朱俊輝，韓 東，劉鳳林，韋 妮

1.山東朱氏藥業(yè)集團有限公司臨床診斷試劑開發(fā)部，山東菏澤 274000；2.山東省食品藥品審評查驗中心，山東濟南 250000；3.山東省菏澤市單縣東大醫(yī)院檢驗科，山東菏澤 274000

抗甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)是一種抗甲狀腺自身抗體，屬于一種碘化糖蛋白，主要由甲狀腺上皮細胞合成與分泌，其異常增高常見于甲狀腺癌、結節(jié)性甲狀腺腫和自身免疫性甲狀腺疾病等[1-3]。TgAb是甲狀腺癌的獨立預測因子，不僅對預測甲狀腺癌發(fā)生風險有著重要作用，TgAb水平的變化也可用于反映甲狀腺癌患者的治療效果[4-5]。相比于常規(guī)的影像學檢測或穿刺活檢，血清TgAb檢測臨床接受程度更高，患者經濟負擔更小，其已成為臨床檢測甲狀腺疾病的常用指標[6]。對于血清TgAb水平檢測方法，傳統(tǒng)方法為放射免疫分析法，近年來化學發(fā)光免疫檢測法以其高靈敏度、高準確性、無放射污染等優(yōu)點得到了快速發(fā)展與應用[7-8]。因此，本研究擬建立一種定量檢測血清中TgAb水平的吖啶酯化學發(fā)光免疫檢測方法，評估其檢測性能，建立參考區(qū)間，并與臨床常用檢測試劑盒比對，以期為血清TgAb水平的高靈敏度、方便快捷檢測提供更多選擇。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取菏澤市單縣東大醫(yī)院體檢科120例健康人血清樣本，其中男65例，女55例；年齡28～55歲，平均(39.26±10.27)歲。另選取菏澤市單縣東大醫(yī)院60例TgAb水平異常偏高的血清樣本，其中男21例，女39例；年齡25～55歲，平均(36.26±10.27)歲。

1.2儀器與試劑 羧基磁微粒購自杭州博岳生物技術有限公司(產品號M1000C)；抗人TgAb國家標準品購自國家藥品標準物質網(產品號150556)；吖啶酯購自赫利森(廈門)生物科技有限公司(產品號HS-11015006)；人甲狀腺球蛋白抗原購自美國Meridian bioscience.Inc公司(產品號H6T08-275)；鼠抗人IgG抗體購自菲鵬生物股份有限公司(產品號抗人IgG-6)；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，產品號22980)及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，產品號24500)購自美國Thermo公司?；瘜W發(fā)光檢測儀(產品號SMART500S)購自重慶科斯邁生物科技有限公司。發(fā)光底物(含預激發(fā)液和激發(fā)液)購自美國雅培Abott公司(產品號6E23-82和產品號6C55-82)。TgAb檢測試劑盒(化學發(fā)光法)購自瑞士羅氏公司(國械注進20182402107)。其他試劑為實驗室常用試劑，均購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3檢測方法

1.3.1鼠抗人IgG抗體-吖啶酯發(fā)光試劑的制備 將鼠抗人IgG抗體與吖啶酯偶聯，以制備鼠抗人IgG抗體-吖啶酯發(fā)光試劑。具體步驟為：按照2∶1的質量比，取鼠抗人IgG抗體與吖啶酯充分混勻，常溫下振蕩偶聯0.5 h，透析法去除游離的吖啶酯，過凝膠層析柱(Sephadex G50)純化，收集發(fā)光強度高的流出液，即為鼠抗人IgG抗體與吖啶酯交聯發(fā)光試劑，用發(fā)光稀釋液[0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.05%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)+5%海藻糖+0.2%酪蛋白+0.5% Proclin300]稀釋，避光放置于4 ℃下備用。

