張 堯， 張 鍇， 康鵬東， 馬 超

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽胰外科， 鄭州 450008

胰腺癌是一種侵襲性高、死亡率高的惡性腫瘤。由于早期確診難、侵襲轉(zhuǎn)移早、放化療抵抗及缺乏有效的靶向治療方案，預(yù)后較差[1]。因此，胰腺癌治療的研究探索中，尋找可靠的生物標(biāo)志物和分子靶標(biāo)至關(guān)重要。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，微小RNA(miRNA，miR)逐漸成為研究熱點(diǎn)，為胰腺癌研究提供新思路和方向[2]。

miRNA是一種廣泛參與機(jī)體多種生物學(xué)功能的非編碼RNA，主要與靶RNA的3′端非翻譯區(qū)(untranslated regin，UTR)結(jié)合，導(dǎo)致靶RNA的降解或翻譯終止[3]。研究[4]證實(shí)，多種miRNA在腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，并影響腫瘤的生物學(xué)行為。其中，miR-200家族與腫瘤的關(guān)系是近年來的研究重點(diǎn)[5]，目前相關(guān)研究[6-7]表明，miR-200c與胰腺癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等諸多方面有密切關(guān)系。本文即對miR-200c在胰腺癌中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miR-200c概述及在胰腺癌中的表達(dá)情況

miR-200家族由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-419組成。其中miR-200c、miR-141位于染色體12p13.31，其余位于染色體1p36.33[5]。有研究[8]表明，miR-200c作為抑癌基因，在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種癌癥中發(fā)揮作用，且通常經(jīng)由阻斷癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)而表現(xiàn)出抑癌行為。在不同腫瘤細(xì)胞系及組織中，miR-200c的表達(dá)并不完全相同。

1.1 在胰腺癌組織中的表達(dá) miR-200c已被證實(shí)在肺癌[9]、卵巢癌[10]、肝癌等多種癌組織中低表達(dá)。Ali等[11]應(yīng)用細(xì)針穿刺活檢術(shù)抽取29例胰腺癌組織及15例正常胰腺組織，應(yīng)用微陣列數(shù)據(jù)分析檢測發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中超過228個miRNA存在異常，對前7個miRNA應(yīng)用實(shí)時定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)大部分胰腺癌組織中l(wèi)et-7c、let-7f和miR-200c表達(dá)降低，所有胰腺癌組織中miR-486-5p和miR-451表達(dá)顯著升高，let-7d和miR-423-5p表達(dá)具備個體化差異。

Pan等[12]應(yīng)用qRT-PCR 對胰腺癌組織及癌旁組織中的miR-200c表達(dá)進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，miR-200c在胰腺癌組織中表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。為進(jìn)一步探索miR-200c表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，其應(yīng)用時間飛行質(zhì)譜技術(shù)對miR-200c啟動子甲基化水平進(jìn)行定量測定，結(jié)果顯示miR-200c啟動子高甲基化，且其甲基化水平與miR-200c表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性。應(yīng)用DNA去甲基化劑5-Aza-dC處理胰腺癌細(xì)胞后，miR-200c啟動子甲基化水平降低，miR-200c表達(dá)恢復(fù)。在胰腺癌中，miR-200c低表達(dá)，且其表達(dá)的下調(diào)與啟動子的高甲基化有關(guān)。

