嚴婷婷, 王天圻, 趙 艷

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018)

發(fā)芽糙米，是指脫殼水稻種子即糙米經(jīng)過消毒后，在水分足量、溫度適宜、氧氣充足條件下，吸水膨脹發(fā)芽到一定程度的制品[1]。萌芽處理不僅可以有效改善糙米食用風(fēng)味，而且可以提高總酚、谷維素、類黃酮、抗氧化活性、維生素E、大多數(shù)氨基酸等功能性成分的含量[2,3]。因此，富含營養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)芽糙米越來越受到消費者的歡迎。

水稻種子是發(fā)芽糙米的直接原料，也是內(nèi)生菌的攜帶者和傳播者[4]。內(nèi)生真菌(endophyfic fungi)是指其生活史的一定階段或全部階段定殖在宿主植物體內(nèi)，而不引起植物發(fā)生明顯病變的一類真菌總稱[5]，可提高宿主植物抗旱、抗寒、抗病蟲害的能力，并促進宿主生長，也可能產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物[6]。Arundhati等[7]從水稻種子中分離到內(nèi)生真菌Dendryphiella和Cochliobolusmiyabeanusspp。田新莉等[8]從不同種植地的水稻樣本中分離出多種內(nèi)生真菌，主要屬于鐮刀菌屬(Fusarium)、梨孢霉屬(Piricularia)、 酵母(Yeast)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)等。Alexander等[9]利用Illumina MiSeq測序技術(shù)從水稻種子中檢測鏈格孢屬(Alternaria)、Hannaella、Pleosporales等真菌。由于種子中的內(nèi)生真菌無法采用常規(guī)消毒方法去除，理論上在發(fā)芽糙米制備的浸泡和萌發(fā)階段可能發(fā)生產(chǎn)毒真菌的爆發(fā)。因此，研究糙米萌芽過程中內(nèi)生真菌群落的變化對保障發(fā)芽糙米的食用安全具有重要意義。

目前對于糙米產(chǎn)制的工藝改進和營養(yǎng)增效方面的研究報道較多[10-12]，關(guān)于發(fā)芽糙米產(chǎn)制過程中的內(nèi)生真菌變化的研究鮮見報道。本實驗通過分析糙米萌芽過程中內(nèi)生真菌類群的變化，比較研究了種植地域和萌發(fā)加工過程對糙米中內(nèi)生真菌群落分布的影響，以期為糙米的加工處理、合理利用與風(fēng)險規(guī)避提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料來源于2018年從海南省和浙江省富陽市種植地收獲的粳稻品種日本晴，收獲種子自然晾干后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗儀器

PRX-80C型和PRX-600B型智能人工氣候箱，PCR儀T100TM Thermal Cyeler，電泳儀DYCZ-21，凝膠成像系統(tǒng)，漩渦混合器GL-88B。

1.3 糙米萌發(fā)、消毒

根據(jù)糙米萌芽產(chǎn)制的幾個階段將實驗材料分成原糙米組、浸泡組、萌發(fā)組、干燥組、消毒組，分別進行內(nèi)生真菌的分離，每組各選取150粒種子作為樣品。

原糙米組：選取相對飽滿無明顯病變的稻米研磨脫殼并表面消毒后進行內(nèi)生真菌的分離。

浸泡組：將表面消毒后的種子置于無菌水中，30 ℃培養(yǎng)箱浸泡24 h。

萌發(fā)組：將浸泡過的糙米均攤在經(jīng)消毒處理的鋪有2層濾紙的平皿上，加5 mL的無菌水，于30 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中持續(xù)發(fā)芽24 h。每24 h補充1 mL無菌水，保持濾紙濕潤。

干燥組：按照上述方法萌發(fā)后，用無菌水清洗3遍后放入烘箱，50 ℃干燥6 h。

消毒組：按照上述方法干燥后進行再次表面消毒進行內(nèi)生真菌的分離。

樣品表面消毒：按照參考文獻[13]對樣品進行表面消毒。用無菌水沖洗種子5次，接著分別用70%乙醇浸泡3 min、5%次氯酸鈉浸泡5 min、70%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗6次。取最后1次清洗液100 μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，作為檢驗種子表面徹底消毒的對照。如果對照培養(yǎng)基沒有菌長出，說明表面消毒徹底。

1.4 內(nèi)生真菌分離方法

根據(jù)文獻[14]，將表面消毒的樣品均攤到經(jīng)消毒處理的含有濾紙的平板上，然后用無菌的鑷子掰成2段，切面朝下半埋于PDA培養(yǎng)基中，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～10 d,待組織塊周圍長出的菌絲體后，在無菌條件下挑取菌絲接到新的PDA培養(yǎng)基上純化、編號、保藏。

