廖丁邦，陳水文，李鎮(zhèn)清

(1.暨南大學(xué)附屬深圳市寶安區(qū)婦幼保健院 兒科，深圳 518000；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 胸心外科，江蘇 南通 226000)

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)是一類革蘭陰性小桿菌，常定植于人類鼻咽部, 以流行性感冒致病菌的身份于1892年被費(fèi)佛醫(yī)生發(fā)現(xiàn)[1]。直至1933年流行性感冒的病毒性病原被發(fā)現(xiàn)后, 誤解才得以消除，但它的名字仍保留了“流感”二字。Hi生長要求高，人工培養(yǎng)時需加入血液成分(含血紅素Ⅴ或Ⅹ因子)才能生長，故名流感嗜血桿菌[2]。Hi是兒童時期呼吸道感染的重要病原菌，可導(dǎo)致多種感染性疾病(如肺炎、腦膜炎、中耳炎、菌血癥等)，和肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌并稱中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的三大致病菌[3]。b型流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzaetype b, Hib)曾是Hi侵襲性疾病中最常見的莢膜分型中的血清型，自Hib疫苗接種以來，其發(fā)病率顯著下降，并且出現(xiàn)了由其他莢膜分型中的血清型(a型、f型)和不可分型(無莢膜)流感嗜血桿菌(non-typeableHaemophilusinfluenzae，NTHi)引起的侵襲性感染[4]。NTHi是兒童最常見的中耳炎病原體之一，NTHi感染占急性中耳炎(acute otitis media, AOM)病因的25%～35%[5]。NTHi與老年人最常見的呼吸系統(tǒng)疾病——慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的發(fā)生、進(jìn)展高度相關(guān)[6-7]，是導(dǎo)致 COPD 患者病情惡化的最常見細(xì)菌。Hib疫苗廣泛使用后，NTHi感染的患者數(shù)量越來越多，使NTHi成為Hi感染的主要亞型。

既往對NTHi致病機(jī)制的研究呈現(xiàn)出各毒力因子相對孤立的狀態(tài)。隨著對細(xì)菌生物膜的深入研究，對Hi致病機(jī)制的研究呈現(xiàn)出系統(tǒng)化趨勢。NTHi生物膜與細(xì)菌蛋白質(zhì)、菌毛蛋白、脂寡糖(lipo-oligosaccharide, LOS)、環(huán)境脫氧核糖核酸(environmental deoxyribonucleic acid，eDNA)、細(xì)胞外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)等密切相關(guān)，它們除了協(xié)助NTHi定植、黏附、侵襲和免疫逃避外，還可以經(jīng)過相位變異(phase variation，PV)加速菌株之間基因的流動、信息的交換及營養(yǎng)物質(zhì)的獲取。生物膜是Costerton等[8]于1978年提出的，用于描述附著在生物或環(huán)境表面的微生物團(tuán)塊，隨后Donlan和 Costerton[9]將生物膜定義為附著在物體表面上的微生物群落。生物膜包括胞外聚合物質(zhì)(extracellular polymeric substance，EPS)、細(xì)菌自溶物質(zhì)。其中EPS主要由核酸(RNA和eDNA)、蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)等組成[10-11]。DNA結(jié)合蛋白II(DNA-binding proteins II，DNABII)通常與 eDNA相關(guān)聯(lián)，并且對于以eDNA作為基質(zhì)成分的生物膜的結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要[12]。與浮游微生物相比，生活在生物膜中的微生物對惡劣環(huán)境的抵抗力要強(qiáng)得多，并且對抗生素的抵抗力更強(qiáng)[13-14]，這主要是由于生物膜中抗生素滲透率有限及細(xì)菌代謝率降低[15-16]。除對抗生素的抵抗增強(qiáng)外，生物膜還可以通過降低多形核中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用使宿主產(chǎn)生較弱的免疫反應(yīng)[17]，有助于細(xì)菌的免疫逃避，從而使病原體能夠在未被免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的情況下滲透到組織中[18]。本文通過對NTHi生物膜的形成及其致病機(jī)制的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨在為Hi新型疫苗的研制、抗生素的使用、新型藥物的研發(fā)提供理論支持。

1 NTHi生物膜的構(gòu)成及功能

NTHi在體內(nèi)和體外均可形成生物膜。Langereis等[19]于2013年第一次證明了NTHi在呼吸道形成生物膜的能力。Mizrahi等[20]使用修飾的結(jié)晶紫染色確定了NTHi生物膜的形成。有研究表明，NTHi生物膜有助于引起持續(xù)的感染[21]。Baddal[22]研究發(fā)現(xiàn)NTHi生物膜EPS由DNA、eDNA網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)(包括外膜蛋白、DNABII、黏附素等)及LOS等組成。Das等[23]研究表明，Ⅳ型菌毛 (type Ⅳ pili, Tfp) 也是其組成部分。下面將對這些組成部分及功能進(jìn)行說明。

