陸風(fēng)輝，李金潞，白志毅，袁屹平，傅百成

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心/上海市水產(chǎn)動(dòng)物良種創(chuàng)新與綠色養(yǎng)殖協(xié)同中心，上海 201306；2.浙江佰瑞拉農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江紹興 311800)

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)為我國(guó)特有種，是我國(guó)最主要的淡水育珠蚌，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。顏色是珍珠質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[2]，為了豐富淡水珍珠產(chǎn)品顏色，提升珍珠品質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)室培育了三角帆蚌“申紫1號(hào)”新品種(GS-01-011-2017)，并實(shí)現(xiàn)紫色珍珠產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖。但珍珠顏色不僅受到遺傳調(diào)控的影響，也受到環(huán)境及其遺傳互作效應(yīng)的影響[3-5]，因此，良種需要配套良法，改進(jìn)養(yǎng)殖方法也是提升珍珠色澤的重要途徑之一。

類胡蘿卜素(carotenoids)是一種利用率高、使用范圍廣的天然色素，水產(chǎn)動(dòng)物通過(guò)從食物中攝取天然或合成形式的類胡蘿卜素[6]，有利于其形成從深橙色到紅色的不同程度的體色[7]。根據(jù)類胡蘿卜素的化學(xué)構(gòu)造差別可分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類，β-胡蘿卜素(β-carotene)是胡蘿卜素中的代表；葉黃素是胡蘿卜素的氧化衍生物，以角黃素和蝦青素(astaxanthin)為代表[8-10]。三角帆蚌貝殼珍珠層及珍珠中含有的類胡蘿卜素能夠引起明顯的拉曼峰，并且顏色越深的部位，類胡蘿卜素相對(duì)濃度越高[11,12]。李西雷等[13]發(fā)現(xiàn)在三角帆蚌養(yǎng)殖水環(huán)境中添加β-胡蘿卜素能夠顯著提高其體內(nèi)總類胡蘿卜素含量(total carotenoids content,TCC)并加深內(nèi)殼顏色。孫明龍等[14]等通過(guò)對(duì)3個(gè)色系的三角帆蚌進(jìn)行β-胡蘿卜素補(bǔ)充投喂實(shí)驗(yàn)后也證實(shí)了其能夠加深內(nèi)殼顏色。上述研究都表明類胡蘿卜素對(duì)三角帆蚌內(nèi)殼色及組織內(nèi)TCC積累起著重要促進(jìn)作用，但仍缺乏投喂類胡蘿卜素種類對(duì)貝殼顏色和珍珠性狀的影響研究。

不同來(lái)源、不同種類的類胡蘿卜素在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑不同[15-17]，并且不同類胡蘿卜素源的價(jià)格差異也較大，因此有必要比較不同類胡蘿卜素源對(duì)三角帆蚌貝殼顏色和珍珠顏色改善效果的差異。本研究選用紫色和白色2個(gè)色系三齡插核三角帆蚌，通過(guò)添加β-胡蘿卜素和蝦青素，進(jìn)行了為期120 d的補(bǔ)充投喂養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，測(cè)定三角帆蚌體內(nèi)TCC的富集及其內(nèi)殼色差異，并重點(diǎn)比較分析添加β-胡蘿卜素和蝦青素對(duì)三角帆蚌培育珍珠質(zhì)量的影響，以期為改善養(yǎng)殖珍珠顏色篩選出合適的類胡蘿卜素，也為濾食性貝類補(bǔ)充功能性營(yíng)養(yǎng)添加劑研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)用紫色系和白色系三角帆蚌均為同期自插三齡育珠蚌，取自上海海洋大學(xué)安徽宣城基地，隨機(jī)挑選兩種色系三角帆蚌各100只，規(guī)格統(tǒng)一，殼長(zhǎng)(150.74±23.18) mm。淡水小球藻藻種(純度≥95%)購(gòu)自南京海洱斯生物科技有限公司，β-胡蘿卜素(含量規(guī)格1%)購(gòu)自西安維特生物科技有限責(zé)任公司，可溶于水的微囊包埋蝦青素(含量規(guī)格1%)購(gòu)自西安明朗生物科技有限公司，次氯酸鈉(CP，活性氯≥5.2%)、丙酮(AR)和無(wú)水硫酸鈉(AR)試劑均購(gòu)自上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖系統(tǒng)為三層兩列“V”字形養(yǎng)殖水槽架(1.20 m×0.35 m×0.40 m)(圖1)，每個(gè)水槽底部均設(shè)有增氧管道，中層為“V”字形可拆卸網(wǎng)狀透氣養(yǎng)殖不銹鋼架，養(yǎng)殖水體體積為80 L，以曝氣24 h以上的自來(lái)水作為養(yǎng)殖用水。使用室外6管(容積共1 480 L)智能透明光生物反器擴(kuò)培淡水小球藻(Chlorellavulgaris)，每管培養(yǎng)密度高于1.2×107cell/mL即可作為基礎(chǔ)餌料進(jìn)行投喂。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將實(shí)驗(yàn)用蚌放置于養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)一周，期間保持穩(wěn)定充氣增氧，使其逐漸適應(yīng)新的實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖環(huán)境。按照三角帆蚌的常規(guī)養(yǎng)殖要求進(jìn)行日常管理，使用AZ-86031便攜式高精度溶氧儀(衡欣，臺(tái)灣省)測(cè)量水體環(huán)境變量，保持水溫在25～27 ℃內(nèi)，pH在6～8、溶氧量大于>5.0 mg/L。每日9:00和17:00使用擴(kuò)培后的小球藻進(jìn)行投喂，投喂密度為養(yǎng)殖水體中小球藻濃度達(dá)1.0×106cell/mL，次日起僅第一次投喂前換水，換水量為1/3，每隔7 d使用高壓水槍沖洗不銹鋼架和水槽壁上黏附的污物。