1.2 在胰腺癌干細(xì)胞中的表達(dá) 胰腺癌干細(xì)胞具有自我更新的能力，可能是胰腺癌發(fā)生發(fā)展的啟動因子，影響胰腺癌的耐藥和轉(zhuǎn)移[13]。Ma等[14]以CD24+CD44+ESA+作為標(biāo)志物在人胰腺癌細(xì)胞株(PANC-1)中分選出胰腺癌干細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RFQ-PCR)法檢測miR-200c表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-200c在胰腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于PANC-1。轉(zhuǎn)染miR-200c前體片段至胰腺癌干細(xì)胞中，高表達(dá)miR-200c后，胰腺癌干細(xì)胞體外侵襲能力明顯降低。miR-200c胰腺癌干細(xì)胞中低表達(dá)并可抑制胰腺癌干細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 在血清中的表達(dá) 循環(huán)miRNA正在成為一種有用的工具，用于各種癌癥的非侵入性診斷和預(yù)后評估，Gablo等[15]前瞻性納入112例計劃進(jìn)行手術(shù)切除的胰腺癌患者，把總生存期(OS)<16個月的患者歸類為預(yù)后不良，OS>20個月患者歸類為預(yù)后良好，qRT-PCR法檢測術(shù)前血漿標(biāo)本中miRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，多種miRNA在預(yù)后不良與預(yù)后良好病例的血漿樣本中存在差異化表達(dá)，其中，預(yù)后不良病例的血漿樣本中，miR-200c顯著高表達(dá)。miR-200c在血清中的差異化表達(dá)，提示其在胰腺癌的診斷和預(yù)后預(yù)測中具備巨大潛能和廣闊應(yīng)用前景。

2 miR-200c與胰腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移

EMT使有極性的上皮細(xì)胞經(jīng)過一系列變化失去細(xì)胞間聯(lián)系轉(zhuǎn)化為無極性的間質(zhì)細(xì)胞，從而獲得侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，是腫瘤早期轉(zhuǎn)移的重要步驟[16]。EMT過程中伴隨多種細(xì)胞分子標(biāo)志物改變，包括細(xì)胞黏附蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和γ-連環(huán)蛋白等的表達(dá)下調(diào)，而間葉細(xì)胞的標(biāo)記分子如纖維連接蛋白、波形蛋白(vimentin)和N-鈣黏蛋白等的表達(dá)上調(diào)，其中E-cadherin的丟失為EMT的重要特點(diǎn)[17]。EMT在腫瘤及腫瘤干細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[18-20]。多項(xiàng)研究[21-22]表明，miR-200c可通過抑制EMT進(jìn)程發(fā)揮抑癌基因作用。

胰腺癌中，miR-200c同樣參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程，Burk等[23]過表達(dá)胰腺癌細(xì)胞中miR-200c后，E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-200c抑制劑沉默其表達(dá)后，E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)。說明miR-200c直接調(diào)節(jié)E-cadherin來調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT。進(jìn)一步研究[24]證實(shí)，miR-200c可直接靶向作用于E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子：ZEB1/2，SNAI1/2，Twist1/2以及EMT激活劑TGFβ來抑制EMT進(jìn)程。同時，ZEB1也反過來抑制miR-200c表達(dá)[25]，miR-200c和ZEB1的相互抑制形成了一個雙向負(fù)反饋回路[26]共同調(diào)節(jié)腫瘤的遷徙和轉(zhuǎn)移。靶向ZEB1-miR-200c負(fù)反饋通路有望成為治療胰腺癌的基礎(chǔ)[27]。近年來隨著腫瘤干細(xì)胞研究進(jìn)展，有研究[28]發(fā)現(xiàn)，miR-200c也參與了胰腺癌干細(xì)胞EMT過程的調(diào)控，轉(zhuǎn)染前體物質(zhì)使胰腺癌干細(xì)胞中miR-200c高表達(dá)后，胰腺癌干細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，vimentin、ZEB1表達(dá)明顯下調(diào)，Transwell遷徙實(shí)驗(yàn)證實(shí)高表達(dá)miR-200c后，胰腺癌干細(xì)胞侵襲能力較前降低。

