趙若蓮,李云芬,徐 沙,柴 琳

云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650011

肺炎支原體(MP)是一種主要引起上、下呼吸道感染的病原體，其已成為社區(qū)獲得性肺炎的首要致病菌之一。MP感染除了引起肺炎支原體肺炎(MPP)外，也可通過免疫機(jī)制形成肺外并發(fā)癥，可伴發(fā)多系統(tǒng)、多器官的損害[1]。MPP的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，目前其免疫學(xué)機(jī)制一直是研究重點(diǎn)。異常的免疫反應(yīng)及免疫炎癥風(fēng)暴是造成重癥肺炎和肺外并發(fā)癥的主要病因。尤其是細(xì)胞因子在MP 感染中的作用越來越受到重視，有研究表明，細(xì)胞因子參與了MPP 的發(fā)病過程[2]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)臭靈丹在體外對MP具有抑制作用，因此本研究擬通過研究臭靈丹對MP感染小鼠血清細(xì)胞因子的作用，探討臭靈丹在體內(nèi)對抗MP感染的作用及其可能機(jī)制，為深入研究及中醫(yī)藥制劑研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料來源 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級4周齡雌性BALB/c小鼠，40只，體質(zhì)量10～20 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號SCXK(粵)2014-0035，飼養(yǎng)于溫度25～26 ℃、相對濕度45%～55%的環(huán)境中。本研究中飼養(yǎng)及處理方法遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則。

1.2儀器與試劑 美國貝克曼庫爾特公司離心機(jī)，山東新華醫(yī)療器械有限公司電熱蒸汽壓力滅菌器，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱，美國BD公司Canto 2流式細(xì)胞儀及配套BD(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit，日本奧林巴斯公司BX43顯微鏡。

1.3方法

1.3.1MP培養(yǎng) MP菌株ATCC29342、MP19(均由昆明醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所贈(zèng)送)，以上菌體均由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、傳代和凍存，培養(yǎng)基為PPLO培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15 d，傳代過程中采用顏色改變單位(CCU)法定量調(diào)整菌體濃度為1×108CCU/mL，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2臭靈丹提取物制備 取臭靈丹(批號：2010003，購自云南和合中藥飲片有限公司)100 g，采用二次煮沸法進(jìn)行中藥原液制備，所得藥液最終合并濃縮成100 mL(1 mL原液相當(dāng)于中藥材1 g)，實(shí)驗(yàn)前用滅菌水在無菌條件下進(jìn)行倍比稀釋，稀釋終濃度分別為62.5、125.0、250.0 mg/mL，配制好的藥液均存放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3小鼠分組與建模 選取40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、低濃度、中濃度和高濃度組，共5組，每組8只。除對照組外，其余組小鼠用乙醚進(jìn)行麻醉，鼻腔內(nèi)滴入1×108CCU/mL菌液50 μL，1次/天，共滴鼻5 d，建立MP感染模型。對照組小鼠同等條件下滴入等量生理鹽水。

造模后，低濃度組、中濃度組、高濃度組分別用62.5、125.0、250.0 mg/mL濃度的臭靈丹提取液灌胃，每次0.2 mL，1次/天，連續(xù)給藥7 d。對照組與模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。

1.3.4標(biāo)本采集 灌胃7 d后，于第8天稱量小鼠體質(zhì)量，之后處死小鼠。處死后分離小鼠左右兩側(cè)肺組織，稱取肺濕重，計(jì)算肺濕重指數(shù)(肺濕重指數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。摘小鼠眼球取血，靜置15 min，3 000×g離心5 min，取上清，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察肺組織病理變化 取小鼠肺部組織，4%組織固定液固定48 h，洗滌，置于不同的乙醇濃度梯度中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切4 μm厚片，脫蠟，HE染色，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.3.6流式微球陣列法(CBA)檢測血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10和IL-4水平 CBA檢測小鼠血清細(xì)胞因子IL-6、IL-10和IL-4水平，嚴(yán)格按照美國BD公司(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠體質(zhì)量、肺濕重指數(shù)比較 與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量減輕(P<0.05)，肺濕重指數(shù)增加(P<0.05)；與模型組比較，高、低濃度組小鼠體質(zhì)量增加(P<0.05)，低、中、高濃度組肺濕重指數(shù)減低(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量比較

圖2 各組小鼠肺濕重指數(shù)比較

2.2各組小鼠肺組織病理情況 對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡內(nèi)無滲出。模型組肺部結(jié)構(gòu)中支氣管周圍的肺間質(zhì)和/或肺泡腔的肺間質(zhì)可見輕度水腫，并可見大量淋巴細(xì)胞浸潤；支氣管周邊淋巴細(xì)胞浸潤更為明顯、更重，支氣管周圍肺泡間隔可見纖維增生，間隔增寬。中濃度組和高濃度組肺組織炎癥浸潤明顯減輕。見圖3。

注：A～E分別為對照組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組病理情況。

2.3各組小鼠血清細(xì)胞因子水平比較 MP感染小鼠后，模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組血清IL-6水平較對照組升高(P<0.05)，IL-4和IL-10水平較對照組降低(P<0.05)；經(jīng)不同濃度的臭靈丹提取物作用后，低、中濃度組IL-6水平較模型組降低(P<0.05)；低、中、高濃度組IL-4水平較模型組增高(P<0.05)；低、高濃度組IL-10水平較模型組增高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清IL-4、IL-6和IL-10水平比較