圖1 單個(gè)三角帆蚌養(yǎng)殖水槽裝置

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

紫色和白色2種色系的三角帆蚌分別設(shè)置β-胡蘿卜素補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)組、蝦青素補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組下設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行組飼喂紫色系和白色系三角帆蚌各10只。除投喂基礎(chǔ)小球藻餌料外，實(shí)驗(yàn)組分別添加β-胡蘿卜素粉和蝦青素微囊粉，添加量均為水體中粉劑質(zhì)量濃度達(dá)40 mg/L，實(shí)驗(yàn)周期為120 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后從每組中隨機(jī)取出3個(gè)三角帆蚌，解剖后分別取肝胰腺、外套膜(邊緣膜)、中央膜和斧足組織，置于-80 ℃保存，取出插核珍珠后清洗干凈，拭干水分放入棕色試管中密封避光保存待用。取樣后的三角帆蚌貝殼清洗干凈，自然風(fēng)干后避光保存，以備進(jìn)行內(nèi)殼色測(cè)量。

1.2.3 總類胡蘿卜素的提取及含量測(cè)定

將組織樣品放入真空冷凍干燥機(jī)中處理48 h后，取出樣品置于高速粉碎機(jī)中少時(shí)多次進(jìn)行粉碎，并過(guò)300目篩篩選得到各組織樣品粉末，每次粉碎作業(yè)后使用毛刷清理干凈粉碎機(jī)內(nèi)壁及頂蓋。稱取上述過(guò)篩后的組織粉末0.2 g，放入10 mL棕色試管中，加入等量無(wú)水硫酸鈉和4 mL丙酮充分混勻，37 ℃條件下避光250 r/min震蕩提取120 min，然后置于離心機(jī)中離心5 min取上清，管內(nèi)沉淀重復(fù)上述步驟浸提3～4次直至無(wú)色，合并上清液后定容。使用SpectraMax 190型分光光度計(jì)(Molecular Devices，USA)在避光條件下測(cè)定丙酮提取液的吸光值?？傤惡}卜素含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[18]，計(jì)算公式如下:

1.2.4 內(nèi)殼色參數(shù)測(cè)定

使用Lovibond RT200表面色度計(jì)(Tintometer,UK)對(duì)保存的貝殼內(nèi)殼色進(jìn)行顏色參數(shù)測(cè)定，通過(guò)Lovibond RT Colour V3.0軟件中的CIE L*a*b*圖像處理方式輸出測(cè)量數(shù)據(jù)。顏色測(cè)量參數(shù)包括明度(L*)、色度值(a*)、色度值(b*)和色差(dE)，參數(shù)意義見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。測(cè)量位置依次為前閉殼肌、右殼邊緣部位的外套痕與縱肋的交叉處和后閉殼肌，取每個(gè)蚌3個(gè)點(diǎn)的顏色參數(shù)平均值作為該個(gè)體的內(nèi)殼色數(shù)據(jù)。