1.1eDNA及DNABII Devaraj等[24]不僅證實(shí)中耳炎栗鼠中耳部分和囊性纖維化患者的痰液中存在eDNA，還表明來自NTHi的DNABII與來自大腸桿菌的DNABII是同系物，它與eDNA中的Holiday交叉結(jié)合，從而使3種不同的人類病原體NTHi、大腸桿菌和表皮葡萄球菌形成的生物膜結(jié)構(gòu)達(dá)到穩(wěn)定。此團(tuán)隊還證明，DNABII家族(整合宿主因子和組蛋白樣蛋白)是NTHi形成生物膜EPS的關(guān)鍵組成部分，對于NTHi生物膜的結(jié)構(gòu)完整性、穩(wěn)定性至關(guān)重要[25]。研究還表明生物膜的eDNA可能通過電荷相互作用結(jié)合人β-防御素(human beta defensin-3，hBD-3)，從而抑制hBD-3殺死NTHi的能力，而隨著生物膜的成熟，eDNA豐度的增加可以最大限度地限制中耳內(nèi)新產(chǎn)生的抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)有效根除NTHi生物膜的能力[26-27]，從而增加生物膜的厚度。

1.2PV 包括NTHi在內(nèi)的多種黏膜相關(guān)病原體已經(jīng)進(jìn)化出快速適應(yīng)宿主的機(jī)制，稱為PV。它促進(jìn)了整個細(xì)菌基因組中眾多基因的協(xié)調(diào)調(diào)控，這種表觀遺傳調(diào)控可以是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(由ModA基因調(diào)控)的PV發(fā)生的。PV能調(diào)節(jié)NTHi對氧化應(yīng)激的敏感性、對中性粒細(xì)胞介導(dǎo)殺傷的抵抗力，這對于NTHi適應(yīng)、逃避宿主的免疫系統(tǒng)具有重要意義。除此之外，PV還能通過調(diào)節(jié)NTHi生物膜的生物量及其周圍eDNA及DNABII的量來影響生物膜的形成。PV對eDNA和DNABII具有調(diào)節(jié)作用，在堿性條件下，表達(dá)ModA2甲基轉(zhuǎn)移酶的NTHi生物膜比ModA2缺陷菌株形成的生物膜具有更大的生物量、更少的eDNA及獨(dú)特結(jié)構(gòu)。因此，PV除了能逃避免疫系統(tǒng)外還能調(diào)節(jié)生物膜的形成。關(guān)于NTHi的多個研究證明，穩(wěn)定的生物膜結(jié)構(gòu)有助于其定植，同時也是慢性感染不可或缺的因素[14, 28-29]。

1.3LOS及唾液酸 研究證明NTHi誘導(dǎo)的未成熟和成熟的生物膜都含有唾液酸化的LOS，適應(yīng)宿主的NTHi利用宿主的唾液酸作為碳源，利用外膜糖脂LOS的末端糖作為其營養(yǎng)物質(zhì)，并將這種糖結(jié)合到LOS中。LOS末端是血清中天然存在的免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)結(jié)合的靶標(biāo)，它可以利用宿主衍生的唾液酸 (Neu5Ac) 進(jìn)行唾液酸化，通過LOS唾液酸化可以減輕IgM的殺傷[30]。最新研究表明，NTHi已進(jìn)化為優(yōu)先利用N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)(非人類唾液酸)形式的唾液酸，這種適應(yīng)使 NTHi能夠逃避針對N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)的人類血清抗體反應(yīng)的殺傷作用[31]。因此他們在生物膜形成和免疫逃避中都具有重要作用。

1.4外膜蛋白 Gallaher等[32]發(fā)現(xiàn)由NTHi形成的生物膜EPS含有大量的細(xì)菌蛋白，包括1種高分子量蛋白(high molecular weight protein，HMW)1和3種主要的外膜蛋白(P2、P5 和 P6)。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，Hi黏附素(Hi adhesin, Hia)除了直接介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的黏附外，還可能直接與LOS上的唾液酸結(jié)合以介導(dǎo)細(xì)菌的相互作用并增強(qiáng)NTHi生物膜的形成和穩(wěn)定性，是生物膜形成的決定因素，因此生物膜可能通過Hia增強(qiáng)對抗生素的耐藥性，干預(yù)Hia可以在NTHi引起的侵襲性疾病中對預(yù)防生物膜的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用[33]。

