孫 晶, 杜 穩(wěn), 趙程程, 常曉嬌, 趙一凡, 王 峻, 劉虎軍

(國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，又名嘔吐毒素，20世紀(jì)70年代由Yoshizawa等在被鐮刀菌污染的小麥等谷物食品中發(fā)現(xiàn)并鑒定[1]，DON屬于單端孢霉烯B族化合物，化學(xué)名稱為3ɑ，7ɑ，15-三羥基-12，13-環(huán)氧單端胞霉-9-烯-8-酮，分子式C15H20O6。DON污染在霉變的玉米、小麥等谷物中較為普遍，是導(dǎo)致食品安全問題的主要真菌毒素之一[2-4]。該毒素進(jìn)入食物鏈后可引起人畜多種疾病，導(dǎo)致人和動物的細(xì)胞毒性[5,6]、免疫毒性[7,8]、腸道毒性[9,10]、神經(jīng)毒性[11]和生殖遺傳毒性[12]，禽畜采食污染的飼料后，會出現(xiàn)拒食、嘔吐和引發(fā)流產(chǎn)等嚴(yán)重后果[13]。2018年中國飼料原料及飼料霉菌毒素檢測報告顯示真菌毒素污染普遍存在，小麥及麩皮是DON污染最為嚴(yán)重的原料[14]。為了保護(hù)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和人類的健康消費，中國規(guī)定飼料原料或飼料中DON的含量最高為5 000 μg/kg，用于食品的谷物及谷物產(chǎn)品中DON的最大限量為1 000 μg/kg[15]。因此，如何有效控制和去除谷物、糧油副產(chǎn)品及飼料中的嘔吐毒素，對改善動物生產(chǎn)性能和提高人類的食品安全具有非常重要的意義。

目前去除DON方法有物理法、化學(xué)法和生物降解法[16]。研究表明，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)法[17]脫除DON的技術(shù)存在不易操作、難以規(guī)模化應(yīng)用，以及脫毒制品的營養(yǎng)成分損失大和制品適口性差等弊端。生物降解法因具有效率高、特異性強、環(huán)境無污染、不影響營養(yǎng)價值等優(yōu)點，備受研究者的關(guān)注[18]。生物降解法是利用微生物或其產(chǎn)生的降解酶將嘔吐毒素分解或代謝為低毒或無毒產(chǎn)物[19]。2013年，以菌株BBSH797開發(fā)的產(chǎn)品百霉克被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，實現(xiàn)了DON脫毒菌劑商業(yè)化，呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[20]。如何篩選獲得高效降解菌，并解析其降解途徑是推進(jìn)優(yōu)良降解DON微生物菌株的前提和基礎(chǔ)[21,22]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，篩選獲得一株可高效降解DON的菌株，在完成菌株鑒定后，采用液質(zhì)聯(lián)用(LC-HRMS)初步推測其降解機理，評估該菌株在糧食及其副產(chǎn)物中DON的脫毒效果，為在實際生產(chǎn)中應(yīng)用于脫除糧食和飼料中DON的相關(guān)技術(shù)開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：采集自吉林長春、河南鄭州和西藏拉薩等地區(qū)的土壤、河流污泥和動物糞便等共133份樣品，密封冷藏于實驗室備用。

培養(yǎng)基：無機鹽培養(yǎng)基(MSM)(g/L)：(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.05 g，Na2HPO42.44 g，KH2PO41.52 g，加去離子水定容至1 000 mL，pH為6.8。在培養(yǎng)基中添加濃度為10 μg/mL的DON做為菌株定向篩選培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去離子水定容至1 000 mL。固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂。

1.2 主要試劑及儀器

DON標(biāo)準(zhǔn)品為本實驗室制備提取[23]；甲醇、乙腈均為色譜純級；嘔吐毒素免疫親和柱；酵母提取物等其他試劑均為分析級。

E2695高效液相色譜儀，waters xbridge C18色譜柱，C1000PCR儀, Gel Doc XR+凝膠成像儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 DON降解菌篩選和分離

富集和初篩：取10 g樣品于100 mL MSM培養(yǎng)基中，DON濃度為10 mg/L，在30 ℃，220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，以10%接種量轉(zhuǎn)接3次，高效液相色譜(HPLC)檢測DON殘留量，選擇具有DON降解效果的樣品進(jìn)行下一步實驗。

