姚玉珊，林珍珍，李媛，賈彤*

（1.山西大學(xué) 黃土高原研究所，山西省黃河實(shí)驗(yàn)室，黃土高原生態(tài)恢復(fù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）作為一類共生真菌，其廣泛分布于森林、草地、荒漠、農(nóng)田等生態(tài)系統(tǒng)中，與絕大多數(shù)的陸生植物形成菌根共生體系［1-3］。AMF通過菌絲侵入到植物根系，并在根表皮層內(nèi)形成叢枝和泡囊等結(jié)構(gòu)，與植物建立起共生體［4］。研究表明，叢枝菌根能夠提高宿主植物和根系對(duì)氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)而提高植物的生物量［5］，并且AMF對(duì)氮素的代謝受自身種屬、共生環(huán)境微生物、氮素形態(tài)、光照、水分、外界鹽脅迫等影響［6］。此外，AMF還可以通過多種途徑，例如，提高吸水效率［7］、擴(kuò)展植物的根系［8］、分泌螯合物［9］、提高植株生物量［10］、增強(qiáng)植物競(jìng)爭(zhēng)力和抗脅迫能力［11］及促進(jìn)光合作用［12］等，影響宿主植物對(duì)土壤養(yǎng)分元素的吸收和利用［13］。

AMF對(duì)植物的生長(zhǎng)速率和光合作用的影響已有不少報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF植株的鎂含量要高于不接種植株，進(jìn)而影響葉綠素含量，提高植物的光合作用效率［14］。AMF通過分泌細(xì)胞分裂素，促進(jìn)葉綠體發(fā)育，提高植株葉綠素含量和光合作用強(qiáng)度，并通過增加生物量來應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫［15］。研究發(fā)現(xiàn)，AMF通過提高水稻葉片蒸騰作用和水分利用效率，增強(qiáng)光合作用，同時(shí)，降低植株的暗呼吸速率，減少水稻自身碳物質(zhì)消耗，促進(jìn)其物質(zhì)積累能力［16］。此外，接種AMF也可以提高甜瓜、玉米等植物葉片中的葉綠素含量，促進(jìn)植物的光合作用能力［17］。

由于AMF本身不能進(jìn)行純培養(yǎng)，因此，可以利用宿主植物對(duì)AMF大量擴(kuò)繁來獲得所需菌劑。其中一年生草本植物高粱（Sorghum bicolor）是菌劑擴(kuò)繁的宿主植物之一［18］，其生物量大、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)速度快，有利于對(duì)土壤中污染物的富集，是一種具有修復(fù)潛力的能源作物［19］。目前大多數(shù)研究集中在單一AMF對(duì)植物生理生態(tài)特征的研究，而不同AMF是否對(duì)植物生長(zhǎng)和光合特性的影響也存在一定差異呢？因此，本試驗(yàn)選擇高粱為研究對(duì)象，通過接種四種不同類型的AMF菌劑，研究不同AMF對(duì)高粱生長(zhǎng)、生物量、葉綠素和凈光合速率等生理生態(tài)特征的影響，為受損生態(tài)系統(tǒng)篩選具有修復(fù)潛力的叢枝菌根真菌，也為我國高粱的高產(chǎn)種植以及微生物肥料的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試高粱品種為北京金盛優(yōu)品科技有限公司研發(fā)的京雜抗四雜交高粱。試驗(yàn)選用4種AMF，包括近明球囊霉菌（Glomus claroideun）、幼套球囊霉菌（Glomus etunicatum）、摩西球囊霉菌（Glomus mosseae）和根內(nèi)球囊霉菌（Glomus intraradices），菌種由南開大學(xué)和北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2020年9月采用溫室盆栽試驗(yàn)，對(duì)高粱植株設(shè)置4種不同AMF接種的處理，各個(gè)接種組分別標(biāo)記為：近明球囊霉菌處理組（GC）、幼套球囊霉菌處理組（GE）、摩西球囊霉菌處理組（GM）和根內(nèi)球囊霉菌處理組（GI），同時(shí)，將不接種AMF的處理設(shè)為對(duì)照組（CK），共5個(gè)處理，每種處理4個(gè)重復(fù)。土壤基質(zhì)使用滅菌后以2∶1比例混合的河沙和蛭石，每盆種植高粱15株，接種菌劑30 g。生長(zhǎng)15 d后，每盆添加霍格蘭營養(yǎng)液500 mL，每?jī)芍芴砑?次，培養(yǎng)90 d后進(jìn)行植株菌根侵染率、生長(zhǎng)和生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 高粱菌根侵染率的測(cè)定

