，導(dǎo)致脂肪酸合成增加，三酰甘油含量增加5倍以上。Davis等[24]將編碼大腸桿菌ACCase 4個亞基的基因克隆到單個質(zhì)粒中，在噬菌體T7啟動子控制下，誘導(dǎo)基因表達后過量生產(chǎn)的蛋白質(zhì)導(dǎo)致大大增加了其活性，同時增加了細(xì)胞內(nèi)的丙二酰輔酶A水平，脂肪酸合成增加了6倍。Yukiko等[25]通過煙草超量表達accD提高了質(zhì)體ACCase水平，葉片的脂肪酸含量提高，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化個體的葉片壽命明顯延長，結(jié)籽量提高2倍。上述研究均說明乙酰輔酶A羧化酶在脂肪酸合成中的重要作用，而乙酰輔酶A羧化酶和乙酰輔酶A參與眾多代謝過程，該步驟的改變影響植物脂肪酸外的哪些性狀尚不十分清楚，對果實品質(zhì)形成有何影響不得而知。本研究從甜橙中克隆獲得一個編碼ACCase的α-CT亞基的CsaccA基因，該基因在番茄中超量表達后植株生長量顯著增加，表明ACCase功能增強與植株發(fā)育密切相關(guān)；轉(zhuǎn)基因果實主要糖含量顯著升高而檸檬酸含量顯著降低，表明ACCase功能增強消耗了更多的乙酰輔酶A，消耗削弱了TCA循環(huán)檸檬酸的合成，使果實積累糖類等更多的上游初生代謝物。

綜上，ACCase參與了乙酰輔酶A的消耗過程，乙酰輔酶A的消耗削弱了果實酸代謝的能力，同時也增強了上游糖的積累，從而起到了調(diào)控果實品質(zhì)的作用。編碼ACCase的α-CT亞基CsaccA基因在此過程中起到了促進糖積累和降低酸積累的作用，為下一步調(diào)控柑橘樹體發(fā)育和果實糖酸品質(zhì)形成奠定了基礎(chǔ)。本研究是為數(shù)不多的關(guān)于ACCase參與果實品質(zhì)形成調(diào)控的報道，對研究果實糖酸代謝提供了新的思考；同時，由于柑橘類作物轉(zhuǎn)基因的限制，本研究采用異源轉(zhuǎn)化番茄的方法分析了基因的功能，CsaccA基因在柑橘樹體發(fā)育、脂肪酸代謝、果實初生代謝和次生代謝物積累中的具體功能還需要深入研究。