1.3.2人甲狀腺球蛋白抗原-磁微粒偶聯物的制備 采用經典的EDC/NHS方法活化羧基磁微粒后再與人甲狀腺球蛋白抗原進行偶聯。具體步驟為：洗滌緩沖液(0.05 mol/L嗎啉磺酸，pH 6.0)洗滌羧基磁微粒數次后，加入等量的EDC和NHS，常溫下振蕩活化40 min；洗滌緩沖液洗滌4次后，按照抗體與磁微粒質量比1∶20加入人甲狀腺球蛋白抗原，室溫振蕩反應5 h。經封閉緩沖液[0.05 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)+2%牛血清清蛋白+0.05% Triton X-100+0.5% Proclin300]封閉2 h后，洗滌緩沖液洗滌后得到人甲狀腺球蛋白抗原-磁微粒偶聯物，用微球稀釋液[0.05 mol/L Tris+3%牛血清清蛋白+0.05% Triton X-100+5%海藻糖+1%氯化鈉+0.2% Proclin300]溶解，放置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.3檢測步驟 檢測前，按照優(yōu)化的條件，設置好化學發(fā)光檢測儀上的各參數(如各試劑加入量、洗滌次數、反應時間等)，進行全自動化檢測。實際步驟為：取60 μL人甲狀腺球蛋白抗原-磁微粒偶聯物，分別加入40 μL的抗人TgAb國家標準品或人血清樣本和100 μL鼠抗人IgG抗體-吖啶酯發(fā)光試劑，設備內37 ℃溫育反應20 min，外加磁場促使磁微粒及其磁微粒偶聯物聚集到試管底部，輕輕洗滌磁微粒以去除未結合物質和雜質，分別加入100 μL的發(fā)光底物激發(fā)液和預激發(fā)液后，全自動化學發(fā)光儀檢測吖啶酯光子的相對光強度(RLU)。上述檢測步驟均在全自動化學發(fā)光檢測儀上進行，只需設好程序及放好樣本即可。樣本中的TgAb水平與收集到的RLU呈正相關，通過檢測系列抗人TgAb國家標準品繪制標準曲線，利用標準曲線可計算得出待測樣品中TgAb水平。

1.3.4試劑盒組裝 試劑盒由鼠抗人IgG抗體-吖啶酯發(fā)光試劑、人甲狀腺球蛋白抗原-磁微粒偶聯物、抗人TgAb國家標準品制備成凍干粉、標準曲線信息卡、說明書等組成。鼠抗人IgG抗體-吖啶酯發(fā)光試劑分裝在棕色試劑管中，10毫升/管。人甲狀腺球蛋白抗原-磁微粒偶聯物混勻分裝于試劑管中，6毫升/管。系列濃度(0、1、10、100、500、2 000 IU/mL)的抗人TgAb國家標準品制備成凍干粉，使用時加入0.5 mL 雙蒸水復融。將分裝好的試劑貼好標簽，注明名稱、批號、保存期限等信息，組裝于試劑盒中，置于2～8 ℃中儲存。

1.4檢測性能評估

1.4.1檢測線性范圍與靈敏度 參考《臨床化學設備線性評價指南：WS/T408-2012》[9]，使用0.3%酪蛋白緩沖液(溶劑用PBS)將抗人TgAb國家標準品稀釋成系列濃度(0、1、10、100、500、2 000 IU/mL)，采用本試劑盒檢測抗人TgAb國家標準品系列濃度的RLU，每個濃度重復測定3次，計算平均值。以抗人TgAb國家標準品系列濃度的對數值作為橫坐標，以對應RLU的對數值為縱坐標，進行標準曲線的繪制與擬合。

1.4.3特異性實驗 采用本實驗制備的試劑盒分別檢測200 IU/mL TgAb、1 000 mg/dL的IgG、100 ng/mL人血清清蛋白、100 ng/mL膽紅素、100 ng/mL血紅蛋白、100 ng/mL腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和100 ng/mL癌胚抗原(CEA)樣本，以評估該試劑盒的特異性。

1.5與臨床檢測常用試劑盒比對 分別用本試劑盒和瑞士羅氏公司的TgAb檢測試劑盒(化學發(fā)光法)平行測定60例血清樣本，本試劑盒檢測得到的TgAb水平值作為橫坐標，瑞士羅氏公司的試劑盒檢測得到的TgAb水平值作為縱坐標，繪制相關性曲線并計算相關系數(r)。

1.6健康人群參考區(qū)間的建立 對120例健康人血清樣本進行檢測，參考區(qū)間的建立采用百分位數法。

1.7統(tǒng)計學處理 數據處理及分析采用SPSS19.0軟件。用非參數檢驗方法柯爾莫哥洛夫-斯米諾夫檢驗(D檢驗)和夏皮洛-威爾克檢驗(W檢驗)對檢測結果進行分析，確定120例樣本TgAb水平是否為正態(tài)分布，再根據其正態(tài)性選擇相應的參考區(qū)間計算方法。若服從正態(tài)分布，采用正態(tài)分布法；若不服從正態(tài)分布，采用百分位數法，取其第95百分位。

2 結 果

注：TgAb單位為IU/mL。

2.2檢測準確度與精密度 準確度和精密度評估結果見表1。批內對高(1 000 IU/mL)、中(200 IU/mL)、低(50 IU/mL)濃度抗人TgAb國家標準品的相對偏差為1.34%～5.20%，批間相對偏差為1.15%～6.70%。批內對高(1 000 IU/mL)、中(200 IU/mL)、低(50 IU/mL)濃度抗人TgAb國家標準品的CV為1.50%～3.23%，批間CV為1.68%～3.84%。

