●高 珊（遼源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 吉林 遼源 136200）

近年來(lái)，越來(lái)越多的新技術(shù)被應(yīng)用在農(nóng)作物遺傳改良種，這些技術(shù)推動(dòng)了新品種的研發(fā)，加快了品種改良的進(jìn)程，同時(shí)提高了改良的目的性?；蚓庉嬀褪瞧渲袘?yīng)用前景最為廣泛的技術(shù)之一，是通過(guò)序列特異性核酸酶進(jìn)行精確定位，對(duì)目的基因片段進(jìn)行插入或剪切新基因片段使基因沉默或同源重組，從而讓目的性狀得到表達(dá)。

1 基因編輯技術(shù)

1.1 鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）

該項(xiàng)技術(shù)是第1代基因組編輯技術(shù)。每個(gè)ZFN單體都是由FokⅠ核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域融合鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域而成。鋅指蛋白決定鋅指核酸酶的特異性。

1.2 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）

這項(xiàng)技術(shù)已逐步替代ZFN技術(shù)，TALEN能特異性識(shí)別靶標(biāo)DNA序列，具有較強(qiáng)的設(shè)計(jì)性，比ZFN技術(shù)具有更好的應(yīng)用潛力。

1.3 規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（CRISPR/Cas）

規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（CRISPR/Cas）系統(tǒng)是古細(xì)菌和細(xì)菌在抵御外來(lái)病毒和質(zhì)粒過(guò)程中產(chǎn)生的特異性免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因座由反式激活RNA基因、Cas家族蛋白和CRISPR序列3部分組成。因其具有簡(jiǎn)單、快速、高效等特點(diǎn)，已被應(yīng)用于艾滋病、阿爾茲海默病等疾病的治療中。

鋅指核酸酶系統(tǒng)由可以特異性識(shí)別DNA雙鏈的鋅指結(jié)構(gòu)域和FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域兩部分構(gòu)成，因其核酸酶設(shè)計(jì)復(fù)雜、特異性較差、易脫靶逐漸被取代。

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶系統(tǒng)是由TALEN效應(yīng)蛋白的DNA結(jié)合域和FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域兩部分組成，其特異性得到了一定的改善，但是由于所用載體太大，仍然沒(méi)有得到很好的應(yīng)用。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列系統(tǒng)由CRISPR序列元件和Cas基因家族組成。

CRISPR/Cas系 統(tǒng) 有3種 類 型，TypeⅠ 和TypeⅢ系統(tǒng)存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，TypeⅡ系統(tǒng)僅存在于細(xì)菌中，其中Ⅱ型只需要1個(gè)Cas蛋白就可以完成對(duì)靶位點(diǎn)的切割，而Ⅰ型和Ⅲ型都需要多個(gè)Cas蛋白才能完成對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)的切割。因此Ⅱ型系統(tǒng)已成為最常用的基因編輯系統(tǒng)。2013年Cong等[1]首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)人類及小鼠細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)基因敲除。此后，該技術(shù)逐漸應(yīng)用于果蠅、斑馬魚(yú)、擬南芥、水稻、小麥、玉米的體外培養(yǎng)細(xì)胞中。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的工作機(jī)理

CRISPR/Cas工作機(jī)理可分為3個(gè)階段，主要是適應(yīng)、表達(dá)和干擾，第一階段是新的間隔序列的獲得，第二階段是這些新獲得的間隔重復(fù)序列被轉(zhuǎn)錄為前體CRISPR RNA（Pre-crRNA）。然后在核酸內(nèi)切酶的作用下形成成熟的crRNA[2-3]，第三階段是crRNA與tracrRNA的復(fù)合物在Cas蛋白的作用下切割外源DNA。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在作物育種中的應(yīng)用

