邢路娟，任曉鏷，王紫旭，郝月靜，張萬剛,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，國家肉品質(zhì)量安全與工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095；2.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆 阿拉爾 843300）

炎癥是機體對外界刺激、感染和內(nèi)源性組織損傷的一種免疫應激反應。炎癥的發(fā)生通常伴隨細胞因子（腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8等）的過量分泌和釋放，進而引發(fā)組織或器官的炎癥級聯(lián)反應[1]。據(jù)流行病學調(diào)查顯示，長時間的免疫失調(diào)與炎癥性腸病、血脂異常、肥胖等代謝疾病密切相關(guān)[2-3]。因此，緩解和減少炎癥的發(fā)生對預防慢性代謝類疾病尤為重要。生物活性肽是一類源于蛋白質(zhì)的多功能活性物質(zhì)，一般由2～20 個氨基酸組成，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血壓、降血脂及調(diào)節(jié)激素等生理功能[4]。在炎癥調(diào)節(jié)方面，大豆[5]、雞蛋[6]、牛乳[7]等食源性蛋白降解產(chǎn)生的生物活性肽均可抑制細胞中炎癥因子的釋放，從而緩解炎癥的發(fā)生。

干腌火腿是一種傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，其主要特點在于發(fā)酵周期長，特定的發(fā)酵溫度和濕度使火腿中的肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生水解，進而產(chǎn)生豐富的肽類物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵成熟8 個月火腿中多肽含量為2.34%，隨著發(fā)酵時間的延長，肽含量隨蛋白質(zhì)水解程度的加深而逐步增加[8]。在生物活性方面，干腌火腿肽具有清除自由基、減少細胞活性氧的產(chǎn)生、減少細胞炎癥因子釋放、抑制腐敗致病菌的產(chǎn)生等多種功能[9-11]。然而在消化吸收過程中，胃腸道中的消化酶會改變多肽的結(jié)構(gòu)，進而影響其生物活性。為了進一步探究火腿肽的抗炎功能，本研究以體外模擬消化和Caco-2細胞跨膜轉(zhuǎn)運為重點，探究多肽序列變化及其抑制巨噬細胞炎癥因子分泌的功能，從而進一步闡釋火腿肽在消化吸收前后的活性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宣威火腿 宣威浦記火腿有限公司。

人克隆結(jié)腸腺癌細胞Caco-2 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RAW264.7巨噬細胞 武漢普通諾賽生命科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE28-Standard pH計 瑞士Mettler Toledo公司；TC 12E絞肉機 意大利Sirman公司；Avanti J-E高效離心機 美國Beckman Coulter公司；ES2030冷凍干燥機 日本Hitachi公司；Spectral Max M2多功能酶標儀 美國 Molecular Devices公司；Millicell ERS-2電阻儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 粗肽的提取

參考Escudero等[12]的方法。將火腿剔除脂肪和可見筋膜后分割成小塊，用絞肉機絞碎后稱取肉末25 g，置于500 mL離心瓶中，加入100 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L，pH 7.0），用勻漿機進行勻漿處理（18000 r/min、12 s，間歇時間15 s），直至勻漿液呈現(xiàn)均勻、黏稠的狀態(tài)。然后將離心瓶置于4 ℃靜置2 h，4 ℃、12000×g離心20 min后取上清液，使用濾紙過濾掉其中的脂肪滴、肉糜等雜質(zhì)，隨后向上清液中加入3 倍體積70%乙醇溶液，再將混合液放置在4 ℃靜置8 h，最后4 ℃、12000×g離心20 min得到多肽上清液。上清液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥后得到多肽粗提粉末樣品，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肽含量測定

參照Church等[13]的方法。在避光條件下配制鄰苯二甲醛混合液：首先將80 mg鄰苯二甲醛溶解于1 mL甲醇中，隨后加入50 mL 100 mmol/L硼砂溶液混合均勻，再依次加入5 mL 20 g/100 mL SDS和200 μLβ-巰基乙醇，最后用去離子水定容至100 mL并振蕩混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的多肽粗提物溶液，取200 μL與2 mL鄰苯二甲醛混合液混合，避光環(huán)境下常溫孵育2 min，340 nm波長處測定混合溶液的吸光度。以胰酪蛋白胨為標準品繪制標準曲線，根據(jù)擬合方程計算火腿多肽含量。