表1 準確度與精密度評估結果

2.3檢測特異性 特異性評估結果見表2。用本試劑盒檢測抗人TgAb國家標準品的交叉反應率為98.22%，而檢測人血清清蛋白(100 ng/mL)、膽紅素(100 ng/mL)、血紅蛋白(100 ng/mL)、TNF-α(100 ng/mL)、CEA(100 ng/mL)均無明顯交叉反應，檢測值分別為1.73、1.15、1.87、1.42和1.76 IU/mL，其中選用了一個含IgG的樣本(IgG水平：1 000 mg/dL)，其檢測結果不高于參考區(qū)間上限值，說明干擾較小，不影響檢測結果。

表2 特異性評估結果

2.4與臨床檢測常用試劑盒比對 60例血清樣本平行檢測，繪制的相關性曲線見圖2，相關性方程為Y=0.964 9X+10.823 0，R2=0.937 0，r=0.968 0，其覆蓋了中、高濃度情況，符合率較高。

圖2 與臨床檢測用試劑盒比對的相關性

2.5健康人群參考區(qū)間 本試劑盒檢測120例健康人血清樣本得到的TgAb水平使用SPSS19.0進行分析，均顯示數據不服從正態(tài)分布，故采用百分位數法，取其第95百分位，建議最合適的閥值為111.65 IU/mL，即健康人群參考區(qū)間為≤111.65 IU/mL。

3 討 論

甲狀腺癌是臨床常見的一種內分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，由甲狀腺細胞異常增生所導致，常表現為甲狀腺結節(jié)，近年來其發(fā)病率呈現快速增長趨勢[11]。2018年全球新增甲狀腺癌患者56.7萬例，占所有癌癥的3.10%。甲狀腺癌發(fā)病率居全球癌癥發(fā)病率的第9位，其發(fā)病率在我國居第7位[12]。據統(tǒng)計,甲狀腺癌患病率在我國以每年20%的速度不斷增長，常見于小于30歲女性[13]。臨床上，主要采用超聲、查體、穿刺活檢等方式進行甲狀腺異常診斷，但上述方法臨床適用性較低，血清學生物標志物的發(fā)現與應用在甲狀腺疾病的早期篩查中的作用越來越明顯[14]。田亮等[15]對212例有明確病理學診斷的甲狀腺癌患者研究發(fā)現，細胞角蛋白19片段抗原(Cyfra 21.1)與甲狀腺癌患者術后復發(fā)和轉移有關，可能是一種能夠獨立預測甲狀腺癌患者術后復發(fā)及惡性分化風險的循環(huán)生物標志物。

本研究基于TgAb是甲狀腺癌的獨立預測因素，在甲狀腺疾病中異常高表達的理論基礎[16-18]，制備了一種吖啶酯化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，本試劑盒可開發(fā)用于體外定量測定人血清中TgAb水平，該指標臨床上主要用于甲狀腺功能亢進癥和慢性甲狀腺炎的早期診斷，還用作甲狀腺異常，如慢性淋巴性甲狀腺炎、非毒性甲狀腺腫、Grave病及甲狀腺癌的輔助診斷。此次研發(fā)試劑盒對血清中TgAb的檢測靈敏度為0.8 IU/mL，線性范圍在5～2 000 IU/mL；5種潛在交叉反應物(清蛋白、膽紅素、血紅蛋白、TNF-α、CEA)高濃度的情況下對應的檢測值遠低于人血清TgAb正常水平，而接近于檢測靈敏度，說明該試劑盒對TgAb水平檢測具有高特異性，受雜質干擾較小；對高、中、低濃度的抗人TgAb國家標準品檢測時，批內、批間相對偏差均小于10.00%，批內、批間CV均小于5.00%，說明本試劑盒對TgAb的檢測準確度和精密度較高。與價格昂貴的瑞士羅氏公司TgAb檢測試劑盒(化學發(fā)光法)比對，本試劑盒表現出了較高的相關性(r=0.968 0)。此外，本研究收集了120例健康人血清，初步推測出了TgAb在健康人群中的參考區(qū)間(閥值為111.65 IU/mL)，即當測得的樣本TgAb>111.65 IU/mL時，患者可能為甲狀腺異常；TgAb≤111.65 IU/mL時，患者甲狀腺無異常的可能性較大。參照人TgAb測定試劑盒行業(yè)標準[10,19]，本研究制備的血清TgAb化學發(fā)光免疫檢測試劑盒各項檢測性能均符合行業(yè)標準，本試劑盒質量可滿足臨床檢測的需要[20-21]。

綜上所述，本研究制備的TgAb磁微粒吖啶酯化學發(fā)光免疫試劑盒各項檢測性能合格，可滿足臨床檢測要求，在與瑞士羅氏公司TgAb檢測試劑盒初略對比中表現出了較高的相關性。另外，本研究還初步建立了本試劑盒對健康人群的參考區(qū)間。本試劑盒的開發(fā)降低了醫(yī)療成本，提高了臨床檢測的適用性，為甲狀腺疾病的早期篩查提供了一種新的實驗室檢查手段。