張新超，胡玉敬，田叢娜，魏強，趙劍，楊雙臣，邊艷珠

1河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學科，石家莊 050051；2河北省兒童醫(yī)院CT磁共振科

整合素是由α亞基和β亞基兩個亞單位形成的跨膜糖蛋白，屬于細胞黏附分子家族，其在脊椎動物體內(nèi)廣泛表達并參與細胞黏附、增殖、分化、轉移、凋亡等生物過程。整合素αⅤβ3是整合素家族中的一員，在肺癌、乳腺癌、神經(jīng)源性腫瘤等惡性腫瘤的新生血管內(nèi)皮細胞中高表達，在正常細胞內(nèi)表達極低［1-3］。腫瘤細胞內(nèi)整合素αⅤβ3的表達與腫瘤浸潤、轉移等惡性表型有關，且其表達量與腫瘤惡性程度以及轉移浸潤特征相關，因此整合素αⅤβ3的表達水平可用于評估腫瘤的預后及評價治療效果。精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸多肽（RGD）是整合素αⅤβ3受體的天然配體，99Tcm-3PRGD2是新型RGD顯像劑，以雙價形式與整合素αⅤβ3受體相結合，是一種基于氨基酸代謝顯像的示蹤劑。99Tcm-3PRGD2對腫瘤的診斷表現(xiàn)出較高的特異度及靈敏度，尤其是在肺癌、乳腺癌的研究中已經(jīng)取得初步進展［4］，但關于其在骨轉移瘤的診斷及療效評價中價值的報道較少［5］。本研究組已在前期研究中對99Tcm-3PRGD2單光子發(fā)射計算機斷層（SPECT）顯像在骨移植瘤診斷中的價值進行 了 闡 述［5］，2017年1月—2021年12月，我 們對99Tcm-3PRGD2SPECT顯像在乳腺癌骨移植瘤大鼠放療療效評價中的價值進行了分析，以期為99Tcm-3PRGD2SPECT顯像評估骨轉移瘤放療效果奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料體質(zhì)量140～160 g清潔級雌性Wistar大鼠2只、體質(zhì)量200～250 g清潔級雌性Wistar大鼠50只均購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，Walker 256大鼠乳腺癌細胞購自河北醫(yī)科大學實驗中心。3PRGD2試劑盒由北京大學同位素中心提供，SPECT/CT儀為美國通用電氣公司Discovery 670 SPECT/CT儀，99Mo-99Tcm發(fā)生器購于北京原子高科技術有限公司。

1.2 動物建模與分組處理在2只體質(zhì)量140～160 g的Wistar大鼠腹腔內(nèi)接種Walker 256大鼠乳腺癌細胞，用于乳腺癌細胞增殖。1周后大鼠腹部膨隆，用無菌注射器抽取含有大鼠乳腺癌細胞的腹水并置于無菌離心管中1 500 r/min離心3 min，丟棄上清液后加入0.9 %無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度至1.0×108/mL備用。分別將50只體質(zhì)量200～250 g雌性Wistar大鼠于左后脛骨（距脛股關節(jié)面1.5 cm）處鉆取約1 mm2小孔，使用微量注射器向大鼠骨髓腔內(nèi)注入5 μL制備好的腹水混懸液（約5.0×105個腫瘤細胞）［6-7］。造模后第10、20及30天分別行大鼠脛骨CT掃描（管電壓120 kV，管電流100 mA，重建層厚0.625 mm）。成瘤標準［8］：CT示骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)密度減低區(qū)及骨皮質(zhì)斷裂、缺損。50只大鼠最終成瘤30只（5只死亡、15只未成瘤），成瘤率60%。將成瘤大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、低劑量放療組、高劑量放療組各10只，分別于骨移植瘤部位行直線加速器放療，放療方式為單次大劑量放療，劑量分別為0 Gy、5 Gy、25 Gy［9］。

1.399Tcm-3PRGD2的制備及放射化學純度檢測

將2 mL Na99TcmO4淋洗液加入到3PRGD2凍干品中進行標記并充分搖勻，將標記好的99Tcm-3PRGD2與大鼠血清混合于無菌安培瓶內(nèi)，置于37℃水浴鍋內(nèi)保溫，采用薄層紙層析法測定混合液1、2、4、6 h的放射化學純度。37℃溫育下混合液1、2、4、6 h的99Tcm-3PRGD2放射化學純度分別為97.6%、97.2%、96.1%、95.4%，均大于95%，提示99Tcm-3PRGD2制備成功。

