劉云，葉進(jìn)培，郭興萍

（1.山西醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001；2.山西大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院，山西 太原 030006；3.山西白求恩醫(yī)院（山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山西 太原 030032）

0 引言

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是存在于人和動物的多種器官組織中（如骨髓、脂肪、臍帶、胎盤等）成纖維狀的貼壁細(xì)胞，在特定條件下可以誘導(dǎo)分化形成多種功能的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。由于它具有自我更新、多項分化潛能、低免疫原性和免疫調(diào)控以及向缺血或損傷組織歸巢等特性，對多種疑難疾病的靶向治療和免疫治療有重大意義。2006年國際細(xì)胞治療學(xué)會（ISCT）［1］確定人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）的鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：（1）在塑料培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長，在含血清培養(yǎng)基內(nèi)，高度增殖；（2）表達(dá)CD105、CD73、CD90，不 表 達(dá) CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79ɑ或 CD19 和 HLA-DR；（3）在體外可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞。

雖然骨髓MSC較為常見，但含量很低，占骨髓單核細(xì)胞的0.000 1%～0.01%，且分離和提純的難度較大，取材時對人體損傷較大，從而限制了骨髓MSC在臨床中的應(yīng)用。相比于人骨髓MSC，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell，hADSC）取材時對捐贈者創(chuàng)傷較小，而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）取材更為方便，且具有旺盛的自我更新能力及多向分化潛能，可以大規(guī)模的分離，是目前MSC用于細(xì)胞移植和臨床治療的主要種子細(xì)胞［2-6］。然而骨髓、脂肪、臍帶等組織來源的MSC，由于組織捐獻(xiàn)者或取材部位的不同會導(dǎo)致細(xì)胞特性和功能存在差異，影響臨床研究與應(yīng)用。全能干細(xì)胞如人胚胎干細(xì)胞（Human Embryonic Stem Cell，hESC）和重編程誘導(dǎo)干細(xì)胞（Human Induced Pluripotent Stem Cell，hiPSC）是一種來源單一且品質(zhì)高度相同的高度未分化細(xì)胞，具有發(fā)育的全能性，能分化衍生成包括間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Embryonic Stem Cell derived Mesenchymal Stem Cell，hESC-MSC）在內(nèi)的多種細(xì)胞［7］。因此用人全能干細(xì)胞衍生的MSC作為新的種子細(xì)胞來源，具有單一的遺傳及生物學(xué)背景，便于細(xì)胞的質(zhì)量控制以及標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化的生產(chǎn)，有望成為理想的臨床（藥物）細(xì)胞制劑用于治療多種病癥。

迄今關(guān)于MSC的臨床研究報道已有大量報道（www.clinicaltrials.com），但是大都處于臨床實驗的初期，對MSC在體內(nèi)的治療作用機(jī)制仍不清晰。為了深入研究MSC在體內(nèi)的作用機(jī)理，需要掌握其植入體內(nèi)后的行蹤，直觀、實時的檢測MSC在體內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)歸、融合及存活狀態(tài)等；干細(xì)胞標(biāo)記體內(nèi)示蹤是有效的研究途徑［8］。MSC標(biāo)記示蹤方法主要有熒光蛋白法、熒光染料法、抗原法、磁共振成像法（MRI）等［9］，而抗原法會使結(jié)果出現(xiàn)假陽性，且檢測起來相對費(fèi)時費(fèi)力［10］；MRI的不足是造影劑會對機(jī)體產(chǎn)生不良影響，而且同樣會出現(xiàn)假陽性結(jié)果［11］；熒光染料法由于經(jīng)過染料標(biāo)記的細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬后，細(xì)胞碎片在巨噬細(xì)胞內(nèi)也可熒光表達(dá)，還可使細(xì)胞周圍的其他細(xì)胞出現(xiàn)假陽性，不宜用于細(xì)胞長期示蹤［12］。熒光蛋白可自發(fā)產(chǎn)生熒光，通過熒光顯微鏡就能直觀檢測到，其中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）較為常用，該蛋白質(zhì)在藍(lán)色光線波長范圍下激發(fā)會發(fā)出綠色熒光［13-14］，它由于不需要任何額外的底物來激發(fā)信號，不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且易于檢測等優(yōu)勢在細(xì)胞標(biāo)記示蹤領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［15］。因此，干細(xì)胞標(biāo)記綠色熒光蛋白體內(nèi)示蹤是有效的研究途徑。