此外，除了調(diào)節(jié)EMT蛋白，miR-200c還影響胰腺癌細(xì)胞表面黏蛋白的表達(dá)。miR-200c直接靶向胰腺癌細(xì)胞中的黏蛋白4(MUC4)和黏蛋白16(MUC16)的mRNA來抑制MUC4、MUC16蛋白的表達(dá)[29]，從而逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲。miR-200c還通過其他通路調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。Huang等[30]應(yīng)用TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測出Notch1是miR-200c的作用靶點(diǎn)，而Notch1被證實(shí)參與了胰腺的胚胎發(fā)育與分化[31]，在胰腺癌中起重要作用。轉(zhuǎn)染miR-200c使其在胰腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)后，Notch1免疫熒光強(qiáng)度降低，胰腺癌干細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性和轉(zhuǎn)移潛能被抑制。miR-200c作用于Notch1的3′UTR，下調(diào)其mRNA及蛋白的表達(dá)。

也有研究[32]指出，miR-200c是轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(matastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)的直接靶點(diǎn)。Zhuo等[33]應(yīng)用qRT-PCR檢測胰腺癌組織中MALAT1和miR-200c的表達(dá)，轉(zhuǎn)染MALAT-1使其高表達(dá)后，胰腺癌組織中miR-200c表達(dá)較前明顯降低，同樣，miR-200c高表達(dá)后，MALAT-1表達(dá)明顯降低。二者表達(dá)相互抑制，可能形成一個新的反饋回路。進(jìn)一步分析表明，胰腺癌組織中MALAT-1與ZEB1的表達(dá)呈正相關(guān)，miR-200c與MALAT-1、ZEB1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這一方面是因?yàn)镸ALAT-1可以作為競爭性內(nèi)源性RNA抑制miR-200c的表達(dá)，另一方面因?yàn)閙iR-200c與靶RNA的3′UTR結(jié)合，沉默靶基因抑制MALAT-1表達(dá)。Transwell遷徙實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MALAT-1促進(jìn)胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移，miR-200c則起抑制作用，當(dāng)同時沉默MALAT-1和miR-200c時，對比單獨(dú)沉默MALAT-1，腫瘤細(xì)胞侵襲性升高，miR-200c的抑制部分逆轉(zhuǎn)了侵襲性降低。

3 miR-200c與胰腺癌診斷及預(yù)后

胰腺癌因早期癥狀不典型、缺乏特異性診斷標(biāo)志物從而難以實(shí)現(xiàn)早期診斷，進(jìn)而導(dǎo)致預(yù)后不佳。如何提高胰腺癌高危人群早期篩查確診率一直是臨床工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，雖然miR-200c等因子在胰腺癌患者血清中的表達(dá)變化已有相關(guān)研究報道，提示與患者預(yù)后相關(guān)，但miR-200c在胰腺癌中的診斷價值仍需進(jìn)一步大樣本研究。miR-200c等因子與血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測，多指標(biāo)共同診斷或能提高胰腺癌的診斷準(zhǔn)確度。

miR-200c在胰腺癌組織中及患者血清中的表達(dá)均提示與預(yù)后相關(guān)。Soubani等[34]從99例施行胰十二指腸切除術(shù)的患者中獲得胰腺癌組織，qRT-PCR法檢測miR-200c表達(dá)并分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析其與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR-200c的低表達(dá)與胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、血管浸潤(陰性或陽性)顯著相關(guān)；高表達(dá)miR-200c組OS更長。一項(xiàng)關(guān)于miRNA與胰腺癌預(yù)后的Meta分析顯示[35]，miR-200c低表達(dá)患者生存期明顯縮短，提示miR-200c低表達(dá)是手術(shù)切除后患者預(yù)后不良的重要預(yù)測。Gablo等[15]的前瞻性臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-200c的表達(dá)與患者OS相關(guān)，提示血漿中miR-200c可能作為生物標(biāo)志物來監(jiān)測腫瘤動態(tài)和預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后。因此，組織miR-200c的低表達(dá)一定程度上可以提示癌癥患者的不良預(yù)后，然而，晚期癌癥患者中，循環(huán)miR-200c的高表達(dá)則提示患者的預(yù)后不良。