1.4 骨移植瘤99Tcm-3PRGD2SPECT顯像及圖像分析各組分別于放療前及放療結束后第10天尾靜脈注射99Tcm-3PRGD2（0.2 mL，74 MBq），1 h后 行SPECT平面顯像［10］。采用GE Discovery 670 SPECT/CT儀進行SPECT顯像，探測器距離大鼠約3 cm，設置能峰140 keV，窗寬-20%～+20%，矩陣256×256，放大倍數(shù)2.0，采集時間15 min。采用Xeleris軟件進行圖像分析。由2名5年以上核醫(yī)學診斷經(jīng)驗的副主任醫(yī)師聯(lián)合分析圖像，計算骨移植瘤部位放射性計數(shù)與對側相應部位同等大小區(qū)域的放射性計數(shù)比值（T/NT），感興趣區(qū)約20 mm2，每個部位重復測量5次，取其平均值作為最終結果。

1.5 脛骨組織病理觀察采用HE染色。放療后第10天顯像結束后處死大鼠，截取各組大鼠脛骨組織，經(jīng)固定、脫鈣處理后，石蠟包埋，切片，加入蘇木素染液染色，分化液分化，返藍液返藍，梯度乙醇脫水，伊紅染液染色，脫水封片，顯微鏡下觀察脛骨組織病理改變。

1.6 骨移植瘤組織整合素αⅤβ3受體表達情況觀察采用免疫組織化學法。取各組大鼠骨移植瘤組織，沖洗、固定、脫鈣、石蠟包埋、切片，對腫瘤組織切片進行整合素αⅤβ3受體免疫組化染色，計算陽性細胞所占比例。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料行Bartlett方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗，具備方差齊性且服從正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組數(shù)據(jù)比較行單樣本方差分析，組間兩兩比較行SNK檢驗；T/NT與αⅤβ3受體陽性細胞表達的關系采用Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組99Tcm-3PRGD2SPECT顯像劑濃聚程度及T/NT比較各組放療前行99Tcm-3PRGD2SPECT顯像，骨移植瘤部位均可見顯像劑濃聚影，濃聚程度無明顯差異（OSID碼圖1）；對照組、低劑量放療組、高劑量放療組放療前T/NT分別為3.70±0.30、3.87±0.24、3.96±0.26，各組放療前T/NT比較無統(tǒng)計學差異。各組放療后第10天行99Tcm-3PRGD2SPECT顯像，病灶區(qū)域仍可見顯像劑濃聚，視覺觀察對照組顯像劑濃聚程度較前增加，低劑量放療組、高劑量放療組顯像劑濃聚程度均較前明顯減低，其中高劑量放療組減低程度更明顯（OSID碼圖2）；對照組、低劑量放療組、高劑量放療組放療后第10天T/NT分別為4.03±0.33、3.51±0.31、2.00±0.28，對照組＞低劑量放療組＞高劑量放療組（P均＜0.05）。

2.2 各組脛骨組織病理學變化比較HE染色顯示，三組脛骨組織內(nèi)均可見骨結構破壞，周圍散在腫瘤細胞，血管、神經(jīng)結構消失，符合骨腫瘤表現(xiàn)。對照組內(nèi)腫瘤細胞密度明顯高于低劑量放療組和高劑量放療組，低劑量、高劑量放療組內(nèi)可見大量腫瘤細胞壞死，其中高劑量放療組腫瘤細胞壞死更多。

2.3 各組骨移植瘤組織整合素αⅤβ3受體陽性率比較對照組、低劑量放療組、高劑量放療組骨移植瘤組織整合素αⅤβ3受體陽性率分別為67.12%±5.86%、42.96%±7.07%、32.41%±4.17%，對照組＞低劑量放療組＞高劑量放療組（P均＜0.05）。