目前關(guān)于干細(xì)胞綠色熒光蛋白標(biāo)記示蹤的研究主要集中在動物MSC，如大鼠、比格犬、兔的骨髓和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞［16-18］。MSC綠色熒光蛋白標(biāo)記示蹤雖然有一些對人成體組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞的報道，但對標(biāo)記細(xì)胞的生物學(xué)特性分析尚不全面，缺乏對多種不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率或綠色熒光蛋白標(biāo)記效率的評價。Stepniewski等［19］比較了hADSCs-Luc-GFP和體外生成的心肌細(xì)胞在心肌梗死細(xì)胞治療模型中的效果；Gao等［20］將標(biāo)記GFP基因的hADSC移植到脊髓損傷小鼠進(jìn)行示蹤證明了移植的人類細(xì)胞在宿主脊髓組織中的長期存活、成功的神經(jīng)轉(zhuǎn)換和功能整合。Stepniewski等［19］和 Gao 等［20］在 植 入 其 GFP+hADSC前均沒有對GFP+hADSCs進(jìn)行生物學(xué)特性分析，無法確保hADSC標(biāo)記GFP基因后生物學(xué)特性沒有改變，且不會影響之后的示蹤結(jié)果。曹慧玲等［21］探討了hUC-MSC標(biāo)記GFP前后的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無差別；而王巍巍等［22］雖然對hADSC標(biāo)記GFP前后的成脂、成骨及增殖能力進(jìn)行了分析，但缺乏對細(xì)胞表型、成軟骨分化影響的探究。關(guān)于人的全能干細(xì)胞，特別是有關(guān)hESC衍生的hESCMSC的GFP標(biāo)記的研究尚未見報道。hESCMSC作為一種新穎的種子細(xì)胞來源，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。本實驗室最近建立了一種獨(dú)特、高效的hESC-MSC分化制備方法，分化出的hESC-MSC在增殖、多項分化潛能及免疫調(diào)節(jié)功能方面都比hUC-MSC更為高效［23］。本研究針對該新穎MSC細(xì)胞（hESC-MSC），對照有關(guān)組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞包括hUC-MSC、hADSC進(jìn)行了由慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因標(biāo)記，并全面分析和比較了它們的生物學(xué)特性及其慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM高糖（博士德）、細(xì)胞培養(yǎng)液DMEMF/12（Gibco）、細(xì)胞培養(yǎng)液MSCBM（達(dá)科為）、明膠（索萊寶）、胎牛血清（Gibco）、胰蛋白酶（Gibco）、嘌呤霉素（索萊寶）、PEI轉(zhuǎn)染試劑（Polysciences）、助轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑polybrene（吉凱基因）、柱式質(zhì)粒 DNA提取試劑盒（生工）、0.45 μm濾膜（生工）、茜素紅、阿利新蘭染色液、油紅O染色液均購自索萊寶，成脂/成骨/成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒（ScienCell）、CCK-8（博士德）、流式抗體（BD Biosciences）；

流式細(xì)胞儀（BD LSFortessa X-20）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Eppendorf）、生物安全柜（海爾）、Nano-Drop核酸定量儀（Thermo Fisher）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞、質(zhì)粒來源與細(xì)胞培養(yǎng)

本研究所涉及的人體組織和細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)研究項目均已得到山西大學(xué)，山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)科倫理審查委員會批準(zhǔn)。分別是“人臍帶胎盤細(xì)胞成分的分離和特性研究”（編號：SXULL2019067）；“由人類胚胎干細(xì)胞衍生具有臨床兼容性且可移植的多能造血干細(xì)胞的研究”（山西醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會）。

hUC-MSC在本實驗室前期已經(jīng)成功分離與擴(kuò)增，hESC-MSC在本實驗室前期也已成功制備并擴(kuò)增培養(yǎng)［23］。hUC-MSC和hESC-MSC的傳代培養(yǎng)使用DMEM/F12+質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS，分別選用第3-6代和第10-20代，它們均為單層貼壁細(xì)胞，成纖維樣細(xì)胞形態(tài)；經(jīng)流式細(xì)胞儀表面抗原檢測，均陽性高表達(dá)CD73、CD90、CD105，陰性表達(dá) CD34、CD11b、CD19、CD45 和 HLA-DR［23］；hESC-MSC 和hUC-MSC經(jīng)成脂、成骨和成軟骨分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)之后都具有分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的能力，均符合間充質(zhì)干細(xì)胞2006年國際最低標(biāo)準(zhǔn)［1］。