1.3.3 體外消化

參考Zhu Chaozhi等[14]的方法并作修改。將多肽溶解于PBS緩沖液，配制10 mg/mL溶液，然后通過添加1 mol/L鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至2.0。隨后將溶液在37 ℃水浴10 min，同時添加胃蛋白酶（添加量為肽含量的4%）水解2 h，結(jié)束后將混合物煮沸10 min，使胃蛋白酶滅活，4 ℃、5000×g離心15 min。添加1 mol/L NaOH溶液將離心后的溶液pH值調(diào)至7.5，加入胰蛋白酶（添加量為肽含量的4%）進行2 h的37 ℃溫水孵育消化。結(jié)束后煮沸10 min，4 ℃、5000×g離心15 min，收集上清液并標記為DXP。冷凍干燥后，將未消化的火腿肽（XP）溶液和DXP同時進行體外抗炎活性實驗。

1.3.4 Caco-2腸道細胞跨膜轉(zhuǎn)運實驗

在某政府辦公大樓的智能化建造過程中，需要根據(jù)政府行政辦公的實際需要配備并建造相應的智能工程。根據(jù)建造方提供的要求和實際項目工程情況，政府辦公樓的智能工程項目可以劃分為若干子系統(tǒng)，其中包括綜合布線子系統(tǒng)、安防子系統(tǒng)和機房子系統(tǒng)等。

Caco-2細胞接種在培養(yǎng)基（DMEM＋10%胎牛血 清＋1%青霉素-鏈霉素）中，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Caco-2細胞以2×105cells/mL接種于Transwell孔板（孔徑0.4 μm，直徑12 mm，表面積1.12 m2）。在上室和下室分別加入0.5 mL細胞懸液和1.5 mL細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，前7 d隔天更換細胞培養(yǎng)液，7 d之后每天更換培養(yǎng)液直至培養(yǎng)21 d。用電阻儀測定細胞單層跨膜電阻（trans epithelial electrical resistance，TEER），Caco-2細胞單層的TEER隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸變大，TEER越大，則細胞單層致密性越好。當TEER達到800 Ω·cm2以上符合實驗要求[15]。 配制1 mg/mL的多肽溶液（溶解于Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）），在上室加入0.5 mL多肽樣品溶液，下室加入1.5 mL HBSS，放入細胞培養(yǎng)箱120 min，最后將下室的培養(yǎng)基全部取出，冷凍干燥后質(zhì)譜檢測多肽成分。

1.3.5 抗炎活性測定參考Eslim等[16]的方法。RAW264.7細胞接種于12 孔板，接種密度為1×105cells/cm2，將細胞板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?；鹜榷嚯娜芙庥贒MEM培養(yǎng)基中，配制成1 mg/mL的多肽溶液，0.22 μm濾膜過濾待用。在RAW264.7細胞長至密集度約80%時抽離原培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞后加入500 μL多肽溶液，預處理1 h后加入50 μL LPS（10 μg/mL，溶解于DMEM培養(yǎng)基）以誘導炎癥反應，共孵育12 h后收集細胞上清液，取50 μL立即測定NO含量，取100 μL測定細胞炎癥因子含量。其中，對照（negative control，NC）組細胞無多肽處理且無LPS誘導，炎癥陽性對照（positive control，PC） 組使用LPS誘導產(chǎn)生炎癥，DXP和XP處理組為多肽與LPS共孵育12 h。

1.3.6 細胞上清液中NO、TNF-α和IL-6含量測定

按照NO、TNF-α和IL-6檢測試劑盒的方法操作。

1.3.7 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定多肽序列及合成

首先將火腿多肽進行前處理，使用MonoSpin C18脫鹽柱進行脫鹽。液相洗脫液由體積分數(shù)0.1%甲酸（緩沖液A）和乙腈（緩沖液B）組成，洗脫梯度如下：0～2 min，2%緩沖液B；2～19 min，2%～30%緩沖液B； 19～20 min，30%～95%緩沖液B；20～25.5 min，95%緩沖液B；25.5～26 min，95%～2%緩沖液B；26～30 min，2%緩沖液B。多肽上樣后進行梯度洗脫，然后采用一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜掃描，質(zhì)譜全掃描范圍為m/z100～1200。所得結(jié)果用Mass Lyna 4.1軟件分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過PeaksStudio數(shù)據(jù)庫和de novo模型進行多肽組成分析。已知序列的多肽經(jīng)蘇州強耀生物科技有限公司進行化學合成，合成肽的純度均為95%以上。