收獲后測(cè)定高粱菌根感染率，取新鮮高粱根段0.5 g。將根段縮小為0.5 cm～1.0 cm，放入試管中。添加20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%KOH，并在90°C水浴加熱30 min。根系用自來水沖洗3次，浸泡在20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%鹽酸溶液5 min。去除酸溶液，加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%乳酸-苯胺藍(lán)染液。然后將試管放回90℃水浴中30 min，加入20 mL乳酸進(jìn)行脫色。隨機(jī)選取15個(gè)根段固定在載玻片上，將根切為兩部分，得到30個(gè)染色后的植物須根段，置于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

菌根感染率（MIR）的計(jì)算公式參考見式（1）：

其中，MIR為根菌根侵染率（%），NS為菌根菌節(jié)數(shù)，TNS為根段總數(shù)。

1.3.2 形態(tài)和生物量指標(biāo)

高粱種植90 d后測(cè)量植株株高、葉長(zhǎng)和葉寬。將高粱收獲后的地上和地下部分分別裝信封后，放在恒溫干燥箱中60℃、48 h烘干至恒重后，用電子天平（0.000 1 g）稱其生物量。

1.3.3 光合指標(biāo)

植株培養(yǎng)8周后，使用光合儀（CIRAS-3 Portable Photosynthesis System）對(duì)高粱的光合特性進(jìn)行測(cè)定。選擇晴天上午進(jìn)行測(cè)定，光照強(qiáng)度設(shè)定為 1200 μmol/（m2·s），溫度 25 ℃，選取新葉完全展開的第1片葉進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。測(cè)定的光合指標(biāo)包括：凈光合速率（A）、胞間 CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、水分利用效率（WUE）、水蒸氣壓虧缺（VPD）和蒸騰速率（E）。

1.3.4 葉綠素含量

稱取葉片0.5 g，浸泡于20 mL丙酮∶乙醇 =1∶1的混合溶液中，黑暗處理7 d后，用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液在663 nm、645 nm處的吸光度，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量，計(jì)算公式參考見式（2）、式（3）、式（4）。

其中A663nm、A645nm分別表示在663 nm、645 nm處的吸光值，V表示乙醇和丙酮混合溶液體積，w表示稱取葉片重量。

1.3.5 銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量

培養(yǎng)結(jié)束后收獲的植物地上部分用冷凍研磨儀磨成粉末狀，稱取0.5 g于50 mL離心管，加入1 mol/L KCl溶液 100 mL，震蕩 30 min～60 min后，過濾，取其濾液。用全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀（De Chem-Tech，CleverChem380，Germany）測(cè)定銨態(tài)氮（NH4+）、硝態(tài)氮（NO3-）和亞硝態(tài)氮（NO2-）的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析對(duì)接種不同叢枝菌根真菌的處理間植株生長(zhǎng)和光合特征進(jìn)行比較。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 高粱接種AMF后的菌根侵染率

接種4種類型的AMF，菌根侵染率都超過50%，接種不同類型AMF的高粱菌根侵染率具有顯著差異（P＜ 0.05；圖1和圖2）。接種不同AMF對(duì)其根系侵染率的各處理組高低順序?yàn)椋篏M＞GE＞GC＞GI。其中，摩西球囊霉菌侵染率最高且顯著高于其他菌種（P＜0.05），達(dá)到75.25%。接種摩西球囊霉菌后的菌根侵染率顯著高于接種根內(nèi)球囊霉菌（P＜0.05），但是接種摩西球囊霉菌、近明球囊霉菌和幼套球囊霉菌的高粱侵染率并沒有顯著差異（P＞ 0.05）。

圖1 高粱接種不同AMF后的菌根侵染率（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Fig.1 Mycorrhizal infection rates of S.bicolor inoculated with different AMF(Mean±SE)

圖2 高粱接種四種AMF的土壤孢子（a）及菌根侵染狀況（b）Fig.2 Soil spore(a)and mycorrhizal infection status of S.bicolor inoculated with different AMF(b)

