邱 方， 王 嬋， 張明明， 史興娟， 劉向東

1 南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 檢驗科， 南京 210031； 2 揚州大學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院， 江蘇 揚州 225009；3 東南大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 南京 210096

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種慢性進行性肝內(nèi)膽汁淤積的自身免疫性疾病，常見抗線粒體抗體M2亞型(AMA-M2)陽性，血清生化指標(biāo)ALP或/和GGT等異常升高。PBC是最早確定自身抗體靶抗原的自身免疫性疾病之一，其組織特異性和易于確診的特點，決定PBC是研究者理解人類免疫調(diào)節(jié)的一個重要模型。PBC病因至今尚未明確，通常認為是環(huán)境因素和遺傳因素交互作用的結(jié)果。PBC家系的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PBC患者兄弟姐妹相對風(fēng)險率(λs)高達10.5，同卵雙胞胎PBC發(fā)病一致率高達0.63，并且發(fā)病年齡較一致，表明遺傳因素在PBC的發(fā)病進程中起著重要作用[1]。幾十年來，PBC遺傳學(xué)研究經(jīng)歷了小規(guī)模的家系研究、候選基因研究、全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)等階段。繼2017年本研究團隊發(fā)表漢族人群PBC的GWAS分析結(jié)果后，全球主要人種的PBC GWAS分析已基本完成[2-5]。近幾年，多種群全基因組Meta分析進一步發(fā)現(xiàn)，一些PBC易感的相關(guān)位點，尤其是針對X染色體的Meta分析，挖掘出多個新的PBC易感基因，對闡明PBC的發(fā)病機制提供了重要線索[6-9]。后期GWAS分析將主要針對PBC的不同臨床亞型、藥物應(yīng)答以及對系列GWAS數(shù)據(jù)的精細挖掘，包括藥物開發(fā)和轉(zhuǎn)錄、蛋白、代謝等多組學(xué)整合研究。

1 PBC易感性的GWAS研究

GWAS在全基因組水平上對數(shù)十萬到數(shù)百萬個多態(tài)位點(SNP)進行分析，是研究復(fù)雜疾病和性狀遺傳易感性的一種有效手段。2009年起，多國學(xué)者相繼發(fā)表了PBC的GWAS研究結(jié)果，所有的研究均表明HLA Ⅱ類基因，尤其是DRB1、DQA1、DQB1基因位點與PBC遺傳易感性關(guān)聯(lián)最強[2-5]。歐美團隊研究[10-12]表明，采用GWA數(shù)據(jù)推演的等位基因關(guān)聯(lián)信號主要位于DRB1，包括DRB1*08、DRB1*11、DRB1*13和DRB1*14等。不同于歐美人群中DRB1*08∶01與PBC的強關(guān)聯(lián)性，漢族人群基本沒有等位基因DRB1*08∶01，而DRB1*08∶03與PBC緊密關(guān)聯(lián)。此外，DPB1*17∶01是中國漢族人群PBC中又一獨立關(guān)聯(lián)位點[13-14]。但相比于其他自身免疫性疾病，PBC患者的HLA關(guān)聯(lián)性相對較弱，70%～80%的PBC患者并未攜帶HLA區(qū)域主要的PBC易感基因[14]，這也意味著非HLA區(qū)域基因可能在PBC的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)了近50個非HLA區(qū)域的PBC易感基因位點，多為免疫調(diào)節(jié)因子和免疫調(diào)控信號通路相關(guān)的因子，提示HLA基因和非HLA基因協(xié)同參與PBC的疾病進程。GWAS研究結(jié)果揭示包括JAK-STAT、IL12-IL12R、NF-κB、TLR/TNFα、IL21-IL21R和CCL20-CCR6等多個免疫調(diào)節(jié)通路與PBC的發(fā)病相關(guān)。

GAWS研究結(jié)果顯示不同種群PBC的易感基因及位點會有所差異。在歐美白人中發(fā)現(xiàn)的22個非HLA區(qū)域PBC易感基因中分別有10個和5個在中國漢族人和日本人中被證實。值得關(guān)注的是，被認為與PBC發(fā)病有密切聯(lián)系的IL12A在歐美白人和中國漢族人群均有很強關(guān)聯(lián)性，但在日本人中并無顯著性，而漢族人群與歐美白人IL12A的易感位點并不相同。日本人的兩次PBC GWAS研究發(fā)現(xiàn)的3個新的PBC易感基因中POU2AF1僅在日本人中有顯著性，而TNFSF15和IKZF3在中國漢族人群中被同樣證實是PBC的易感基因[2-5,15]。筆者對中國漢族人群的PBC GWAS研究發(fā)現(xiàn)了包括IL21R、IL21、CD58、ARID3A、CD28-CTLA4-ICOS、IL16在內(nèi)的6個新的PBC易感基因，研究還顯示中國漢族人群易感性最強的HLA基因和非HLA基因位點分別位于DRA內(nèi)含子-1的rs9268644位點和TNFSF15-TNFSF8的rs4979467位點[2]。