復(fù)篩：將初篩具有降解效果的樣品經(jīng)過適當(dāng)梯度稀釋后涂布于MSM平板上，挑取形態(tài)各異的單菌落接至含有10 mg/L DON的1 mL MSM培養(yǎng)液中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)7 d。檢測DON殘留量，挑選具有降解能力的單菌株。

1.3.2 降解菌活性物質(zhì)的定位

挑取具有高效降解能力的單菌落接種于50 mL MSM培養(yǎng)液中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液在5 000 r/min離心5 min獲得發(fā)酵上清液(胞外液)；發(fā)酵液離心后棄上清，菌體經(jīng)等體積MSM培養(yǎng)液重懸后超聲破碎，5 000 r/min離心5 min，獲得發(fā)酵液破碎上清液(胞內(nèi)液)。分別取胞外液和胞內(nèi)液500 μL，加入含有10 mg/L DON的1 mL MSM培養(yǎng)基中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)12 h，以各自高溫滅活的上清液為對照，測定DON殘留量。

1.3.3 菌種鑒定

形態(tài)鑒定：將獲得的菌株在MSM培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)24～72 h，觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣、表面隆起形狀、透明度等。對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征。

分子鑒定：對降解菌株進(jìn)行16S rDNA或18S rDNA鑒定。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA作為模版進(jìn)行PCR擴增。16S rDNA通用引物16SF：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SR：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，18S rDNA通用引物18SF：5’-GTAGTCATATGCTT-3’，18SR：5’-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3’進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系：模版1μL，Premix Taq 12.5 μL，16S/18S上下游引物引物各1 μL，雙蒸水10.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對。

1.3.4 DON降解率測定

DON含量測定參考高效液相色譜法(GB 5009.111—2016)[24]。色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水/甲醇=80/20；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測器：激發(fā)波長(Ex)=218 nm。

DON降解率=降解后培養(yǎng)基中DON含量/原培養(yǎng)基中DON的含量×100%。

式中：原培養(yǎng)基中DON的含量為10 mg/L。

1.3.5 DON降解菌降解機理初步分析

降解曲線：DON降解菌接入含有10 mg/L DON的1 mL MSM培養(yǎng)液中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)5 d，每間隔24 h取樣，測定DON殘留量，繪制降解曲線。

質(zhì)譜分析：DON含量測定參考高效液相色譜法。選取上述0～3 d樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析方法：正離子模式，色譜柱：poreshell 120 EC-C18,(2.1 mm×100 mm)；柱溫度：40 ℃；流動相：A：水/甲酸銨=99.9/0.1，B：甲醇/甲酸=99.9/0.1；梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～1.5 min，45% B；1.5～8.5 min，B相由45%升至100%，保持1 min后回到初始流動相保持0.5 min，準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.6 降解效果應(yīng)用評價

生長曲線：挑取降解菌單菌落于LB培養(yǎng)基中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)60 h，每間隔4 h取樣測定OD值，以時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

脫毒應(yīng)用：依據(jù)生長曲線實驗參數(shù)，挑取降解菌單菌落接種至LB培養(yǎng)基中，在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)期作為種子液。以10%的接種量接入DON含量超標(biāo)的小麥、DDGS和玉米稀漿培養(yǎng)基中，在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)18 h，取樣檢測物料中DON殘留量，分析降解效果，物料中DON提取方法參見國標(biāo)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離和純化

根據(jù)1.3.1的方法對133份采集樣品進(jìn)行特異性富集，以DON為唯一碳源，具有DON降解能力的富集液多達(dá)32份。在LB平板上對32組富集液進(jìn)行涂布培養(yǎng)，挑取平板上長出的形態(tài)各異的單個菌落劃線純化，獲得單菌株14株，分別編號為D-1～D-14。單菌株分別接種到含10 mg/L DON的1 mL MSM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7 d，D-1、D-4、D-8和D-14具有明顯降解效果，降解率分別為67.07%、37.23%、98.40%和32.50%。不同來源的單菌株對DON降解效率差異較大，來源于河南省鄭州市高新區(qū)河流污泥樣品的菌株D-8培養(yǎng)第3 d降解率即可達(dá)98.4%，幾乎將10 μg DON消除，D-8較其他菌株降解能力更高效。選擇此菌株進(jìn)行下一步研究。