hADSC的分離、培養(yǎng)和定性：抽脂獲得的脂肪樣品（太原美歐華整形醫(yī)院志愿者）。在生物安全柜中無菌條件下用含2×雙抗（100 U/mL青霉素和100 ug/mL鏈霉素）的生理鹽水清洗4～6遍至清洗液清亮。添加等體積的膠原酶I（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%），置于恒溫振蕩器，37℃消化60 min，在離心機(jī)上1000 r/min離心5 min，棄上清。用達(dá)科為（DKW）培養(yǎng)液重懸細(xì)胞團(tuán)（脂肪基質(zhì)血管細(xì)胞成分，SVF），將重懸細(xì)胞液再用100 μm細(xì)胞篩網(wǎng)濾后將濾液在離心機(jī)上1000 r/min離心5 min，棄上清后鋪至六孔板培養(yǎng)（第0代），3×105個/孔，每2 d～3 d換一次液，選用第3-6代hADSC用于實驗。其三系分化潛能（成脂、成骨和成軟骨）測定方案參見本實驗室前期工作［23］。

293T細(xì)胞株、pLVX-IRES-Puro-GFP主質(zhì)粒和pSPAX、pMD2.G包裝質(zhì)粒由山西大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院吳長新教授實驗室惠贈。

1.2.2 293T細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)

將凍存的293T細(xì)胞從-80℃冰箱取出，浸入37℃恒溫水浴鍋中使其融化。待完全融化后取出細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，再加入3倍的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕吹吸混勻，1000 r/min離心5 min，重復(fù)離心1次，吸走上清液，加入1 mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以8×103cell/cm2的密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1 d～2 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁融合度達(dá)到90%左右，用胰蛋白酶消化、1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞仍以8×103cell/cm2的密度接種至新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒系統(tǒng)的構(gòu)建

293T細(xì)胞生長狀態(tài)良好且融合度達(dá)到60%～70%，在滅菌的1.5 mL EP管中加入主質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共 5 μg，再加入 15 μL PEI轉(zhuǎn)染試劑和500 μL無血清DMEM 高糖培養(yǎng)液，輕柔混勻，室溫下孵育20 min。將293T細(xì)胞原培養(yǎng)液棄去，加入孵育好的轉(zhuǎn)染液，再加入4.5 mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕混勻，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后取出培養(yǎng)瓶吸取4 mL的細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集至10 mL無菌離心管，放入4℃冰箱中暫時保存。在培養(yǎng)瓶中添加4 mL的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；經(jīng)過24 h后再次收集上清液于第1天的10 mL無菌離心管中，兩次收集的上清液混勻，于離心機(jī)上3000 r/min離心10 min，使用10 mL一次性無菌注射器吸取離心后的上清液，注射器去針頭，通過0.45 μm濾器過濾除菌，將過濾后的上清液分裝于1.5 mL EP管中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的pLVXIRES-Puro-GFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)

將生長狀態(tài)良好的hESC-MSC、hADSC、hUCMSC細(xì)胞用胰酶消化分別以8×103cell/cm2的密度重懸接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，24 h后，-80℃取出凍存的慢病毒上清，取3個15 mL離心管，分別加入1 mL慢病毒上清于離心管內(nèi)，于離心管內(nèi)再各加入hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液各4 mL（即三種細(xì)胞慢病毒感染過程中慢病毒所用量一致），之后在3個離心管內(nèi)加入慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑Polybrene各4 μL，輕輕混勻，將混合好的感染液分別加入對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h以后熒光顯微鏡下觀察各細(xì)胞發(fā)光情況，每種細(xì)胞分別取2×105個細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析各細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。細(xì)胞培養(yǎng)液中加Puromycin（Puro）篩選細(xì)胞，當(dāng)觀察到幾乎所有細(xì)胞均帶有熒光時即停止加Puromycin，將篩選出的GFP+hMSCs增殖傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.5 GFP基因標(biāo)記前后hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC增殖檢測

將標(biāo)記GFP基因前后的hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC細(xì)胞分別以每孔相同的起始接種數(shù)量（1×103個細(xì)胞）分別鋪至96孔板中，每 24 h加入 Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）于3個重復(fù)孔內(nèi)，2 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（D）值，共測5 d，各組設(shè)與實驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。結(jié)果見圖1。

圖1 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC標(biāo)記GFP基因前后增值能力。（a)hESC-MSC和GFP+hESC-MSC增殖曲線對比；(b)hADSC和GFP+hADSC增殖曲線對比；(c)hUC-MSC和GFP+hUC-MSC增殖曲線對比Fig.1 Value-added ability before and after labeling GFP gene with hESC-MSC,hADSC and hUC-MSC.(a)Comparison of proliferation curves between hESC-MSC and GFP+hESCMSC;(b)Comparison of proliferation curves between hADSC and GFP+hADSC;(c)Comparison of proliferation curves between hUC-MSCand GFP+hUC-MSC