1.2.5 珍珠圓度、顏色及光澤度測(cè)定

使用數(shù)顯千分尺(0.001 mm)測(cè)量珍珠的最大直徑和最小直徑，珍珠圓度用直徑差百分比X表示，值越小表明珍珠越圓，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[19]等，計(jì)算公式為：

珍珠洗凈后置于1%次氯酸鈉溶液中浸泡5 min除去微隙間雜質(zhì)，再次洗凈風(fēng)干備用。珍珠顏色參數(shù)測(cè)定方法同1.2.4，將珍珠置于凹面槽中固定，分別選取表面3處光滑潔凈的點(diǎn)位進(jìn)行測(cè)量，取每顆珍珠3個(gè)點(diǎn)的顏色參數(shù)平均值作為該顆珍珠的顏色數(shù)據(jù)。使用Digital Lux Meter檢測(cè)環(huán)境光強(qiáng)，并對(duì)小孔曲面光澤儀NOVO-CURVE(Rhopoint,UK)進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)完畢后將取樣保存的珍珠依次放在小孔曲面光澤儀的檢測(cè)孔處，每顆珍珠檢測(cè)同一位點(diǎn)3次，以3次檢測(cè)結(jié)果平均值作為該珍珠的光澤度數(shù)據(jù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)充β-胡蘿卜素和蝦青素對(duì)三角帆蚌內(nèi)殼色的影響

投喂120 d后測(cè)得實(shí)驗(yàn)組三角帆蚌內(nèi)殼色參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，紫色系三角帆蚌實(shí)驗(yàn)組內(nèi)殼顏色參數(shù)b*和dE表現(xiàn)出顯著性差異，其中補(bǔ)充β-胡蘿卜素組中b*從-1.09±1.51降至-4.61±1.54，dE從13.06±4.27升至18.25±2.84，提高了39.74%；補(bǔ)充蝦青素組中b*從-1.09±1.51降至-4.54±2.47，dE從13.06±4.27升至19.04±2.62，提高了45.79%，而L*和a*較對(duì)照組均差異不顯著。白色系三角帆蚌實(shí)驗(yàn)組中，補(bǔ)充β-胡蘿卜素組內(nèi)殼顏色參數(shù)(L*、a*、b*和dE)均與對(duì)照組差異不顯著；補(bǔ)充蝦青素組內(nèi)殼顏色參數(shù)僅a*從-0.23±1.32升至3.41±1.55，其余參數(shù)(L*、b*和dE)也均不顯著。

表1 補(bǔ)充β-胡蘿卜素和蝦青素對(duì)2種色系三角帆蚌內(nèi)殼色的影響

2.2 補(bǔ)充β-胡蘿卜素和蝦青素對(duì)三角帆蚌組織內(nèi)TCC的影響

各實(shí)驗(yàn)組三角帆蚌組織內(nèi)TCC見(jiàn)表2。從表中可以看出，補(bǔ)充類胡蘿卜素120 d后，三角帆蚌肝胰腺和外套膜邊緣膜組織中TCC均顯著提高，但不同色系三角帆蚌肝胰腺和外套膜邊緣膜組織對(duì)β-胡蘿卜素和蝦青素的富集能力差異顯著，其對(duì)蝦青素的吸收效果優(yōu)于β-胡蘿卜素。紫色系三角帆蚌實(shí)驗(yàn)組肝胰腺、外套膜邊緣膜和中央膜的TCC較對(duì)照組均有顯著提高，其中補(bǔ)充β-胡蘿卜素組分別提高了128.19%、24.12%和41.24%，而補(bǔ)充蝦青素組分別提高了502.82%、52.64%和68.12%。白色系三角帆蚌實(shí)驗(yàn)組肝胰腺和外套膜邊緣膜的TCC顯著高于對(duì)照組，其中補(bǔ)充β-胡蘿卜素組分別提高了43.90%和36.34%，而補(bǔ)充蝦青素組分別提高了327.74%和90.21%，中央膜TCC較對(duì)照組未見(jiàn)顯著變化。不同色系三角帆蚌斧足TCC均無(wú)明顯變化。