3 討 論

MP感染后宿主免疫系統(tǒng)存在Th1和Th2的細(xì)胞免疫失衡[3]，過量炎癥因子釋放，繼而誘發(fā)過度免疫反應(yīng)，從而出現(xiàn)炎癥反應(yīng)風(fēng)暴，激發(fā)免疫病理損傷。細(xì)胞因子刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)越強(qiáng)，臨床癥狀越重，臟器損傷越明顯。有研究顯示，患難治性MPP的患者，其血清中干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平明顯升高[4]。

臭靈丹Laggerapterodonta (DC.) Benth.為菊科六棱菊屬植物，是云南民間特色藥用植物，有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、祛痰、抗腫瘤的作用，應(yīng)用廣泛[5]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)臭靈丹提取物在體外對MP具有抑制作用，而對于其在體內(nèi)抗MP感染的作用鮮見報(bào)道，因此本研究擬通過觀察臭靈丹對MP感染的小鼠肺部病理改變及血清細(xì)胞因子水平的影響來探討其對抗MP感染的作用及其可能的機(jī)制。

小鼠感染MP后體質(zhì)量減輕，肺濕重指數(shù)升高，肺部組織出現(xiàn)水腫，淋巴細(xì)胞浸潤，纖維增生，間隔增寬等炎性病變。經(jīng)臭靈丹提取物作用后低濃度組和高濃度組體質(zhì)量增加，中濃度組體質(zhì)量變化不明顯，但3組肺濕重指數(shù)均較模型組降低，中濃度組和高濃度組肺組織炎癥浸潤明顯減輕。表明不同濃度臭靈丹對小鼠體質(zhì)量的作用可能不同，其效應(yīng)和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

IL-6是機(jī)體重要的促炎性細(xì)胞因子。IL-6在抗感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑，其升高水平與感染的嚴(yán)重程度相一致[6]。ZHAO等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-6水平在MPP的發(fā)病及發(fā)展過程中起重要作用，且與感染程度呈正相關(guān)。楊璐等[8]和黃梅青等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，MP感染小鼠模型血清IL-6水平增高，而清燥救肺湯和石仙桃多糖能有效降低IL-6、TNF-α和INF-γ等促炎性細(xì)胞因子水平，有助于緩解小鼠肺組織中的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠感染MP后血清IL-6水平升高，經(jīng)臭靈丹提取物作用后，低濃度組和中濃度組血清IL-6水平降低，而高濃度組IL-6水平升高，表明臭靈丹能減低MP感染引起的過量促炎性細(xì)胞因子的釋放，緩解免疫病理損傷，但臭靈丹對MP感染小鼠的血清IL-6水平抑制作用存在有效濃度范圍(中、低濃度)，而超過此范圍的高濃度可能對機(jī)體有一定的損傷，該結(jié)論有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子相互影響,且在感染發(fā)展過程中相互影響,對感染的發(fā)展方向和結(jié)果有重要影響。IL-4和IL-10是為數(shù)不多的抗炎性細(xì)胞因子，由Th2分泌,對機(jī)體有免疫抑制作用[10]。IL-4能下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)人B淋巴細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞合成并分泌免疫蛋白介導(dǎo)體液免疫[11-12]。IL-10 作為抗炎性細(xì)胞因子重要成員之一，是強(qiáng)免疫抑制因子，對免疫應(yīng)答起抑制作用，主要由單核巨噬細(xì)胞，T、B淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。IL-10主要抑制單核細(xì)胞介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子釋放，如IL-6、IL-8、TNF-α等來阻止組織器官受損[13-14]。XU等[15]的研究顯示，MPP患者血清IL-4、IL-10水平降低，且二者水平與間質(zhì)性肺炎相關(guān)。本研究中，模型組小鼠感染MP后血清IL-4和IL-10水平降低，經(jīng)臭靈丹提取物作用后低濃度組、中濃度組、高濃度組IL-4水平均升高，表明臭靈丹能通過上調(diào)抗炎性細(xì)胞因子IL-4水平，抑制過量免疫反應(yīng)及相關(guān)炎癥反應(yīng)，從而減輕機(jī)體免疫損傷。低濃度組和高濃度組IL-10水平升高，中濃度組IL-10水平降低，表明臭靈丹對IL-10水平的作用不遵循線性的“作用-劑量關(guān)系”，其效應(yīng)和機(jī)制有待擴(kuò)大樣本量，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明MP 感染后宿主免疫系統(tǒng)存在 Th1 和 Th2 的細(xì)胞免疫失衡，臭靈丹能緩解MP感染引起的肺組織炎性病變及過量促炎性細(xì)胞因子IL-6釋放，增加抗炎性細(xì)胞因子IL-4和IL-10的表達(dá)，使Th1 和 Th2 的細(xì)胞免疫達(dá)到平衡，抑制過度免疫反應(yīng)，減輕免疫病理損傷，這為研發(fā)抗MP感染的相關(guān)制劑提供了理論依據(jù)和新的思路。