1.2.6 GFP基因標(biāo)記前后hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的誘導(dǎo)分化

成脂分化：12孔板用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的明膠包被30 min以上，包被成功將明膠吸出，將hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC和其對應(yīng)的相同 代 數(shù) 的 GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUC-MSCs分別以每孔1×104cell/cm2的細(xì)胞密度接種12孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中放置 1 d～3 d，每天更換MSC培養(yǎng)液。細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，棄去原培養(yǎng)液，加入成脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)培 養(yǎng) 基（Adipogenic Differentiation Medium，MADM）。每隔3 d換用新鮮的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)分化14 d左右，油紅O染色，觀察成脂分化結(jié)果。

成骨分化：細(xì)胞接種方法同成脂分化，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，棄去原培養(yǎng)液，加入成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Osteogenic Differentiation Medium，MODM），每隔3 d換用新鮮的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)21 d左右，茜素紅染色，觀察分化結(jié)果。

成軟骨分化：分別吸取 5 μL細(xì)胞濃度為1×107cell/mL 的 hMSCs、GFP+hMSCs細(xì)胞懸液于96孔板的孔中央，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 2 h后加入 100 μL的成軟骨分化培養(yǎng)基（Chondrogenic Differentiation Medium，MCDM）。分化14 d后，阿利新藍(lán)染色法染色，觀察成軟骨分化結(jié)果。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測GFP基因標(biāo)記前后hESCMSC、hADSC、hUC-MSC的表面抗原表達(dá)

分 別 取 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC、GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUCMSC細(xì)胞懸液，離心后用染色緩沖液重懸，加入相應(yīng)抗體各1 μL 30 min后中和洗滌1～2次進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。檢測細(xì)胞抗原標(biāo)記為CD73-APC、CD90-PE/Cy7、CD105-Percp、（CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR）-PE。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用獨(dú)立樣本 t檢 驗；*P＜0.05為顯著，**P＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果

與hUC-MSC和hESC-MSC相似，hADSC在倒置顯微鏡下呈單層纖維樣細(xì)胞貼壁。流式細(xì)胞儀檢測hADSC表面抗原的結(jié)果為陽性高表 達(dá) CD73、CD90、CD105，陰 性 表 達(dá) CD34、CD11b、CD19、CD45和 HLA-DR。經(jīng)相應(yīng)定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，可觀察到向成脂，成骨和成軟骨細(xì)胞分化的現(xiàn)象，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本要求［1］。

2.1 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后GFP的表達(dá)及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC經(jīng)慢病毒感染48 h后，明場光線下可見三者均呈纖維狀單層貼壁，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，保持了正常良好的細(xì)胞形態(tài)（圖2）；倒置熒光顯微鏡下可見標(biāo)記GFP基因成功的hESC-MSC、hADSC和hUCMSC細(xì)胞受藍(lán)色光激發(fā)產(chǎn)生的綠色熒光（圖2），且三者GFP陽性細(xì)胞的數(shù)量存在差異。

圖2 等量pLVX-IRES-Puro-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 48 h后細(xì)胞形態(tài)及GFP表達(dá)Fig.2 Cell morphology and GFP expression after hESC-MSC,hADSC and hUC-MSC transduced with the same amount of pLVXIRES-Puro-GFP lentivirus for 48 h

用等量的pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC細(xì)胞，它們的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為（18.3±0.1）%，（4.5±0.3）%，（12.0±0.2）%。hESC-MSC的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著高于hADSC（為hADSC細(xì)胞的4.06倍，P＜0.01）和hUC-MSC（為hUC-MSC的1.52倍，P＜0.01）。

2.2 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC標(biāo)記 GFP基因前后增殖能力比較

hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 標(biāo)記 GFP基因前后的生長曲線顯示如圖1：hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC與其對應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)后相同代數(shù)GFP+hMSCs的生長曲線相近，且每24 h在450 nm波長下測得的D值均無顯著差異（P＞0.05），hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 細(xì) 胞 被 標(biāo) 記GFP基因后增殖力無明顯改變。

2.3 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC標(biāo)記 GFP基因前后體外誘導(dǎo)分化情況

GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUC-MSC成脂誘導(dǎo)分化14 d后顯微鏡下均可見形成胞漿內(nèi)脂質(zhì)滴，熒光顯微鏡下仍可見細(xì)胞發(fā)綠色熒光，油紅O染色鑒定呈紅色（圖3）。21 d成骨誘導(dǎo)分化后GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUC-MSC細(xì)胞間形成骨結(jié)節(jié)，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)綠色熒光，茜素紅染色呈陽性（圖3）。誘導(dǎo)成軟骨分化14 d后GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUCMSC形成成軟骨團(tuán)塊，熒光顯微鏡下可見團(tuán)塊發(fā)綠色熒光，阿利新藍(lán)染色呈深藍(lán)色（圖3）。染色顯示它們的三系分化（成脂、成骨、成軟骨）與轉(zhuǎn)導(dǎo)前的結(jié)果均一致（圖3）。

圖3 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC細(xì)胞標(biāo)記GFP基因前后體外成脂、成骨、成軟骨分化染色，油紅O染色為紅色或粉紅色即為脂肪粒，茜素紅染色為橙紅色即為成骨細(xì)胞，阿利辛藍(lán)染色為藍(lán)綠色即為軟骨細(xì)胞Fig.3 Differentiation staining of adipogenesis,osteogenesis and chondrogenesis in vitro before and after labeling GFP gene in hESC-MSC,hADSC and hUC-MSC cells,oil red O staining is red or pink for fat particles,osteoblasts are stained orange-red with alizarin red,the chondrocytes stained with Alcian blue stain Kit are blue-green

2.4 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 標(biāo)記GFP基因前后細(xì)胞相關(guān)表面抗原表達(dá)

hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC 和 GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC、GFP+hUC-MSC細(xì)胞表面抗原CD73、CD90、CD105陽性比例均在95% 以上，CD34、CD11b、CD19、CD45和 HLADR幾乎不表達(dá)（＜0.2%，圖4）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC標(biāo)記GFP基因前后細(xì)胞表面抗原表達(dá)Negative表示抗原CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DRFig.4 Analysis of cell surface antigen expression before and after labeling GFP gene with hESC-MSC,hADSC and hUC-MSC by flow cytometry Negative means antigens CD34,CD11b,CD19,CD45 and HLA-DR

3 討論

目前干細(xì)胞標(biāo)記方法很多，其中綠色熒光蛋白基因標(biāo)記較為常見，但大多對動物來源的MSC進(jìn)行標(biāo)記研究，對人源MSC的標(biāo)記研究較少，且關(guān)于人源MSC標(biāo)記GFP基因后的生物學(xué)特性是否受到影響，更是鮮有報道且特性分析不全面［22，24］。本研究對不同來源的MSC包括hESC-MSC，hADSC和hUC-MSC進(jìn)行了GFP基因標(biāo)記，并分析比較了它們標(biāo)記前后的生物學(xué)特性差異，包括增殖力，成脂成骨成軟骨分化潛力和細(xì)胞表型的測定。Yu等［25］對人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（hPMSCs）標(biāo)記GFP基因，并對其進(jìn)行了特性分析，結(jié)果表明GFP+hPMSCs表型不變，仍具有成脂、成骨和肝分化潛能，本研究結(jié)果同樣得出GFP+hESC-MSC、GFP+hADSC和GFP+hUC-MSC與相應(yīng)的未標(biāo)記GFP基因的MSC比較細(xì)胞表型不發(fā)生改變，仍具有成脂、成骨分化潛能，且新發(fā)現(xiàn)三者M(jìn)SCs標(biāo)記GFP基因后細(xì)胞形態(tài)及增殖力均無明顯改變并仍具備成軟骨分化潛能。

慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效率是標(biāo)記干細(xì)胞的重要環(huán)節(jié)，但僅有關(guān)于單個干細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的研究［26］，不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的比較尚未見報道。本研究用等量的pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒分別同時感染人胚胎干細(xì)胞衍生的MSC、人臍帶MSC和人脂肪MSC，流式細(xì)胞儀檢測它們的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率存在顯著性差異（P＜0.01），這些差異可能與不同來源的hMSC增殖力有關(guān)，葉進(jìn)培等報道hESC-MSC的增值力顯著高于hUC-MSC［23］。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)用pLVX-IRES-Purop-GFP慢病毒感染 hESC-MSC、hADSC、hUCMSC細(xì)胞標(biāo)記GFP基因后對細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性，不影響hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的多項分化潛能，且細(xì)胞生長增殖狀態(tài)良好，細(xì)胞表型的表達(dá)無明顯改變；人胚胎干細(xì)胞衍生的MSC慢病毒感染效率顯著高于組織來源的人脂肪MSC和人臍帶MSC，提示前者可能更適合用以慢病毒感染的示蹤標(biāo)記或者基因修飾。