2.2 降解菌的活性物質(zhì)定位

菌株D-8發(fā)酵上清液和菌體破碎上清液各500 μL，加入含有10 mg/L DON的1 mL MSM培養(yǎng)基中，發(fā)酵上清液即為胞外液，菌體破碎后上清液即為胞內(nèi)液，胞內(nèi)液和胞外液對DON的降解率分別為83.48%和17.23%。同時，將獲得的上清液滅活處理幾乎沒有降解效果。Carere等[25]已從德沃斯氏菌株找到活性物質(zhì)，本研究結(jié)果表明，菌株D-8對DON的降解不是菌體的吸附作用，而是菌體產(chǎn)生的某種可降解DON的活性物質(zhì)，可能是一種菌體表達(dá)的酶蛋白[26]。

2.3 降解菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定

菌株D-8在LB培養(yǎng)基上能較好生長，大部分菌落符合細(xì)菌特征，30 ℃，經(jīng)3 d培養(yǎng)其菌落形態(tài)呈象牙白色、圓形且邊緣整齊，表面光滑且凸起，大小0.5～1.5 μm(圖1a)；顯微鏡下的形態(tài)為細(xì)小棒狀，無孢子形成，為革蘭氏陰性菌(圖1b)。

圖1 D-8的菌落圖(a)和顯微鏡檢圖(b)

2.3.2 分子鑒定

采用細(xì)菌16S rDNA通用引物擴增菌種的保守序列，將擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI Blast N中進(jìn)行同源性比對。利用MEGE5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，菌株D-8和DevosialimiLMG 22951同源性高達(dá)97%。根據(jù)菌株16S rDNA的相似性、系統(tǒng)發(fā)育樹和菌落形態(tài)，初步鑒定D-8為德沃斯氏菌株。目前，已有學(xué)者開展DON降解菌劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖研究。計成等[27]分離一株高效DON降解菌枯草芽孢桿菌ANSB471，對飼料中嘔吐毒素的降解率可達(dá)到97.34%。德沃斯氏菌株降解DON具有潛能，本研究篩選德沃斯氏菌可高效降解DON，在應(yīng)用上可開展進(jìn)一步深入研究。

圖2 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株D-8降解機理初步分析

菌株D-8降解曲線表明，在MSM培養(yǎng)基中，該菌生長雖然緩慢，但對DON有較好的降解效果。從發(fā)酵第1 d開始降解速率明顯加快，培養(yǎng)3 d即可將培養(yǎng)液中DON毒素完全清除。菌株D-8與He等[28]篩選的德沃斯氏菌相似，均可高效降解DON，降解率90%以上，具有較好的應(yīng)用前景。

菌株D-8降解產(chǎn)物質(zhì)譜分析表明，降解過程提取EIC圖譜(圖3a)，隨著發(fā)酵時間的增加，DON峰值降低，產(chǎn)物峰值逐漸增加。發(fā)酵1 d，DON含量即減少，在質(zhì)荷比297.133 3分子質(zhì)量下出現(xiàn)2個物質(zhì)峰，相同分子質(zhì)量的產(chǎn)物峰逐漸增多，發(fā)酵3 d，DON幾乎轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)荷比分析(圖3b)，質(zhì)荷比為[M+H]+=297.134 3，表明菌株D-8產(chǎn)生的活性物質(zhì)將DON轉(zhuǎn)化為分子質(zhì)量相同的產(chǎn)物，此產(chǎn)物較穩(wěn)定，不容易恢復(fù)成DON。目前，Hassan等[29]報道德沃斯氏菌株可將DON轉(zhuǎn)化為3-eip-DON。結(jié)合已有研究，菌株D-8轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與Hassan等[29]報道一致，解析此代謝過程可能發(fā)生兩步反應(yīng)，底物DON分子在降解菌的作用下，生成中間體3-酮基-DON(3-keto-DON)，再經(jīng)差向異構(gòu)生成終產(chǎn)物3-eip-DON，3-eip-DON毒性低于DON，可作為DON脫毒有效降解途徑。

注：a：菌株D-8降解過程DON產(chǎn)物峰EIC圖譜(1：DON，2：3-epi-DON)；b：D-8降解DON產(chǎn)物質(zhì)荷比分析。圖3 菌株D-8降解產(chǎn)物質(zhì)譜分析