1.5 內(nèi)生真菌的分子鑒定

將純化后的真菌續(xù)接到新的PDA固體培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)7 d。在無菌條件下，刮取足量的平板上的菌絲體到研缽中，用液氮充分研磨，然后采用CTAB法提取菌體DNA[15]，采用ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)引物進行PCR擴增[16]，擴增片段約550 bp。PCR反應(yīng)體系采用50 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer (含Mg2+) 5 μL，5 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL；rTaq酶 1 μL；補ddH2O至50 μL。PCR擴增條件：94 ℃保持5 min；32個循環(huán)(94 ℃ 45 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s)；72 ℃保持10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結(jié)果與GenBank中已知菌株的ITS rDNA序列進行用Blast比對，相似度大于97%的為同屬，大于99%的為同種。最后根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果確定分離菌株的分類地位。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

參考文獻[17,18]，將糙米內(nèi)生真菌的分離率( isolation rate，IR)、分離頻率(isolation frequency，IF)、margalef豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、均勻度指數(shù)及Sorenson相似性指數(shù)(Cs)進行統(tǒng)計，分析內(nèi)生真菌的多樣性及分布特征。分離率用于衡量樣品中內(nèi)生真菌的定植豐度和每個組織塊受侵染的發(fā)生頻率[5]。分離頻率指某一特定類型真菌的菌株數(shù)量占分離培養(yǎng)的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量的百分率，可用于判斷優(yōu)勢菌群；Shannon-Wiener指數(shù)和 Margalef指數(shù)被用于分析內(nèi)生真菌的菌群多樣性；均勻度指數(shù)用于分析菌群在樣品中分布的均勻程度；Sorenson相似性指數(shù)用于比較不同樣品內(nèi)生真菌菌群組成的相似程度[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 糙米萌芽過程中內(nèi)生真菌的分離鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)特征將海南和富陽兩地的供試糙米樣品中分離到內(nèi)生真菌歸為63種(部分菌落形態(tài)見圖1)，經(jīng)序列鑒定后歸為3個綱，6個目，7個科，20個屬。其中海南組分離到30株，歸為3個綱，5個目，5個科，10個屬，包括彎孢菌屬(Curvularia)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)、枝孢屬菌(Cladosporium)、Pleosporales、球黑孢霉屬(Nigrospora)、球腔菌屬(Phaeosphaeria)、Letendraeahelminthicola、Setophoma、 擬層孔屬(Fomitopsis)。富陽組分離到48株內(nèi)生真菌，歸為2個綱，4個目，7個科，16個屬，包括彎孢菌屬(Curvularia)、球腔菌屬(Phaeosphaeria)、Ophiosphaerella、Setophoma、Dendryphiella、雙極霉屬(Bipolaris)、皮司霉屬(Pithomyces)、Edenia、附球菌屬(Epicoccum)、小球腔菌屬(Leptosphaeria)、黑孢屬(Nigrospora)、枝孢屬(Cladosporium)、鏈格孢屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、帚枝霉屬(Sarocladium)、葡柄霉(Stemphylium)。分離到的真菌大多是水稻種子中常見的真菌[19-22]，但未分離到稻谷儲藏過程中經(jīng)常導(dǎo)致稻谷結(jié)塊、出糙率低的真菌[23]，如黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)以及產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)[24,25]。這表明本次實驗選取的稻谷保藏較好。

注：上排為菌落正面圖，下排為菌落被面圖。圖1 部分分離的霉菌單菌落圖片

2.2 種植地域?qū)Σ诿變?nèi)生真菌群落分布的影響

許多研究者發(fā)現(xiàn)地域?qū)χ参飪?nèi)生菌的群落分布會產(chǎn)生影響[26-28]。因此，本研究對海南省和浙江省富陽市兩地的糙米內(nèi)生真菌群落多樣性進行了比較分析。

采用margalef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和均勻度指數(shù)評價糙米萌芽過程中內(nèi)生真菌的多樣性和分布特征。由表1可以看出，富陽組原糙米中分離的內(nèi)生真菌的margalef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和均勻指數(shù)較海南組更高。說明富陽組的內(nèi)生真菌多樣性組成更為豐富。從分離率上看，富陽種植地的原糙米中內(nèi)生真菌的分離率(8.42%)要遠遠高于海南種植地的分離率(1.88%)(表2)。因此，富陽種植地的糙米中內(nèi)生真菌的豐度更高。

表1 不同種植地的糙米在萌芽過程中的內(nèi)生真菌多樣性指標(biāo)

按照IF>10%的內(nèi)生真菌為優(yōu)勢菌[29]。由表2和圖2可知：海南組糙米中獲得的內(nèi)生真菌歸為10個屬，優(yōu)勢菌屬為Curvularia、Cladosporium、Alternaria、Fusarium，分離頻率分別為26.67%、16.67%、13.33%、16.67%。富陽糙米中獲得的內(nèi)生真菌歸為12個屬(表2和圖2)，F(xiàn)usarium、Epicoccum、Dendryphiella為其優(yōu)勢菌株，分離頻率分別為13.86%、14.85%、44.55%。Fusarium為兩地的共同優(yōu)勢真菌，Alternaria為海南組特有優(yōu)勢菌株，Dendryphiella和Epicoccum為富陽組特有的優(yōu)勢菌株。因此，不同種植地的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)不同。