4 miR-200c與胰腺癌治療

miR-200c與化療耐藥密切相關(guān)，Li等[36]將胰腺癌細(xì)胞分為吉西他濱敏感和吉西他濱耐藥，檢測兩組胰腺癌細(xì)胞中miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)吉西他濱耐藥細(xì)胞中miR-200b、miR-200c、let-7b、let-7c、let-7d和let-7e的表達(dá)顯著下調(diào)，而E-cadherin、vimentin、ZEB1等蛋白高表達(dá)。研究[37]發(fā)現(xiàn)，ZEB1和其他EMT調(diào)控因子可能維持人胰腺癌細(xì)胞的耐藥，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-200c靶向沉默ZEB1，不僅上調(diào)了E-cadherin的表達(dá)，還增加了其他上皮標(biāo)志物，如EVA1和MAL2的表達(dá)，恢復(fù)了胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑等藥物的敏感性。探索miRNA與胰腺癌傳統(tǒng)治療的相互關(guān)系，可以為胰腺癌的治療打開新的突破口。miRNA與化療藥物的聯(lián)合治療也是一個潛在的、有前景的研究方向，既可以利用miRNA的優(yōu)勢靶向多個信號通路，又可以發(fā)揮抗癌藥物的細(xì)胞毒性作用、減少胰腺癌細(xì)胞的化療耐藥性[38-39]。

隨著技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，許多臨床研究開始探索miRNA在臨床治療中的應(yīng)用。miRNA應(yīng)用于腫瘤治療，主要依靠直接或間接下調(diào)原癌miRNA的表達(dá)或上調(diào)抑癌miRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[2]。治療性miRNA必須通過多重生物屏障，包括全身血液環(huán)境、腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞微環(huán)境等[40]，靶向調(diào)節(jié)目標(biāo)miRNA的表達(dá)。在這個過程中，為提高miRNA的生物穩(wěn)定性和靶向治療性，常借助脂質(zhì)載體、細(xì)胞外囊泡、miR-納米顆粒結(jié)合物、miR海綿等各種運(yùn)載工具[41]。抑癌性miRNA如miR-200c再表達(dá)具有廣泛的應(yīng)用前景和臨床意義，但需要進(jìn)一步研究相應(yīng)的模擬劑和發(fā)現(xiàn)更有效的運(yùn)載系統(tǒng)，從而得以應(yīng)用于臨床治療。

5 小結(jié)與展望

近年來，胰腺癌發(fā)病率呈不斷攀升趨勢，對于胰腺癌的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療的研究仍未取得突破性進(jìn)展。miRNA作為備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)，已經(jīng)證實(shí)在多種腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中起到相關(guān)作用。miR-200c在胰腺癌中發(fā)揮著抑癌基因作用，通過靶向調(diào)控下游基因及調(diào)控相關(guān)信號通路來抑制胰腺癌的浸潤與轉(zhuǎn)移，并可作為評估預(yù)后的有效分子標(biāo)志物，輔助臨床診斷。

隨著技術(shù)手段的不斷提高，對miRNA的研究也逐漸從基礎(chǔ)方向至臨床應(yīng)用方向轉(zhuǎn)化，越來越多的研究關(guān)注到非病毒載體介導(dǎo)的miRNA運(yùn)載在胰腺癌治療中的應(yīng)用。但是，miR-200c是否可以作為腫瘤治療劑仍需進(jìn)一步體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)證實(shí)。miR-200c與傳統(tǒng)腫瘤治療手段的關(guān)系及與其他miRNA間的相互作用關(guān)系或成為下一步臨床研究的重點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張堯負(fù)責(zé)文獻(xiàn)整理，撰寫論文；張鍇、康鵬東參與查閱文獻(xiàn)，修改論文；馬超負(fù)責(zé)擬定寫作方向，指導(dǎo)撰寫文章并最終定稿。