1.3.8 跨膜轉(zhuǎn)運后火腿多肽的抗炎活性測定將合成肽配制為1 mg/mL的多肽溶液，按照1.3.5節(jié)的步驟操作，檢測巨噬細胞的NO和TNF-α分泌量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS 8.0軟件，方差分析過程選用One-Way ANOVA，實驗結(jié)果用平均值±標準差表示，實驗重復次數(shù)為6，每次平行測定次數(shù)為3，多重比較采用Duncan’s Multiple Range Test，柱形圖采用GraphPad Prism 5 軟件繪制，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 火腿中生物活性肽的含量

在肉制品加工過程中，肌肉中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶的作用下發(fā)生水解生成大量肽類化合物和氨基酸。內(nèi)源肽酶（如組織蛋白酶和鈣蛋白酶）可以將蛋白質(zhì)降解為肽段，隨后肽段被肽酶進一步降解產(chǎn)生氨基酸、二肽或三肽等[17]。本研究中，100 g宣威火腿可提取9.8 g多肽粗提物，其中肽含量為86.85%，多肽提取率為8.49%。在前期的研究中，成熟24 個月金華火腿的多肽含量為8.95%[8]，與本研究結(jié)果相似。在發(fā)酵牛肉香腸的研究中，發(fā)酵21 d的香腸肽粗提物中的多肽含量為28.49%，不同發(fā)酵方式對多肽提取量有較大影響[18]。諾鄧火腿粗提物中的多肽含量隨著加工時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，加工2 年諾鄧火腿粗肽的多肽含量最高[19]。宣威火腿和金華火腿加工8 個月后的肌肉中多肽提取率分別為2.34%[20]和1.16%[21]。原料來源、腌制成熟條件（溫度、濕度、加鹽腌制時間）及成熟時間均會影響干腌火腿的多肽含量。

2.2 胃腸道模擬消化對火腿多肽抗炎活性的影響

NO是一種具有極強生物活性的效應分子，在炎癥反應中NO水平升高是造成局部組織損傷的因素之一[22]。 由圖1可知，與對照組相比，PC組的NO含量顯著升高，未消化與消化后多肽均可以降低巨噬細胞中NO的含量。其中，消化后多肽處理組的NO含量為8.01 μmol/L，顯著低于未消化多肽組（12.6 μmol/L，P＜0.05）。由圖2可知，在調(diào)控細胞因子分泌方面，火腿多肽可以顯著降低巨噬細胞中TNF-α和IL-6的釋放量。其中，TNF-α含量由1523.08 pg/mL降低至620.23 pg/mL （P＜0.05），DXP組顯著低于XP組（P＜0.05）。IL-6含量由PC組的156.79 pg/mL降低至DXP組的 52.34 pg/mL，DXP組與XP組沒有顯著差異。通過NO和TNF-α含量的變化可知，DXP對細胞促炎因子釋放的抑制作用更強，由此說明胃腸模擬消化提升了火腿多肽的抗炎功能。

圖1 胃腸道模擬消化后火腿多肽對RAW264.7細胞分泌NO的影響（n=6）Fig. 1 Effect of peptides subjected from Xuanwei ham to enzymatic digestion on the secretion of NO in RAW264.7 cells (n = 6)

圖2 胃腸道模擬消化后火腿多肽對RAW264.7細胞分泌TNF-α（A）和 IL-6（B）的影響（n=6）Fig. 2 Effect of peptides from Xuanwei ham subjected to enzymatic digestion on the secretion of TNF-α (A) and IL-6 (B) in RAW264.7 cells (n = 6)

2.3 胃腸道模擬消化對火腿多肽序列的影響

由表1可知，胃腸道模擬消化處理后火腿多肽的肽段數(shù)量從545 條增加到817 條，多肽的分子質(zhì)量分布發(fā)生較大變化。未消化多肽中分子質(zhì)量小于1000 Da的多肽占40.18%，分子質(zhì)量小于500 Da的多肽占4.00%；而消化后分子質(zhì)量小于1000 Da的多肽顯著增加至57.40%，分子質(zhì)量小于500 Da的多肽占7.90%。由此說明，火腿多肽經(jīng)胃腸道模擬消化后可釋放更多的小分子肽。與長鏈肽段相比，小分子肽的生物吸收性更強，進而有助于其生理功能的發(fā)揮。從雞蛋、大豆、牛乳中分離得到的抗炎功能肽有IRW、IQW[5]、VPY[6]、IPP及VPP[7]，其分子質(zhì)量均小于500 Da。研究顯示，IRW可以緩解內(nèi)皮細胞黏附因子ICAM-1表達，降低細胞炎癥水平[5]。大豆來源的生物活性肽VPY可以降低腸道Caco-2細胞和THP-1細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、干擾素γ等促炎細胞因子的釋放，進而發(fā)揮緩解炎癥的功能[6]。綜合本研究結(jié)果可知，胃腸道模擬消化使火腿肽進一步降解產(chǎn)生更多小分子肽，從而提升了火腿肽對NO和TNF-α的抑制作用。