2 PBC易感性的后GWAS研究

由于多數(shù)PBC患者出現(xiàn)臨床癥狀較晚，多代家系樣本較難收集，因此通過大規(guī)模家系樣本進行PBC的連鎖不平衡分析的難度較大。Wang等[16]近期發(fā)表了對30個PBC核心家系的全外顯子組測序分析，未發(fā)現(xiàn)在GWAS找出的易感基因中存在嚴(yán)重的新生突變(de novo mutation)，這一結(jié)果表明PBC的遺傳易感性主要反映在群體中常見多態(tài)位點相互作用，共同影響個體的免疫穩(wěn)態(tài)的失衡。對近50個PBC易感位點或基因的精細定位和功能SNP的鑒定是目前PBC遺傳學(xué)研究的重點之一。通過對易感基因功能SNP的分析鑒定，確定功能SNP的調(diào)控機制，對研究PBC發(fā)病機制有重要的提示作用。目前發(fā)現(xiàn)的PBC易感基因TNFSF15、IRF5、IRF8、TYK2、MMEL1-TNFRSF14、IL7R、IL12B、TNFAIP3和IKZF3-ORMDL3等的關(guān)聯(lián)SNP，與其他自身免疫性疾病發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)SNP是一致的，說明不同自身免疫疾病的易感性存在共性。同時在自身免疫性疾病的共同易感基因中，也存在功能SNP的差異。CD28-CTLA4-ICOS位點的SNP與T2D、RA、PSC、MS和PBC等易感性相關(guān)，但在這一區(qū)域，PBC的關(guān)聯(lián)SNP與其他疾病的關(guān)聯(lián)SNP沒有連鎖關(guān)系，說明CD28-CTLA4-ICOS位點參與PBC發(fā)病的作用機制有其特異性[2]。在目前發(fā)現(xiàn)的易感基因中，IL21、 IL21R、IL16和ARID3A等不僅表現(xiàn)出種族的特異性，也表現(xiàn)出PBC的疾病特異性，針對這些位點的功能SNP的分析，有助于探討PBC特異的發(fā)病機制。

盡管GWAS研究發(fā)現(xiàn)了大量與PBC相關(guān)的基因變異，但是還沒有直接證據(jù)顯示這些基因變異影響PBC的病理進程。由于對復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解尚不完善，因此也導(dǎo)致對GWAS結(jié)果的解讀存在一定困難。因此，在未來很長一段時間里，研究者面臨的一個重大挑戰(zhàn)是如何將免疫遺傳學(xué)與免疫表型聯(lián)接，闡明PBC易感性相關(guān)的免疫調(diào)控分子在其發(fā)病及病理進程中的作用。目前基于GWAS研究取得的數(shù)據(jù)，一些具有PBC典型血清學(xué)、生化和組織學(xué)特征的基因敲除動物模式如IL12 p35-/-、IL12 p19-/-和dnTGFBRII小鼠模型被建立，并在PBC的免疫病理機制研究方面取得很有價值的成果[13]。

3 PBC特定亞型和表征的GWAS研究

與其他自身免疫疾病相比，PBC表現(xiàn)出疾病的組織特異性，但其臨床表癥也表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。PBC患者在發(fā)病年齡、起病表癥、疾病進程和治療效果等方面均存在很大的個體差異。目前95%以上的PBC患者AMA-M2陽性，在<5%的AMA-M2陰性的PBC中，可能有部分患者是AMA弱陽性，或僅識別目前AMA-M2抗原中被掩蓋了的表位，或完全是AMA陰性。對AMA完全陰性的患者，PBC的發(fā)病機制與陽性患者可能是完全不同的，但目前要收集到大量的AMA完全陰性的患者進行GWAS分析，有很大的難度，需要從數(shù)十萬的PBC患者中加以甄別，要完成這樣的分析，需要大規(guī)模的協(xié)作。除AMA-M2外，PBC患者還出現(xiàn)PBC特異的抗核抗體，主要是抗gp210抗體和抗sp100抗體，二者的陽性率分別為30%～40%和20%～35%?？筭p210抗體僅識別gp210的C末端突出到細胞質(zhì)的部分，目前尚不確定抗gp210抗體是否僅識別單一表位?？箂p100抗體識別多個抗原表位，包括線性和構(gòu)象表位。Wang等[17]對抗sp100抗體陽性組和陰性組的GWAS隊列分析發(fā)現(xiàn)，MHC區(qū)域的rs1794280和rs492899位點與抗sp100抗體相關(guān)聯(lián)，并鑒定出HLA DRβ1-Asn77/Arg74、DRβ1-Ser37、DPβ1-Lys65是決定抗sp100抗體產(chǎn)生的關(guān)鍵位點，該結(jié)果揭示抗sp100抗體具有強烈的遺傳傾向，其產(chǎn)生與HLA分子對sp100表位的呈遞密切相關(guān)，提示分子模擬可能是抗sp100抗體產(chǎn)生的原因。但對抗gp210抗體陽性組和陰性組的GWAS隊列分析未發(fā)現(xiàn)任何顯著的SNP位點。目前抗gp210抗體是如何產(chǎn)生的尚不清楚，但抗gp210抗體陽性患者在臨床表征和熊去氧膽酸(UDCA)治療的應(yīng)答存在明顯的異質(zhì)性，進一步研究抗gp210抗體的產(chǎn)生機制對PBC的有效治療有著重要的意義。

