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擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期各組織的脂肪酸組成

2022-11-23 02:57何先達鐘文杰余金達陳創(chuàng)思熊永龍王樹啟溫小波陳翠英
關(guān)鍵詞:青蟹脂類極性

何先達,鐘文杰,余金達,陳創(chuàng)思,熊永龍,王樹啟,溫小波,陳翠英*

(1.汕頭大學(xué)廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室,廣東 汕頭 515063;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院,廣東 廣州 510642)

擬穴青蟹隸屬于甲殼綱十足目短尾亞目梭子蟹科,因適應(yīng)力強、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富,經(jīng)濟價值高,是我國東南沿海重要的經(jīng)濟蟹類之一[1].在十足目甲殼類動物卵巢發(fā)育過程中,卵黃發(fā)生期是一個重要階段,期間會呈現(xiàn)血淋巴中卵黃蛋白原濃度急劇增加和脂類快速蓄積的特點[2].脂類在甲殼類動物卵巢快速發(fā)育過程中有著十分重要的作用,它不僅提供卵巢必需脂肪酸、磷脂和某些激素的前體等必需營養(yǎng)成分,更是為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)和能量[3].磷脂通過促進卵黃發(fā)生期營養(yǎng)物質(zhì)的快速積累和脂類代謝進而促進卵黃發(fā)生[4].功能性長鏈多不飽和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acid,LC-PUFA),如花生四烯酸(20:4n-6,ARA)、二十碳五烯酸(20:5n-3,EPA)和二十二碳六烯酸(22:6n-3,DHA)不僅對細胞膜的流動性有著重要作用,還對卵巢的發(fā)育成熟,卵子的受精和孵化,甚至幼體的存活、生長和變態(tài),均具有重要的營養(yǎng)作用[5-8].

目前,已有研究報道野外捕撈擬穴青蟹在不同卵巢發(fā)育階段組織脂肪酸的組成特點[9-10],發(fā)現(xiàn)卵巢指數(shù)會隨著卵巢的發(fā)育成熟而顯著增加,相反,肝胰腺指數(shù)則顯著降低;肝胰腺和卵巢組織中的LC-PUFA含量也顯著升高,尤其是EPA和DHA.由于野外捕撈和池塘養(yǎng)殖的生存環(huán)境及所攝食的餌料組成不同,青蟹組織脂類及其脂肪酸的組成也會有所不同,因此,本研究擬系統(tǒng)分析池塘養(yǎng)殖的擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺和肌肉組織不同脂類的脂肪酸組成變化,以幫助我們更好地了解人工養(yǎng)殖擬穴青蟹卵巢發(fā)育時期的脂類及脂肪酸營養(yǎng)需求,為親蟹的培育和親蟹人工配合飼料的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 擬穴青蟹來源與樣品采集

2020年9至10 月從廣東省汕頭市牛田洋擬穴青蟹養(yǎng)殖示范區(qū)獲得卵巢發(fā)育處于不同時期的擬穴青蟹各6只,平均質(zhì)量(165.45±36.34)g.實驗蟹的日常投喂餌料主要為淡水螺絲、小毛蚶、短齒蛤等低值貝類.將青蟹麻醉后稱重,解剖采集所有的卵巢、肝胰腺和肌肉組織并稱重,分別計算青蟹的卵巢指數(shù)(GSI)和肝胰腺指數(shù)(HSI).解剖時參考Islam等[9]的方法將擬穴青蟹卵巢發(fā)育階段分為5個時期:Ⅰ期處于發(fā)育前期,卵巢呈半透明、薄而光滑;Ⅱ期是發(fā)育初期,此時卵巢呈白燭狀;Ⅲ期顏色轉(zhuǎn)淺黃則已進入卵黃發(fā)生初期;IV期卵巢體積逐漸增大,顏色轉(zhuǎn)為黃色,卵巢發(fā)育即將成熟,進入卵黃發(fā)生旺期;V期卵巢變?yōu)槌?橘紅色則發(fā)育至成熟期.組織樣品經(jīng)冷凍干燥后研磨粉碎密封保存于-20℃待測.具體公式如下:

1.2 總脂、中性脂、極性脂與脂肪酸組成檢測

按照Bligh和Dyer[11]介紹的總脂提取方法,稱取一定量組織冷凍干燥樣品,用氯仿/甲醇提取卵巢發(fā)育不同階段各組織的總脂.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥稱重后,轉(zhuǎn)移總脂至正相硅膠萃取小柱(SEP-PAK VAC PSA 6cc 500 mg,30/pk,美國Waters公司)內(nèi),后用氯仿和甲醇從總脂中分別洗脫中性脂和極性脂,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后稱重.然后根據(jù)Chen等[12]介紹的方法,將分離的極性脂和中性脂經(jīng)0.5 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液皂化至油滴消失后,加入14%的三氟化硼甲醇溶液,75℃甲酯化處理15 min,接著加入1 mL的飽和氯化鈉溶液和4 mL正己烷混合均勻靜置1 h,取上清經(jīng)0.22 μm針頭濾膜過濾至棕色上樣瓶中,充氮氣后密封上機檢測.

脂肪酸組成成分的檢測按照Chen等[12]介紹的儀器設(shè)定參數(shù)和程序,采用日本島津GC-17A氣相色譜儀進行測定.色譜柱為安捷倫的CP-Sil88氣相毛細管柱(60 m×0.25 mm,0.2 μm),用純度為99.999%的氮氣以1.0 mL/min的流速進行載氣.進樣口和檢測溫度為250℃,溶劑延長時間為4 min,進樣量為1 μL,進樣分流比為20∶1.升溫程序為:110℃保持3 min,以10℃/min的速度升至170℃保留10 min,然后以5℃/min的速度升至220℃并保持5 min.根據(jù)sigma公司的37種脂肪酸混標(biāo)進行脂肪酸種類的鑒定,采用峰面積歸一法進行定量分析,求得各脂肪酸的百分含量.

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(mean±SE)表示,使用SPSS 26.0軟件對實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,當(dāng)數(shù)據(jù)為百分數(shù)時則先進行反正弦函數(shù)轉(zhuǎn)換再處理,使用Tukey’s法進行多重比較,以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同卵巢發(fā)育時期卵巢指數(shù)和肝胰腺指數(shù)的變化

如圖1(a)所示,卵巢在Ⅱ期到Ⅴ期的發(fā)育過程中,卵巢指數(shù)不斷升高,在Ⅴ期高達16%,而肝胰腺指數(shù)在卵巢發(fā)育時期有所下降,但變化不明顯.

圖1 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺指數(shù)及不同組織總脂含量變化

2.2 不同卵巢發(fā)育時期肝胰腺、卵巢和肌肉的總脂含量

如圖1(b)所示,在不同卵巢發(fā)育時期,卵巢的總脂含量隨卵巢發(fā)育成熟而顯著增加(P<0.05),在Ⅴ期可達到約27%.而肝胰腺的總脂含量先增加,并在Ⅱ期達到最高,然后逐漸降低,且Ⅴ期的總脂含量顯著低于Ⅱ期的(P<0.05).肌肉的總脂含量較低(4%左右),并且在卵巢發(fā)育期間無顯著變化(P>0.05).

2.3 不同卵巢發(fā)育時期肝胰腺、卵巢和肌肉的極性脂和中性脂的變化

如圖2所示,肝胰腺中性脂的含量明顯高于極性脂,并且隨著卵巢的發(fā)育,中性脂含量逐漸升高至90%(Ⅴ期).卵巢在發(fā)育初期(Ⅱ期)的中性脂含量較高,隨著卵巢的發(fā)育,其含量顯著降低(P<0.05),并在卵巢發(fā)育后期與極性脂的含量基本相同,即約各占總脂的一半.肌肉的極性脂和中性脂在卵巢發(fā)育期間無顯著變化,且極性脂含量明顯高于中性脂,基本維持在總脂的80%左右.