表1 胃腸道模擬消化及跨膜轉(zhuǎn)運前后火腿中多肽的組成變化Table 1 Change in the composition of peptides from Xuanwei ham after simulated digestion and transmembrane transport

2.4 Caco-2細胞跨膜轉(zhuǎn)運對火腿多肽序列及抗炎活性的影響

在生物活性肽的消化吸收過程中，腸道屏障是影響多肽跨膜轉(zhuǎn)運的最大障礙。經(jīng)腸道消化后，90%以上的長鏈多肽將被消化酶降解，產(chǎn)生短鏈小肽和游離氨基酸，然后經(jīng)腸道上皮細胞吸收[23]。除胃腸道的消化酶以外，小腸上皮刷狀緣細胞表面的氨肽酶、羧肽酶也可以將多肽特異性酶解，從而使多肽在跨膜轉(zhuǎn)運前后的分子序列發(fā)生變化[24]。因此，能否以肽鏈的完整結(jié)構(gòu)跨越腸道細胞是決定生物活性肽在體內(nèi)代謝吸收的必要前提。

由表2可知，共有24 條多肽可以在跨膜轉(zhuǎn)運后抵達孔板的下室（BL側(cè)）。其中，部分多肽序列，如SPSA、VGLF、LVGF、PSVY等可以在消化后的多肽序列中找到其對應的來源，說明長肽鏈的序列在跨膜轉(zhuǎn)運過程中發(fā)生斷裂，進而穿越Caco-2細胞單層膜。如TINGVQYPLSPSA在C端發(fā)生斷裂產(chǎn)生SPSA，LGEKLDE斷裂產(chǎn)生LGEKL。多肽的跨膜轉(zhuǎn)運方式包括主動轉(zhuǎn)運、細胞旁路途徑轉(zhuǎn)運及內(nèi)吞作用[18]。二肽、三肽等小分子肽主要是通過小腸上皮細胞上刷狀緣的寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepT1主動轉(zhuǎn)運而吸收，而分子質(zhì)量較大的多肽則主要以旁路轉(zhuǎn)運途徑跨越細胞膜[25]。Dodco等[26]研究發(fā)現(xiàn)，刷狀緣膜上的肽酶可以將寡肽水解成氨基酸、二肽或三肽，四肽及四肽以上多肽在刷狀緣的水解率高達90%，三肽的水解率為10%～60%，二肽的水解率只有10%。因此，分子質(zhì)量較大的多肽更容易在穿越細胞膜的過程中發(fā)生水解，因而到達BL側(cè)的濃度更小。

表2 Caco-2細胞跨膜轉(zhuǎn)運后火腿多肽序列的鑒定Table 2 Sequence identification of peptides from Xuanwei ham transported across Caco-2 cells

SwissADME數(shù)據(jù)庫（http://www.swissadme.ch/index）可以預測生物活性肽的理化性質(zhì)、脂溶性、水溶性、藥代動力學性質(zhì)、溶解性及生物相容性等，從而為研究生物活性肽的跨膜吸收特性提供前提[27]。通過SwissADME數(shù)據(jù)庫對鑒定得到的生物活性肽進行預測分析，由表3可知，在理化特性方面，所有多肽的氫鍵受體數(shù)量大于5，VHESL的受體數(shù)量最多（11），多肽的氫鍵供體數(shù)量均大于4，其中KLRGW供體數(shù)量最多（11）。極易溶解的多肽有15 條，不可溶的多肽（YFSFF）有1 條。在生物利用度方面，利用度為0.55的多肽有8 條，其余多肽的利用度均小于或等于0.17。在腸道吸收特性方面，PAG、LVG、LGV、PVL 4 條多肽的吸收度較高，其余多肽的腸道吸收性較差。P-糖蛋白是生物大分子吸收轉(zhuǎn)運中的跨膜蛋白，主要通過消耗ATP將藥物泵送出細胞[28]，如果生物活性肽是P-糖蛋白底物，則可能降低其生物利用度。本研究中有13 條肽可以作為 P-糖蛋白的底物，另有11 條肽不是P-糖蛋白的底物。細胞色素P4503A4酶是肝臟代謝的重要降解酶，細胞色素P4503A4酶的抑制劑可導致藥物積蓄中毒[29]。從本研究預測結(jié)果可知，火腿肽跨膜轉(zhuǎn)運后產(chǎn)生的小肽均不是細胞色素P4503A4酶的抑制劑，說明這些小肽沒有引起肝臟中毒的風險。根據(jù)生物利用度和腸道吸收性可知，PAG、LVG、LGV、PVL在機體內(nèi)發(fā)揮生理調(diào)節(jié)功能的可能性更高。