2.4 T/NT與αⅤβ3受體陽性細胞表達的相關性Spearman相關性分析顯示，T/NT與αⅤβ3受體陽性細胞表達呈正相關（r=0.847，P＜0.01）。

3 討論

乳腺癌是女性好發(fā)腫瘤之一，骨骼是乳腺癌常見轉移部位，骨轉移往往預示腫瘤預后不佳。整合素αⅤβ3廣泛參與細胞間黏附和信號傳導，在腫瘤的轉移、侵襲方面起重要作用。99Tcm-3PRGD2特異性結合細胞表面的整合素αⅤβ3受體，并可以進行SPECT顯像。該技術可以用于對腫瘤新生血管的探測，并能夠對腫瘤微環(huán)境及形態(tài)的變化進行早期微觀及宏觀的評估。

乳腺癌腫瘤細胞表面高表達整合素αⅤβ3，這是99Tcm-3PRGD2SPECT顯像對乳腺癌進行診斷、治療效果評價的基礎。在以往的研究中，99Tcm-3PRGD2SPECT被發(fā)現(xiàn)對肺癌原發(fā)灶和骨轉移病灶具有良好的診斷性能［11］，但其用于評價骨移植瘤療效的報道國內(nèi)外均少見。此外，有研究發(fā)現(xiàn)99Tcm-3PRGD2SPECT顯像對肺癌骨轉移診斷價值高于99Tcm標記的亞甲基二膦酸鹽（99Tcm-MDP）SPECT，尤其是對溶骨性病變［12］。究其原因可能與99Tcm-3PRGD2SPECT顯像主要反應腫瘤活躍程度有關，而不是反應骨鹽代謝水平。整合素αⅤβ3成像還可以準確識別具有低18F-FDG攝取的腫瘤，但其機制目前尚不明確［13］。99Tcm-3PRGD2SPECT顯像診斷和評價骨移植瘤的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下兩點：第一，顯像主要針對腫瘤新生血管的探測，對骨折、骨質(zhì)退行性變等良性疾病往往表現(xiàn)為陰性，從而降低了假陽性率；第二，對單純?nèi)芄切圆∽儽憩F(xiàn)出較高的靈敏度，即診斷溶骨性病變較好，因其不依賴骨鹽的代謝水平，而是反應腫瘤的負荷程度，從而比常規(guī)的核素骨顯像更具優(yōu)勢。

本研究結果顯示，放療前各組骨移植瘤顯像劑濃聚程度及T/NT比較均無統(tǒng)計學差異。放療后對照組顯像劑濃聚程度明顯高于高、低劑量放療組，且低劑量放療組顯像劑濃聚程度高于高劑量放療組。三組T/NT比較對照組＞低劑量放療組＞高劑量放療組，與顯像劑濃聚程度等同。通過HE染色能夠觀察到各組大鼠骨脛骨組織均有不同程度腫瘤細胞浸潤，并可見骨質(zhì)結構破壞，對照組腫瘤細胞浸潤尤其明顯，而高劑量放療組壞死腫瘤細胞較多。骨移植瘤組織αⅤβ3免疫組化提示三組均可見整合素αⅤβ3受體陽性細胞表達，且對照組陽性細胞表達量最高、低劑量放療組次之、高劑量放療組最低。放療后，腫瘤細胞壞死，整合素αⅤβ3表達量下調(diào)，且隨著放療劑量的增加，整合素αⅤβ3表達量進一步降低，99Tcm-3PRGD2SPECT顯像劑濃聚程度及T/NT亦同步下降。Spearman相關性分析顯示，T/NT與αⅤβ3受體陽性細胞表達呈正相關。上述結果提示，99Tcm-3PRGD2SPECT顯像可以較準確地對大鼠乳腺癌骨移植瘤放療療效進行評估。

綜上所述，利用99Tcm-3PRGD2SPECT顯像對大鼠乳腺癌骨移植瘤放療療效進行評價的效果良好，且99Tcm-3PRGD2具有易標記、穩(wěn)定性好的特點，臨床實用性較高。但本實驗尚有不足之處，首先本研究中大鼠乳腺癌移植瘤成瘤率僅為60%，且大鼠骨移植瘤和真實的骨轉移瘤尚有區(qū)別；其次本研究沒有與其他影像學方法進行比較，如99Tcm-MDP骨顯像、18F-FDG PET顯像等，這也是我們?nèi)蘸筮M行對比研究的方向。