圖2 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺和肌肉極性脂和中性脂含量變化

2.4 不同卵巢發(fā)育時期肝胰腺、卵巢和肌肉的脂類脂肪酸組成變化

由表1可知,卵巢極性脂脂肪酸主要為16:0、18:1n-9、ARA、EPA和DHA.其中,16:0、16:1n-9、16:1n-7和DHA的含量在卵巢發(fā)育后期顯著增加(P<0.05),而ARA和EPA的含量則顯著降低(P<0.05),且18:1n-9的含量也呈現(xiàn)下降的趨勢.隨著卵巢的發(fā)育成熟,n-6 PUFA的含量從20.30%大幅降低至10.73%.卵巢中性脂脂肪酸主要為16:0、18:0、16:1n-9、18:1n-9、ARA、EPA 和 DHA.在卵巢發(fā)育過程中,18:0、16:1n-7和ARA的含量顯著降低(P<0.05),而16:0、16:1n-9和DHA的含量顯著增加(P<0.05),EPA的含量則無顯著變化.此外,MUFA和n-3 PUFA的含量與卵巢發(fā)育呈現(xiàn)正相關(guān),而n-6 PUFA的含量在此過程中則急劇降低(15.13%→8.63%).極性脂中,PUFA的含量最高,而在中性脂中,SFA的含量則相對較高.

表1 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢組織極性脂和中性脂脂肪酸組成變化

由表2可知,在肝胰腺中,中性脂和極性脂脂肪酸主要都是16:0、18:0、16:1n-9和18:1n-9,ARA、EPA和DHA的含量較低且在卵巢發(fā)育的不同階段里沒有明顯變化.與卵巢不同,在肝胰腺中SFA的含量最高,MUFA次之,PUFA最少.

表2 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期肝胰腺組織極性脂和中性脂脂肪酸組成變化

由表3可知,在肌肉組織中脂肪酸主要都是 16:0、16:1n-9、18:0、18:1n-9、ARA、EPA和DHA.在卵巢發(fā)育時期,除了18:0、18:1n-9和ARA小幅度降低以及16:1n-9和DHA小幅度上升以外,其它主要脂肪酸沒有明顯變化.與卵巢極性脂相似的是,肌肉極性脂中PUFA的含量較高;但是在肌肉中中性脂SFA與PUFA的含量相近,且都大于MUFA的含量.

表3 擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期肌肉組織極性脂和中性脂脂肪酸組成變化

4 討論

4.1 不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺和肌肉的總脂、中性脂和極性脂含量的變化

在擬穴青蟹卵巢快速發(fā)育的過程中,卵巢指數(shù)和總脂含量大幅增加(7%—27%),而肝胰腺總脂的干重含量先增加后逐漸降低,說明此過程肝胰腺中的脂類至少存在部分向快速發(fā)育的卵巢轉(zhuǎn)移,而肌肉中的總脂含量較低且期間無明顯變化,脂類由肌肉轉(zhuǎn)移到卵巢的可能性極低.這一點已在其他十足目甲殼類動物卵巢發(fā)育過程中被證實了,即肝胰腺中富含脂類的卵黃蛋白原能被轉(zhuǎn)移到快速發(fā)育的卵巢中,為卵巢的發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)[13-14].此外,擬穴青蟹的肝胰腺總脂含量先增加后減少的現(xiàn)象,可能是因為在卵巢發(fā)育初期,青蟹攝食量增加,此時的卵巢發(fā)育尚不成熟,從肝胰腺轉(zhuǎn)移到卵巢的脂類有限,從外界獲取的大量脂類暫時儲存在肝胰腺中,造成肝胰腺總脂含量的暫時升高.這一結(jié)果與Wu等[10]和Tantikitti等[15]的在不同卵巢發(fā)育時期的野外捕撈擬穴青蟹肝胰腺總脂含量趨勢相似,但卻與鋸緣青蟹不同,鋸緣青蟹在卵巢發(fā)育這一階段,肝胰腺脂類代謝活動加強,將從食物中攝取的脂類物質(zhì)不斷的合成脂肪,并迅速轉(zhuǎn)移至正在發(fā)育的卵巢中[16],因此其卵巢脂類積累與肝胰腺總脂含量變化關(guān)系不大.

在擬穴青蟹卵巢快速發(fā)育時期,卵巢的極性脂(主要為磷脂)的含量有明顯的增加,由于甲殼動物合成磷脂的能力非常有限[17],在此階段擬穴青蟹卵巢磷脂的增加主要來源于外源性磷脂.而在卵巢發(fā)育成熟期,肝胰腺磷脂的含量明顯下降,說明卵巢磷脂的增加可能有部分是來源于肝胰腺的轉(zhuǎn)移.此外,肌肉組織在卵黃發(fā)生期中總脂含量、中性脂及極性脂變化均不明顯,表明肌肉組織可能在卵黃發(fā)育過程中的參與程度不大.