表2 糙米萌芽過程中內(nèi)生真菌的分離率、分離頻率

圖2 不同地域不同處理的水稻種子內(nèi)生真菌菌群屬水平組成及相對豐度

2.3 處理方式對糙米萌芽過程中內(nèi)生真菌群落分布的影響

Adams等[30]發(fā)現(xiàn)棉花在種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育過程中，遺傳學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性的差異會導(dǎo)致定殖的內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的差異。已有研究表明，水稻種子含水量的增加，有利于稻谷霉菌的生長[31]，當(dāng)濕度大于 95% 時鐮刀菌分生孢子的萌發(fā)率較高[32]。因此，以內(nèi)生菌多樣性和豐度更高的富陽產(chǎn)地的糙米為例，研究浸泡、萌發(fā)、干燥、消毒等處理方式對糙米萌芽過程中內(nèi)生真菌群落分布的影響。

從表1可以看出，富陽產(chǎn)地的糙米試樣在浸泡處理后內(nèi)生真菌多樣性指標(biāo)margalef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和均勻指數(shù)均下降，差異顯著，而萌發(fā)后的差異極為顯著。干燥、消毒處理后發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)生真菌的margalef指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和均勻指數(shù)也較原糙米顯著性降低，但較萌發(fā)組差異不明顯。

由表2 可知，富陽產(chǎn)地糙米經(jīng)過浸泡、萌發(fā)處理，內(nèi)生真菌總分離率逐漸增加；干燥后雖有所下降但較原糙米仍增加17%；消毒處理可顯著降低內(nèi)生真菌總分離率(較萌發(fā)后降低34.17%)。Fusarium、Epicoccum、Dendryphiella為其原糙米中的優(yōu)勢內(nèi)生真菌(分離頻率分別為13.86%、14.85%、44.55%)，且在浸泡、萌發(fā)、干燥后仍保持優(yōu)勢菌屬地位(圖2)。浸泡后，未分離到某些相對弱勢的內(nèi)生真菌如Nigrospora、Letendraeahelminthicola、Cladosporium、Setophoma。浸泡、萌發(fā)、干燥后，F(xiàn)usarium的分離率相比原糙米組分別增加10.75%、14.00%、16.33%，但Dendryphiella和Epicoccum的分離率變化不顯著。消毒處理后，糙米中Fusarium及Dendryphiella的分離率都顯著降低，但Epicoccum的分離率變化不明顯。不同的處理方式對內(nèi)生真菌的影響不同。究其原因可能有：不同的處理方式導(dǎo)致環(huán)境不能滿足某些菌群的定殖需求；宿主體內(nèi)處于相對優(yōu)勢的菌群Fusarium、Dendryphiella在合適的環(huán)境條件下可能產(chǎn)生具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物[9,33,34]逐漸占據(jù)競爭的絕對優(yōu)勢；宿主與某些菌株建立了互利共生關(guān)系。而以上推測尚需更多試驗證明。另外，F(xiàn)usarium可產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等毒素。因此，糙米浸泡、萌發(fā)、干燥處理存在固有優(yōu)勢內(nèi)生真菌甚至是有毒真菌爆發(fā)的可能性，消毒處理能有效減少內(nèi)生真菌的分離率。

由表3可知，富陽組浸泡與原糙米及萌發(fā)組的內(nèi)生真菌之間相似性為中等相似；干燥組與原糙米組的內(nèi)生真菌的相似性為中等不相似，與萌發(fā)組的內(nèi)生真菌的相似性為極相似；消毒組與與原糙米的內(nèi)生真菌的相似性為中等不相似，與干燥組內(nèi)生真菌之間相似性為中等相似。這進一步表明，不同的處理方式會影響糙米內(nèi)生真菌菌群的組成。

表3 富陽組糙米萌芽過程中的內(nèi)生真菌相似性系數(shù)

3 結(jié)論

本實驗從海南省和浙江省富陽市兩地的糙米萌芽過程中共獲得63株內(nèi)生真菌，經(jīng)ITS序列鑒定后歸為3個綱，6個目，7個科，20個屬，其中Fusarium為兩地共有的優(yōu)勢菌屬，Alternaria為海南組特有優(yōu)勢菌株，Dendryphiella和Epicoccum為富陽組特有的優(yōu)勢菌株，不同種植地糙米內(nèi)生真菌菌群多樣性和群落結(jié)構(gòu)不同。浸泡、萌發(fā)、干燥后處理后內(nèi)生真菌群落多樣性降低，但內(nèi)生真菌的分離率尤其是固有優(yōu)勢內(nèi)生真菌Fusarium的分離率增加顯著，存在內(nèi)生真菌甚至是病原菌爆發(fā)的可能性，消毒處理可有效減少樣品中內(nèi)生真菌的積累。本研究為糙米的加工處理、合理利用與風(fēng)險規(guī)避提供新思路。