1.5菌毛蛋白 NTHi的Tfp在細(xì)菌、細(xì)胞運(yùn)動中起著重要作用，使它們能夠附著并沿著生物組織或環(huán)境表面移動(抽搐運(yùn)動)，形成菌落和生物膜[34]。Tfp由Ⅳa型菌毛蛋白和Ⅳb型菌毛蛋白組成。Ⅳb型菌毛蛋白參與生物膜形成、細(xì)菌定植和對細(xì)胞的黏附[35]；Ⅳa型菌毛蛋白是細(xì)菌抽搐運(yùn)動和其他功能(如DNA 攝取)實(shí)現(xiàn)的分子框架[36]，它的靈活性、伸長率和收縮性確保了這些不同的功能的實(shí)現(xiàn)[37]。

1.6自身誘導(dǎo)物-2(autoinducer 2，AI-2) NTHi生物膜中的分形界面可以在空間位置捕獲由NTHi分泌的AI-2等分子，NTHi產(chǎn)生的AI-2的定位可能會為群體感應(yīng)產(chǎn)生空間反饋，它能參與生物膜基質(zhì)合成的糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，從而促進(jìn)了NTHi生物膜的成熟和生物膜完整性的維持[23, 38]。

1.7OMV 研究發(fā)現(xiàn)浮游細(xì)胞和生物膜均可釋放OMV，它是生物膜EPS的重要組成部分[39]。OMV是納米大小的球形雙層蛋白脂質(zhì)，它由包括NTHi在內(nèi)的各種革蘭陰性菌釋放，含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和代謝物[40-41]。研究證明，OMV參與革蘭陰性桿菌的營養(yǎng)吸收，能增強(qiáng)其耐藥性、促進(jìn)其與宿主的黏附及向宿主傳遞毒力因子[42]。OMV相互間還能傳遞遺傳信息，增加了B細(xì)胞對其他可溶性成分(如B細(xì)胞激活因子)的敏感性[39]。存在B細(xì)胞激活因子的情況下，NTHi的OMV強(qiáng)烈激活B細(xì)胞并誘導(dǎo)多克隆T細(xì)胞非依賴性免疫反應(yīng)，這可能會使宿主免疫反應(yīng)延遲。有研究結(jié)果表明，OMV可能與距離定植位點(diǎn)較遠(yuǎn)的免疫系統(tǒng)相互作用，這對宿主體內(nèi)的細(xì)菌存活非常有益[43]。最后，革蘭陰性菌的OMV和內(nèi)毒素誘導(dǎo)玻連蛋白釋放到支氣管肺泡間，有利于逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫清除[44]。

2 NTHi生物膜的致病機(jī)制

組成NTHi生物膜的成分多種多樣，其詳細(xì)的致病機(jī)制尚未研究清楚。目前對其致病機(jī)制的研究主要集中在抗生素耐藥和免疫逃避兩方面。

2.1抗生素耐藥 研究表明，與浮游生物相比，包括NTHi生物膜在內(nèi)的細(xì)菌聚集可以保護(hù)細(xì)菌免受抗生素的清除，而且細(xì)菌侵入人體組織細(xì)胞內(nèi)會導(dǎo)致抗生素治療失敗，這是因為在生物膜中抗菌劑滲透率有限以及細(xì)菌代謝率降低會增加細(xì)菌對抗生素的抗性，導(dǎo)致大多數(shù)常規(guī)抗生素?zé)o法以正常濃度作用于細(xì)菌[15, 45]。

2.2免疫逃避機(jī)制 NTHi的獨(dú)立致病因素，如人補(bǔ)體抑制因子H[46]、外膜蛋白P4[47-48]、HMW和Hia蛋白[49]、分泌型免疫球蛋白A1蛋白酶(IgA1 protease, IgA1P)[50]、LOS[51]、唾液酸[30-31, 52]、磷脂酰膽堿[53]等，可以減弱補(bǔ)體、抗體和中性粒細(xì)胞的殺傷作用，抑制炎癥反應(yīng)達(dá)到免疫逃避，詳見表1。NTHi生物膜除繼承了NTHi的獨(dú)立致病因素和免疫逃避功能外，還可以通過限制AMP對細(xì)菌的清除[26-27]、誘導(dǎo)多克隆T細(xì)胞非依賴性免疫反應(yīng)、延遲宿主免疫反應(yīng)與距離定植位點(diǎn)較遠(yuǎn)的免疫系統(tǒng)相互作用，提高細(xì)菌存活能力[43]。

3 NTHi導(dǎo)致的耐藥、免疫逃避的應(yīng)對方案

Hib疫苗顯著減少了Hib的鼻咽部定植，由于以莢膜多糖為靶抗原制成的Hib疫苗對NTHi菌株幾乎沒有交叉預(yù)防作用，NTHi感染的發(fā)病率逐漸升高，成為目前Hi感染的主要亞型，給易感人群(尤其是經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)的易感人群)帶來了巨大的危害[54-55]。