4.2 不同卵巢發(fā)育時期卵巢、肝胰腺和肌肉的脂肪酸組成的變化

在擬穴青蟹卵巢、肝胰腺和肌肉中,LC-PUFA的含量較高,且極性脂中LC-PUFA的含量都高于中性脂,不飽和脂肪酸的含量顯著高于飽和脂肪酸的含量,同時n-3 PUFA的含量一般高于n-6 PUFA,n-3/n-6的比值在1~3之間波動,這與在野外捕撈的擬穴青蟹[9-10]和鋸緣青蟹[17]上的研究結(jié)果相似,是海洋十足目甲殼類動物脂類脂肪酸的典型特征[18].

當(dāng)卵巢從初期發(fā)育至卵黃發(fā)生期時,卵巢極性脂和中性脂的ARA含量均顯著降低.ARA是前列腺素和其他類二十烷酸的合成前體,而前列腺素不僅參與機體的生殖、呼吸和消化等生理活動,還可抑制脂質(zhì)的分解[19].因此,卵巢在Ⅱ期時高含量的ARA可能抑制脂肪的分解利用,促進脂肪在卵巢中的積累,而在Ⅲ期后,卵巢發(fā)育及卵子的形成需要較多能量,此時脂質(zhì)的分解利用開始加強,ARA的含量顯著低于Ⅱ期時的含量,并逐漸趨于穩(wěn)定.積累在卵巢中的PUFA含量顯著高于肝胰腺,表明PUFA尤其是DHA、EPA和ARA對于擬穴青蟹卵巢發(fā)育有著十分重要的作用.已有實驗證明,PUFA能促進甲殼類動物卵巢的發(fā)育、產(chǎn)卵和卵的孵化[6-7].在鋸緣青蟹[16]和中華絨螯蟹[20]的研究中發(fā)現(xiàn),流產(chǎn)蟹肝胰腺中EPA和DHA的含量明顯高于抱卵蟹,說明可能是流產(chǎn)蟹肝胰腺中的PUFA尤其是EPA和DHA沒有及時轉(zhuǎn)移到卵巢中,導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良,引起流產(chǎn).Wen等[21]對中華絨螯蟹卵巢發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn),LC-PUFA能顯著提高親蟹的產(chǎn)卵量和孵化率.若缺乏EPA和DHA則會顯著影響中華絨螯蟹的生殖性能以及幼體質(zhì)量.因此,在卵巢的快速發(fā)育時期,EPA和DHA等LC-PUFA在卵巢中的積累,不僅促進擬穴青蟹卵巢的發(fā)育成熟,也可為卵子的受精與孵化提供必需的營養(yǎng).

在擬穴青蟹的卵巢和肝胰腺的脂肪酸組成中,16:0、18:0和18:1n-9是主要成分,這些脂肪酸正是擬穴青蟹卵巢發(fā)育的主要能量來源.特別是在肝胰腺組織中,包括16:0和18:0在內(nèi)的SFA含量很高,是PUFA含量的2~3倍,高含量的SFA是肝胰腺的脂類儲存能量的主要形式.肌肉和卵巢的主要脂肪酸都是LC-PUFA,肌肉中的LC-PUFA含量比卵巢的高,且主要是ARA、EPA和DHA.與卵巢組織一樣,高含量的LC-PUFA是肌肉細胞代謝活動的基礎(chǔ),而且n-3 LC-PUFA含量的提高有利于提高甲殼動物的滲透壓調(diào)節(jié)能力[22],這可能是肌肉中LC-PUFA含量較高的重要原因之一.

本研究分析了人工池塘養(yǎng)殖擬穴青蟹不同卵巢發(fā)育時期中卵巢、肝胰腺和肌肉脂類含量及其脂肪酸組成的變化,為進一步了解養(yǎng)殖擬穴青蟹過程中卵巢發(fā)育時期對脂類和脂肪酸的營養(yǎng)需求提供了參考資料,為擬穴青蟹膏蟹的培育及其人工配合飼料的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù).

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