表2 補(bǔ)充β-胡蘿卜素和蝦青素對(duì)2種色系三角帆蚌組織TCC的影響

2.3 補(bǔ)充β-胡蘿卜素和蝦青素對(duì)三角帆蚌所育珍珠質(zhì)量的影響

各實(shí)驗(yàn)組三角帆蚌所育珍珠質(zhì)量差異見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，補(bǔ)充不同類胡蘿卜素后，同色系三角帆蚌所育珍珠的顏色存在差異。在紫色系三角帆蚌實(shí)驗(yàn)組中，僅補(bǔ)充蝦青素組的珍珠顏色參數(shù)L*、b*和dE較對(duì)照組則有顯著變化，a*無(wú)明顯變化，L*從88.73±1.33降至85.09±1.27，b*從-3.87±1.30降至-5.74±1.29，dE從12.64±1.43升至16.75±1.68。在白色三角帆蚌實(shí)驗(yàn)組中，珍珠顏色參數(shù)b*和dE較對(duì)照組差異顯著，其中補(bǔ)充β-胡蘿卜素組的珍珠顏色參數(shù)b*從-4.63±0.98降至-5.57±1.55，dE從14.88±0.93升至16.00±1.13；補(bǔ)充蝦青素組的珍珠顏色參數(shù)b*從-4.63±0.98降至-5.06±1.82，dE從14.88±0.93升至16.12±2.69，而L*和a*均未見(jiàn)顯著變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，不同色系三角帆蚌所育珍珠的圓度與對(duì)照組無(wú)明顯差異。通過(guò)補(bǔ)充類胡蘿卜素，紫色系三角帆蚌的珍珠光澤度未呈現(xiàn)顯著差異；白色系三角帆蚌的珍珠光澤度較對(duì)照組則有顯著變化，β-胡蘿卜素組和補(bǔ)充蝦青素組分別從33.58±2.87升至40.26±2.86和42.72±3.91，提高了19.89%和25.67%。

表3 補(bǔ)充β-胡蘿卜素和蝦青素對(duì)2種色系三角帆蚌所育珍珠顏色、圓度和光澤度的影響

3 討論

3.1 類胡蘿卜素的種類在貝類組織中積累差異

水產(chǎn)品中肉質(zhì)粉紅的魚(yú)類、魚(yú)卵以及蝦、軟體動(dòng)物殼等含有大量類胡蘿卜素[20]。由于動(dòng)物本身及其各種組織對(duì)類胡蘿卜素的需求具有特殊性，因此不同水產(chǎn)動(dòng)物各組織累積的類胡蘿卜素種類和含量各不相同[21]。全成等[22]在餌料中添加葉黃素后單獨(dú)和混合投喂黃顙魚(yú)，研究其組織中葉黃素的沉積水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)投喂葉黃素42 d后肝臟和肌肉中的葉黃素水平顯著增加。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)海大金貝外套膜和腎臟等組織中果膠黃質(zhì)含量顯著高于正常扇貝。本實(shí)驗(yàn)中選用的紫色系和白色系三角帆蚌在同一環(huán)境養(yǎng)殖，結(jié)果顯示，在紫色系三角帆蚌實(shí)驗(yàn)組中肝胰腺、外套膜邊緣膜和中央膜的TCC均顯著高于對(duì)照組，且除斧足外添加不同類胡蘿卜素的實(shí)驗(yàn)組之間也存在顯著差異。在白色系三角帆蚌中，各實(shí)驗(yàn)組肝胰腺和外套膜邊緣膜的TCC均顯著高于對(duì)照組，中央膜和斧足差異不顯著。李慶昌等[24]通過(guò)研究波紋巴非蛤各組織總類胡蘿卜素含量發(fā)現(xiàn)其斧足中TCC最高。而本研究中不同色系三角帆蚌的斧足TCC含量均為最低，推測(cè)其原因可能是不同貝類之間相同組織對(duì)TCC的吸收能力是不同的。前人研究表明，肝胰腺是轉(zhuǎn)化沉積類胡蘿卜素的主要場(chǎng)所[25,26]，可將機(jī)體需要的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運(yùn)至其他組織器官中，本實(shí)驗(yàn)不同色系三角帆蚌的肝胰腺TCC均最高也表明了肝胰腺組織在類胡蘿卜素代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。紫色系三角帆蚌肝胰腺TCC顯著高于白色系個(gè)體，表明不同色系的三角帆蚌吸收轉(zhuǎn)運(yùn)類胡蘿卜素能力不同。此外，2種色系三角帆蚌實(shí)驗(yàn)組中，補(bǔ)充蝦青素組的三角帆蚌TCC提升程度遠(yuǎn)高于補(bǔ)充β-胡蘿卜素組個(gè)體，表明三角帆蚌更易吸收累積蝦青素形式的類胡蘿卜素。綜上，表明不同種質(zhì)三角帆蚌的各組織對(duì)β-胡蘿卜素和蝦青素的富集能力存在差異。