PBC患者在AMA抗體產(chǎn)生、發(fā)病年齡、發(fā)病表征、無藥物干預(yù)的疾病進展，UDCA治療的藥物應(yīng)答等方面存在明顯的異質(zhì)性和個體差異，針對這一系列異質(zhì)性的GWAS分析有助于了解PBC的發(fā)病機制和個性化的治療。這類研究工作需要建立在大規(guī)模臨床樣品和正確、可靠的臨床信息的收集和整理的基礎(chǔ)上，目前針對特定PBC亞型的分析已在國內(nèi)外的部分實驗室展開。

4 基于GWAS數(shù)據(jù)的藥物開發(fā)

GWAS研究結(jié)果揭示了多個與PBC的發(fā)病機制密切相關(guān)的信號通路，為治療PBC藥物研發(fā)提供了新的思路和潛在的靶點。單克隆抗體優(yōu)特克諾(ustekinumab)的靶向位點是IL12/23 p40亞單位，可作用于IL12/Th1和IL23/Th17通路，但在一項對UDCA治療生化應(yīng)答不良的PBC患者應(yīng)用優(yōu)特克諾治療的臨床試驗中，沒有患者在Ⅱ期臨床試驗中達到預(yù)定主要生化應(yīng)答終點[18]。PBC患者激活的T淋巴細胞靶向針對肝內(nèi)膽管，用CTLA-4抗體阻斷CD80/CD86可能具有治療作用。阿巴西普(abatacept)是CTLA4分子的細胞外功能區(qū)，與人IgG的Fc段結(jié)合而成的可溶性融合蛋白，但目前臨床試驗采用阿巴西普聯(lián)合UDCA治療UDCA應(yīng)答不良的患者，發(fā)現(xiàn)阿巴西普聯(lián)合UDCA治療并不能改善生化應(yīng)答和臨床療效[19]。在PBC的易感基因中，與TNFα信號通路相關(guān)的有TNFRSF1A、DENND15、TNFAIP2，目前已證實TNFα抑制劑在克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中有明顯的療效，但是否對UDCA治療效果不佳的PBC患者具有療效尚不明確。利妥昔單抗(rituximab)是B淋巴細胞表面分子CD20的嵌合型抗體，初步臨床試驗已證實利妥昔單抗可以明顯降低UDCA無應(yīng)答PBC患者體內(nèi)的自身抗體水平，但對PBC的療效非常有限[20]。Moritoki等[21]認為可能的原因是患者出現(xiàn)針對利妥昔單抗的抗體(anti-drug antibodies，ADA)和研究中納入的UDCA療效不佳(難治型)的PBC患者比例較高。鑒于此，Moritoki等[21]通過小鼠PBC模型發(fā)現(xiàn)，抗CD20抗體治療需要在PBC發(fā)病的早期進行，才能廣泛抑制PBC的效應(yīng)通路，但對產(chǎn)生ADA的小鼠，治療效果有限。Cordell等[9]基于PBC的GWAS數(shù)據(jù)的分析結(jié)合計算機生物學(xué)技術(shù)的藥效分析，建議將多個針對GWAS靶向基因或位點的單克隆抗體或小分子藥物作為潛在的PBC治療藥物。期待后期的動物實驗和臨床測試能夠為PBC的治療提供更多的手段。

綜上所述，盡管PBC的遺傳學(xué)已取得豐碩的成果，但與多數(shù)復(fù)雜性疾病遺傳學(xué)研究面臨一樣的困境，即不能有效地解析遺傳變異如何調(diào)控效應(yīng)蛋白表達，效應(yīng)蛋白分子又如何對細胞、組織產(chǎn)生影響，進而導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來基于GWAS結(jié)果，開發(fā)的多個針對PBC治療單抗藥物臨床試驗結(jié)果均不理想，可能是目前困境的具體表現(xiàn)。隨著多組學(xué)整合研究的深入，單細胞測序和代謝分析等研究手段的發(fā)展和普及，必然將PBC的遺傳易感性跟分子病理機制緊密聯(lián)接，為PBC的遺傳學(xué)研究開拓新的局面。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：邱方、王嬋、張明明負責(zé)完成初稿撰寫；史興娟負責(zé)初稿的修訂；劉向東負責(zé)文章的思路、審核及定稿。