表3 跨膜轉(zhuǎn)運后火腿多肽的生理生化特性預測分析Table 3 Predicted physiological and biochemical properties of peptides from Xuanwei ham after transmembrane transport

2.5 跨膜轉(zhuǎn)運后火腿多肽的抗炎活性

為進一步驗證跨膜轉(zhuǎn)運后多肽的抗炎活性，采用化學合成的方法制備PAG、LVG、LGV、PVL 4 條多肽，并測定合成肽對炎癥因子分泌的調(diào)節(jié)作用。由圖3可知，合成肽對LPS誘導的RAW264.7細胞中NO分泌有顯著抑制作用（P＜0.05），4 組多肽處理組的NO含量均低于PC組。其中PC組NO含量為14.82 μmol/L，LVG處理后NO含量最低，為7.89 μmol/L（P＜0.05），且LVG組的NO含量顯著低于PAG和LGV組，由此可見LVG對NO的抑制能力最強。

圖3 合成肽對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌NO的調(diào)節(jié)作用（n=6）Fig. 3 Regulatory effect of synthetic peptides on the secretion of NO in LPS-induced RAW264.7 cells (n = 6)

由圖4可知，PAG、LVG、LGV、PVL 4 條多肽可以抑制TNF-α的分泌。與PC組（1589.70 pg/mL）相比，LVG處理后TNF-α含量顯著降低至626.32 pg/mL，PAG、LGV組的TNF-α含量差異不顯著，但小于PC組。多肽的氨基酸組成、分子質(zhì)量和疏水性與其生物活性密切相關(guān)。從大豆中分離得到的小分子抗炎活性肽VPY可以降低Caco-2和THP-1細胞中TNF-α、IL-6、IL-8等促炎因子的分泌，在吸收過程中，VPY介導PepT1蛋白的作用進行跨膜轉(zhuǎn)運[6]。大豆FLV肽可以緩解脂肪細胞中TNF-α、IL-6、單核細胞趨化蛋白1等促炎因子的分泌，同時通過降低胰島素抵抗來介導脂肪細胞的糖代謝過程；FLV調(diào)節(jié)PepT2蛋白進而被跨膜轉(zhuǎn)運，說明FLV以完整結(jié)構(gòu)進入脂肪細胞，進而發(fā)揮緩解炎癥作用[30]。本研究中鑒定得到的小分子肽LVG與大豆抗炎活性肽FLV具有類似的氨基酸組成，其抗炎活性在巨噬細胞中已得到初步證實，由此說明，火腿肽在經(jīng)腸道消化和跨膜轉(zhuǎn)運后可以發(fā)揮緩解細胞炎癥功能。

圖4 合成肽對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF-α的調(diào)節(jié)作用（n=6）Fig. 4 Regulatory effect of synthetic peptides on the secretion of TNF-α in LPS-induced RAW264.7 cells (n = 6)

3 結(jié)論

本研究重點探究火腿肽在胃腸道模擬消化及跨膜轉(zhuǎn)運前后對細胞炎癥因子分泌的調(diào)節(jié)作用。在LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥中，消化后火腿肽可顯著抑制巨噬細胞中NO、TNF-α和IL-6的分泌。經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運吸收后可檢測到24 條多肽，合成的小分子肽PAG、LVG、LGV、PVL均可抑制巨噬細胞中NO和TNF-α的分泌。綜上可知，胃腸道模擬消化可以改變多肽的分子質(zhì)量分布，進而提升火腿肽的抗炎功能；跨膜轉(zhuǎn)運后的小分子肽生物利用度相對較高，且可以發(fā)揮緩解炎癥因子釋放的功能。