2.2 接種AMF對(duì)高粱生長(zhǎng)指標(biāo)和生物量的影響

研究結(jié)果表明，接種AMF均可促進(jìn)高粱的生長(zhǎng)，且不同AMF對(duì)高粱生長(zhǎng)和生物量的促進(jìn)作用具有顯著差異（P＜ 0.05）（圖3）。其中，接種幼套球囊霉菌和摩西球囊霉菌對(duì)高粱生長(zhǎng)的影響最為顯著。與對(duì)照組相比，接種摩西球囊霉菌使得高粱植株高提高32.85%，接種幼套球囊霉菌后，高粱植株高提高17.71%（圖3（a））。接種幼套球囊霉菌后，高粱葉長(zhǎng)增加20.56%，接種其他類型的AMF對(duì)高粱葉長(zhǎng)沒有顯著性差異（P ＜ 0.05）（圖3（b））。接種摩西球囊霉菌和幼套球囊霉菌后，高粱葉寬分別增加27.50%、17.50%，顯著高于其他處理（P＞0.05），接種近明球囊霉菌的實(shí)驗(yàn)組葉寬值最低（圖3（c））。接種幼套球囊霉菌和摩西球囊霉菌后，高粱生物量分別提高90.57%、38.93%，其中接種摩西球囊霉菌后，高粱生物量達(dá)到最大值差異（P＞0.05），接種其他類型的AMF沒有顯著提高高粱幼苗的生物量（圖 3（d））。

圖3 接種AMF對(duì)高粱生長(zhǎng)和生物量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Fig.3 Effects of AMF inoculations on growth and biomass of S.bicolor(Mean±SE)

2.3 接種AMF對(duì)高粱葉綠素含量的影響

接種不同類型AMF對(duì)高粱葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量的影響具有顯著差異（P＜ 0.05）（圖4）。其中，接種近明球囊霉菌和摩西球囊霉菌使得高粱葉綠素a含量分別提高22.96%、17.27%。接種近明球囊霉菌和摩西球囊霉菌后高粱葉綠素a含量顯著高于接種根內(nèi)球囊霉菌（P＜0.05）。接種近明球囊霉菌的高粱葉綠素a含量最高，其次是接種摩西球囊霉菌處理組。接種根內(nèi)球囊霉菌對(duì)高粱葉綠素a含量沒有顯著影響（P＞0.05）；接種摩西球囊霉菌促進(jìn)高粱葉綠素b含量提高49.90%。接種不同類型AMF對(duì)高粱葉綠素總含量都有顯著提高（P＜0.05）。接種摩西球囊霉菌后，葉綠素總含量提高26.56%，顯著高于接種其他菌劑（P＜0.05）。

圖4 接種AMF對(duì)高粱葉綠素含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Fig.4 Effects of AMF inoculations on the chlorophyll contents of S.bicolor(Mean±SE)

2.4 不同AMF侵染對(duì)高粱光合特性的影響

不同AMF對(duì)高粱的光合特性的影響具有顯著差異（P＞0.05），接種AMF顯著提高高粱的凈光合速率（A）（P＜ 0.05）（表1）。接種根內(nèi)球囊霉菌和摩西球囊霉菌分別使高粱的A提高51.01%、54.36%。接種不同類型AMF對(duì)高粱Ci有不同的影響；接種近明球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌使高粱Ci分別增加94.79%和80.21%。接種四種類型AMF對(duì)高粱蒸騰速率（E）的影響明顯不同（P＞0.05），其中，接種近明球囊霉菌使高粱的E提高70.34%，其他處理對(duì)高粱的E沒有顯著影響（P＞0.05）；接種近明球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌后，高粱氣孔導(dǎo)度（Gs）分別提高81.89%和70.93%；接種摩西球囊霉菌的高粱WUE顯著高于接種近明球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌的高粱WUE（P＜0.05），且接種摩西球囊霉菌使高粱的WUE達(dá)到最大值（表1）。

表1 接種不同AMF對(duì)高粱光合特性的影響Table 1 Effects of AMF inoculations on photosynthetic characteristics of S.bicolor

2.5 接種AMF對(duì)高粱氮素含量的影響

接種不同類型AMF對(duì)高粱銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量的影響均具有顯著差異（P＜0.05）。與不接種相比，接種近明球囊霉菌、幼套球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌后，高粱銨態(tài)氮含量分別提高169.87%、167.42%、141.68%。接種近明球囊霉菌使高粱硝態(tài)氮含量增加58.38%，亞硝態(tài)氮含量增加36.28%（圖5）。

圖5 接種AMF對(duì)高粱氮素含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Fig.5 Effects of AMF inoculations on nitrogen contents of S.bicolor(Mean±SE)