2.5 降解菌降解效果評價

以時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制菌株D-8生長曲線(圖4)，D-8接種于LB培養(yǎng)基中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)，于18 h進(jìn)入對數(shù)生長期，36 h進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖4 菌株D-8生長曲線

谷物及其副產(chǎn)品在深加工過程中存在嘔吐毒素濃縮效應(yīng)，從而導(dǎo)致部分副產(chǎn)物及噴漿飼料產(chǎn)品中嘔吐毒素含量明顯超標(biāo)，本研究初步探索德沃斯氏菌D-8在玉米稀漿、DDGS等谷物及其副產(chǎn)物中DON脫毒初步應(yīng)用。將D-8菌株以10%的接種量接種至各DON超標(biāo)物料培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h，處理組經(jīng)免疫親和柱凈化后，檢測DON的殘留量(圖5)，小麥處理組脫毒效果相對最佳，可將小麥中DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6 110.42 μg/kg降為115.41 μg/kg，降解率為98.11%；玉米稀漿次之，可由2 679.52 μg/kg降為995.60 μg/kg，降解率為62.84%；DDGS效果略差，僅由1 502.75 μg/kg降為864.31 μg/kg，降解率為42.5%。菌株D-8在3種原料中的降解能力為小麥>玉米稀漿>DDGS。分析其原因，3種物料脫毒差異性可能是各物料中pH值、營養(yǎng)物質(zhì)含量及比例不同，小麥粉初始pH值偏中性，而DDGS和玉米稀漿偏酸性，小麥粉pH值適中，營養(yǎng)成分均衡，有助于菌株生長[30]，脫毒效果較好；其次，玉米稀漿脫毒效果可能受無機鹽種類和含量的影響，脫毒效果次之；最后，DDGS物料中可能存在與菌株降解酶的輔酶具有競爭或者抑制作用的物質(zhì)[31]，從而導(dǎo)致其脫毒效果略差。目前，玉米稀漿、DDGS等深加工副產(chǎn)物脫毒應(yīng)用技術(shù)難度大，鮮有報道。本研究利用生物降解法，初步實現(xiàn)同一菌株在不同物料中的脫毒應(yīng)用研究，經(jīng)菌株發(fā)酵處理后不同物料中DON含量均可低于國家限定標(biāo)準(zhǔn)。同時，這也表明德沃斯氏菌D-8具有可研制成真菌毒素生物脫毒菌劑的潛力，可為為副產(chǎn)物高值化利用提供菌株資源。

圖5 菌株降解3種原料中DON的情況

3 結(jié)論

本研究分離獲得一株高效降解DON的微生物菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段相結(jié)合，初步鑒定為德沃斯氏菌(命名D-8)。D-8菌株在MSM培養(yǎng)基中3 d內(nèi)可將10 μg DON幾乎完全降解，降解率達(dá)98.4%。

采用質(zhì)譜分析表明，D-8菌株可通過兩步反應(yīng)將DON轉(zhuǎn)化為質(zhì)荷比為297.134 3的產(chǎn)物，經(jīng)過分析推導(dǎo)為3-epi-DON，根據(jù)已有報道，3-eip-DON為DON的同分異構(gòu)體，且毒性低于DON，可作為DON脫毒有效降解途徑[32]。本研究利用生物降解法，初步實現(xiàn)同一菌株在不同物料中的脫毒應(yīng)用研究，以谷物及其副產(chǎn)物為原料，以D-8為發(fā)酵菌株，經(jīng)過18 h發(fā)酵，小麥、玉米稀漿、酒糟蛋白(DDGS)中的DON降解率分別為98.11%、62.84%和42.5%。發(fā)酵小麥中的DON初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6 110.42 μg/kg降解至115.41 μg/kg，脫毒效果相對最佳。經(jīng)菌株D-8發(fā)酵處理后不同物料中DON含量均低于國家限定標(biāo)準(zhǔn)。該研究的結(jié)果可為DON污染糧食及其制品的脫毒應(yīng)用提供可行的處理途徑。后續(xù)實驗將深入全面開展降解菌D-8穩(wěn)定性、耐酸耐高溫定向誘變育種、飼用安全性和有效性等多方面研究，力求將其開發(fā)成一種高效、安全的能夠應(yīng)用于飼料和食品中的DON生物脫毒菌制劑。