3.2 添加類胡蘿卜素對(duì)貝類殼色和珍珠顏色的影響

類胡蘿卜素是影響貝類殼色的重要因素之一[27]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)補(bǔ)充β-胡蘿卜素和蝦青素，紫色系三角帆蚌內(nèi)殼色參數(shù)b*和dE均顯著增加，即更加趨向藍(lán)色度且顏色加深；白色系三角帆蚌僅補(bǔ)充蝦青素組的內(nèi)殼色參數(shù)a*顯著增加，即更加趨向紅色度，這與孫明龍[14]等補(bǔ)充β-胡蘿卜素實(shí)驗(yàn)中白色系三角帆蚌殼色均未見(jiàn)明顯變化的結(jié)果不同，推測(cè)延長(zhǎng)添加類胡蘿卜素投喂周期可以提升三角帆蚌內(nèi)殼紅度、藍(lán)度和顏色深度，同時(shí)其種類對(duì)殼色提升效果有影響，后續(xù)可通過(guò)時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)橘黃色殼色個(gè)體TCC顯著高于棕色殼色個(gè)體[28]，進(jìn)一步證明了貝類殼色受種質(zhì)轉(zhuǎn)化類胡蘿卜素能力的影響。馬孝甜[29]研究發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝攝食轉(zhuǎn)化蝦青素后能顯著改變其肉色和殼色。YAN等[30]利用UV-Vis反射光譜結(jié)合場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)對(duì)同一三角帆蚌貝殼中乳白色和粉紫色的珍珠層進(jìn)行了對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其吸收峰強(qiáng)度隨類胡蘿卜素濃度的增加而增大，也驗(yàn)證了類胡蘿卜素與三角帆蚌內(nèi)殼色有著密切的聯(lián)系。

外套膜TCC與珍珠層顏色存在明顯的相關(guān)性，珍珠顏色的形成機(jī)理與貝殼珍珠層一致[31,32]。韓繼衛(wèi)等[33]以低濃度的β-胡蘿卜素飼喂三角帆蚌后發(fā)現(xiàn)其能夠有效提高三角帆蚌早期珍珠的色澤度。本實(shí)驗(yàn)中紫色系三角帆蚌中補(bǔ)充蝦青素組的珍珠顏色參數(shù)顯著變化，補(bǔ)充β-胡蘿卜素組珍珠顏色未見(jiàn)顯著性差異，而補(bǔ)充這2種類胡蘿卜素對(duì)白色系三角帆蚌的珍珠顏色均有顯著提升，但珍珠顏色是否能保持穩(wěn)定仍需進(jìn)一步的研究。蝦青素是類胡蘿卜素合成的終點(diǎn)，可以不通過(guò)修飾轉(zhuǎn)化而直接被貯存在動(dòng)物組織中[34]，而β-胡蘿卜素被三角帆蚌攝取后需要轉(zhuǎn)化利用，通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的生理過(guò)程才能對(duì)珍珠顏色產(chǎn)生影響，這可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)中紫色系三角帆蚌珍珠顏色參數(shù)變化規(guī)律不一致的原因。白色系三角帆蚌所育珍珠光澤度顯著提升，紫色系個(gè)體則未見(jiàn)顯著性差異，表明三角帆蚌累積類胡蘿卜素后可以改善珍珠的光澤度。綜上，在三角帆蚌的養(yǎng)殖水體中添加類胡蘿卜素，能夠提升其殼色參數(shù)進(jìn)而影響育珠質(zhì)量，改善珍珠的顏色和光澤度，具有一定的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

致謝：感謝寧波大學(xué)海洋學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖系提供培養(yǎng)小球藻的3#培養(yǎng)基配方。