3.1 在水稻育種中的應(yīng)用

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，并因其遺傳轉(zhuǎn)化更易操作，已成為重要的模式植物。因此，近年來(lái)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻品質(zhì)、產(chǎn)量及抗性相關(guān)的研究被廣泛報(bào)道。Zhou等[4]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)讓水稻溫敏型雄性不育基因TMS5發(fā)生特異性突變，從而開(kāi)發(fā)出11個(gè)無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的改良TGMS品系，其具有巨大育種潛力。Shen等[5]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯粒型基因GS3和穗粒數(shù)基因Gnla，導(dǎo)致基因突變失活，以此獲得粒長(zhǎng)、穗粒數(shù)多的株系，但其產(chǎn)量顯著下降。Miao等[6]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻分蘗基因LAZY1進(jìn)行編輯，使其發(fā)生雙等位變異，研究發(fā)現(xiàn)T1代轉(zhuǎn)基因幼苗的分蘗數(shù)量顯著增多。Wang等[7]通過(guò)應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯稻瘟病侵染效應(yīng)因子基因OSERF922，使水稻抗稻瘟病能力增加。Wang等[8]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯調(diào)控水稻產(chǎn)量千粒重的基因TGW6，實(shí)驗(yàn)表明T1代純合缺失突變體千粒重明顯增加。Wang等[8]對(duì)秈稻應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，最終突變體水稻產(chǎn)量反著粒密度均增加。Wang等[9]利用 CRISPR/Cas9技術(shù)將稻瘟病感病品種“空育131”中的OsERF922 基因定向敲除，獲得的T2 純合突變系對(duì)稻瘟病菌的抗性較野生型明顯提高。

3.2 在玉米育種中的應(yīng)用

玉米既是世界第一大糧食作物之一，同時(shí)也是化工、飼料等領(lǐng)域的原料。Liang等[10]率先建立了玉米的TALENs和CRISPR/Cas9基因定向編輯系統(tǒng)，并比較了TALENs和CRISPR/Cas9誘導(dǎo)ZmIpk同一位點(diǎn)的突變效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在玉米原生質(zhì)體中CRISPR/Cas9的誘導(dǎo)突變率較TALENs高4%。Svitashev等[11]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除玉米的ALS2基因，獲得了抗磺胺脲成分除草劑的玉米植株。杜邦先鋒公司利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將糯玉米性狀引入性狀優(yōu)良的雜交種中，從而解決了糯玉米地低產(chǎn)的問(wèn)題。同時(shí)也避免了回交育種等繁瑣工作。美國(guó)杜邦先鋒公司將玉米ALS2編碼區(qū)的第165位脯氨酸利用CRISPR/Cas9技術(shù)突變成絲氨酸，得到抗氯磺隆的玉米突變體。

3.3 在小麥育種中的應(yīng)用

小麥?zhǔn)钱愒炊啾扼w植物，其基因組龐大。常規(guī)的雜交育種方法局限性較多，故新型的基因編輯技術(shù)更適合于小麥的研究。Zhang等[12]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)調(diào)控小麥粒重、粒長(zhǎng)的基因TaGASR7和穗密度基因TaDEP1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，研究結(jié)果表明，TaGASR7純合突變體粒重明顯增加，TaDEP1純合突變體明顯變短。Shan等[13]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)誘導(dǎo)面包小麥原生質(zhì)體中MLO基因發(fā)生突變。Zheng等[14]利用CRISPR/Cas9獲得了可以同時(shí)敲出三個(gè)同源基因的對(duì)白粉病有較強(qiáng)抗性的突變體。Li等[15]編輯小麥的基因轉(zhuǎn)化其原生質(zhì)體研究表明突變率達(dá)到28.5%。

4 展望

目前，全球已經(jīng)有很多轉(zhuǎn)基因作物，大豆、玉米、棉花等已在多個(gè)國(guó)家廣泛種植，但轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性問(wèn)題一直受到關(guān)注。國(guó)際上對(duì)基因編輯作物是否屬于轉(zhuǎn)基因生物還沒(méi)有統(tǒng)一定論。目前，我國(guó)對(duì)基因編輯作物的監(jiān)督管理標(biāo)準(zhǔn)還沒(méi)有明確規(guī)定，因此需要盡快出臺(tái)相關(guān)的政策以規(guī)范基因編輯育種。

傳統(tǒng)的育種方法需要投入大量的人力和時(shí)間才能獲得星狀優(yōu)良的品種，而現(xiàn)在通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)就可以直接有效地獲得優(yōu)良性狀品種，但CRISPR/Cas9技術(shù)存在一些技術(shù)方面的問(wèn)題，如脫靶效應(yīng)和如何構(gòu)建通用載體等。雖然CRISPR/Cas9技術(shù)還有一些不足，但隨著科技的進(jìn)步，相信其在未來(lái)轉(zhuǎn)基因研究中具有巨大潛力。