3 討論

高粱可與AMF形成植物-微生物共生體［20］。本研究用4種AMF接種于高粱根部，發(fā)現(xiàn)所有真菌均能在一定程度上促進(jìn)高粱幼苗的生長(zhǎng)，但高粱與不同AMF間的相互效應(yīng)存在明顯的不同（P＜0.05）。菌根侵染率是衡量植物根系菌根化的重要指標(biāo)，侵染率越高說明菌根效應(yīng)越強(qiáng)。接種摩西球囊霉菌后高粱植株菌根侵染率最高，生長(zhǎng)速率明顯加快，這與亓琳、楊國等人的研究結(jié)果一致［21-22］。在相同的土壤條件下，摩西球囊霉菌更容易與高粱幼苗建立共生關(guān)系。接種幼套球囊霉菌和摩西球囊霉菌均顯著提高了高粱的株高，葉長(zhǎng)及生物量（P＜0.05）。研究表明，AMF與植物共生后，會(huì)改變其根部的生長(zhǎng)特性，充分活化根部，提高植株的抗病性［23］；同時(shí)，AMF可以顯著提高植物萜類化合物的合成與土壤微量元素的吸收，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)與調(diào)節(jié)次生代謝方面發(fā)揮著重要作用［24-25］。

光合作用對(duì)植物初級(jí)代謝具有重要意義，并且AMF促進(jìn)植物生長(zhǎng)的過程與其提高植物光合作用密切相關(guān)。葉綠素含量的多少在光合作用進(jìn)行過程中起到關(guān)鍵性作用，是植物光合作用過程中最主要、最敏感的色素［26］。凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、胞間二氧化碳是用來判斷光合作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)［27］。凈光合速率反映的是植物有機(jī)物的積累即干物質(zhì)的積累。本研究發(fā)現(xiàn)，接種根內(nèi)球囊霉菌和摩西球囊霉菌顯著提高了高粱的凈光合速率，接種近明球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌后，高粱氣孔導(dǎo)度（Gs）分別提高81.89%和70.93%，說明近明球囊霉菌和根內(nèi)球囊霉菌對(duì)植物控制葉片水蒸氣和CO2擴(kuò)散的通道方面具有一定的影響。王志剛等［28］證實(shí)接種AMF對(duì)神東礦區(qū)采煤沉陷地復(fù)墾植物恢復(fù)具有促進(jìn)作用，接種AMF對(duì)礦區(qū)植物的生物量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、和蒸騰速率等均有顯著提高（P＜0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)接種根內(nèi)球囊霉菌和摩西球囊霉菌后，凈光合速率顯著大于其他三組處理（P＜0.05），這可能是由于菌根形成與AMF自身生長(zhǎng)繁殖需要消耗宿主植物部分的光合產(chǎn)物，從而改變了植物碳水化合物的輸出和形成，促進(jìn)了接種AMF的植株凈光合速率的提高［29］。此外，高粱植株接種根內(nèi)球囊霉菌和摩西球囊霉菌后，葉綠素含量與對(duì)照組相比也顯著增加（P＜0.05），一定程度上提高了凈光合速率。

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的營養(yǎng)元素。接種AMF都提高了高粱植株銨態(tài)氮的含量，但接種幼套球囊霉菌、根內(nèi)球囊霉菌和摩西球囊霉菌后，植株內(nèi)硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮的含量與對(duì)照組相比沒有顯著性差異。這表明AMF可以顯著促進(jìn)高粱對(duì)銨態(tài)氮的吸收與利用。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮都可以直接被植物利用，但銨態(tài)氮的吸收主要是由被動(dòng)運(yùn)輸完成，硝態(tài)氮的吸收則是跨細(xì)胞膜的主動(dòng)運(yùn)輸［30］。AMF與植物共生后，產(chǎn)生的菌絲極大地拓展了植物根系的面積范圍，并將土壤中的氮元素向根系富集，因此高粱的銨態(tài)氮含量才會(huì)明顯提高［31］。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)不同AMF對(duì)高粱生長(zhǎng)和光合特性均有促進(jìn)作用，其中幼套球囊霉菌和摩西球囊霉菌在提高高粱的株高、葉長(zhǎng)和生物量方面的效果更顯著（P＜0.05），根內(nèi)球囊霉菌和摩西球囊霉菌可以顯著增強(qiáng)高粱的凈光合速率。此外，接種AMF還可以提高高粱的氮素利用效率。然而，自然界中AMF并不是單一存在，因此AMF與高粱幼苗根系及其他微生物之間的關(guān)系，以及AMF混合接種后對(duì)植物生長(zhǎng)和生理生態(tài)特征的影響仍然需要進(jìn)一步深入研究。