研究表明，(基因)工程化的 OMV可以在Hi表面展示完整的異源蛋白質(zhì)，并有效地觸發(fā)特異性抗體反應(yīng)，可用作疫苗的一種新的可行的抗原呈遞工具，以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，明確是否可以通過OMV研制相關(guān)疫苗預(yù)防NTHi感染的研究正在進(jìn)行中[56]。Bailey等[57]開發(fā)了一種與傳統(tǒng)疫苗不同的旨在介導(dǎo)生物膜破壞的疫苗，這種疫苗在起效過程中不會造成腸道微生物群失調(diào)。NTHi表達(dá)的LOS可以通過黏附和逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷來增強(qiáng)其毒力，進(jìn)一步加強(qiáng)對LOS的研究有利于新疫苗靶抗原和新抗生素靶點(diǎn)的鑒定，從而加強(qiáng)對Hi侵襲性疾病的預(yù)防和治療[58]。

由于目前疫苗覆蓋的Hi血清型有限，研發(fā)周期長、經(jīng)費(fèi)高昂且不能根據(jù)致病優(yōu)勢菌及時調(diào)整上市，再加上各國經(jīng)濟(jì)水平參差不齊，大部分發(fā)展中國家和落后國家負(fù)擔(dān)不起疫苗的接種，低廉易得的抗生素使用仍是治療Hi所致感染的最重要手段。舒巴坦、他唑巴坦、克拉維酸鉀是β內(nèi)酰胺酶抑制劑，與β內(nèi)酰胺類抗生素類藥物聯(lián)用能協(xié)同提高彼此的抗菌活性并擴(kuò)大抗菌譜。何萍等[59]研究表明，蘇州地區(qū)兒童革蘭陰性菌的耐藥率與β-內(nèi)酰胺酶的檢出率呈正相關(guān)，據(jù)此他們提出臨床上多應(yīng)用β內(nèi)酰胺類抗生素及β內(nèi)酰胺酶抑制劑合劑來減緩Hi的抗生素耐藥性。Mokrzan等[60]設(shè)想使用特異性誘導(dǎo)抗體聯(lián)合傳統(tǒng)抗生素來治療這些生物膜導(dǎo)致高度耐藥的Hi菌株，首先通過釋放NTHi抗體殺死細(xì)菌，如果免疫效果欠佳，則可同時輔以傳統(tǒng)抗生素將其殺死，這樣抗生素使用劑量減少、使用時間縮短，從而減少對人體組織、臟器的損害和口服抗生素的其他不良后果，如抗生素耐藥性的增強(qiáng)和腸道菌群的破壞。

為減少抗生素耐藥性的產(chǎn)生，除聯(lián)合使用抗生素、優(yōu)化抗生素治療方案外，人們正在尋求抗生素替代品。AMP可通過直接致死和免疫調(diào)節(jié)兩種主要方式來對抗細(xì)菌感染，有望用于治療多重耐藥菌株。但是，由于成本高、易被酶降解及對真核細(xì)胞具有細(xì)胞毒性等局限性使其在臨床應(yīng)用受限[61]。噬菌體可以通過分泌細(xì)胞壁水解酶、胞外多糖解聚酶等破壞細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)達(dá)到治療細(xì)菌生物膜所致疾病的目的，具有研發(fā)周期短、成本低、副作用少、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但其應(yīng)用仍主要停留在動物試驗階段，未在人體臨床試驗取得質(zhì)的突破，應(yīng)用于臨床的依據(jù)不足[62]。

根據(jù)NTHi生物膜的致病機(jī)制研究者們提出了不少新方法應(yīng)對其導(dǎo)致的免疫逃避和抗生素耐藥。近年來，除Hib外其他血清分型疫苗的研究進(jìn)展緩慢，加上疫苗從靶標(biāo)的提出驗證再到研制、試驗周期過于漫長，研發(fā)費(fèi)用高昂，未來研究的重點(diǎn)仍以降低抗生素耐藥率為主。雖然AMP、噬菌體替代抗生素治療細(xì)菌感染的觀點(diǎn)被提出并有人在動物試驗中對其進(jìn)行了驗證，但由于其局限性和人體試驗數(shù)據(jù)的缺乏使得它們難以推廣，因此仍需要設(shè)計相關(guān)動物、人體試驗對其進(jìn)行求證[61-62]。同時也要繼續(xù)加強(qiáng)對NTHi的生物膜形成和致病機(jī)制的研究，并提出更多切實(shí)可行的臨床防治方法來預(yù)防和治療NTHi侵襲性疾病，最后當(dāng)我們在西醫(yī)上遭遇瓶頸時，思維可以往中醫(yī)、中成藥方面延伸。