白小騰，孫曉紅，趙翔宇，李子堅(jiān)

(1.蘭州大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730030； 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 血液內(nèi)科， 甘肅 蘭州 730000)

淋巴瘤(lymphoma)是一類起源于淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma, NHL)。目前診斷淋巴瘤和評(píng)估腫瘤生物學(xué)特征仍然主要依賴于病變組織的組織病理活檢?；瘜W(xué)治療前的疾病分期以及治療后的疾病評(píng)估主要依賴影像學(xué)檢查，如超聲、X線計(jì)算機(jī)體層成像(computed tomography, CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)及正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(positron emission tomography/computed tomography, PET/CT)等。組織病理活檢有些情況下面臨著取材困難的問題，而影像學(xué)評(píng)估始終面臨敏感性不足和對(duì)腫瘤負(fù)荷精確定量比較的難題。另一方面PHOENIX[1]和RUBUST[2]研究的Ⅲ期臨床研究的失敗，提示目前基于細(xì)胞起源的病理分型不能準(zhǔn)確指導(dǎo)靶向藥物的治療，需要根據(jù)基因分型及相關(guān)的信號(hào)通路異常來指導(dǎo)各種分子靶向藥物在淋巴瘤治療中的應(yīng)用。

近年來，循環(huán)細(xì)胞游離DNA(circulating cell-free DNA, cf DNA)或循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)的分析，也稱為液體活檢逐漸受到重視。在21世紀(jì)精準(zhǔn)醫(yī)療的時(shí)代背景下，cf DNA檢測(cè)憑借其可對(duì)腫瘤進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、全面的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，同時(shí)還能夠克服傳統(tǒng)淋巴組織活檢取材困難的局限性等優(yōu)勢(shì)，迅速成為近年來研究的熱點(diǎn)，在腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷以及治療后監(jiān)測(cè)方面具有較高的臨床價(jià)值，尤其隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展成熟和成本大幅度下降，其在經(jīng)濟(jì)成本方面的劣勢(shì)明顯減小。因此，基于二代基因測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)對(duì)淋巴瘤cf DNA的檢測(cè)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)于淋巴瘤的診斷、基因分型、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、治療后評(píng)估、預(yù)后判斷具有越來越明顯的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。

1 cf DNA與ct DNA

Cf DNA，又稱無細(xì)胞DNA，屬于小片段雙鏈DNA, 這些DNA片段非常短[<200個(gè)堿基對(duì)(bp)],可存在于人的循環(huán)血清、血漿、尿液和其他體液中，由凋亡和壞死細(xì)胞釋放，在健康人群，正常器官組織來源的cf DNA中，淋巴樣細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的脫落DNA所占比例最大[3]。血液中循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ct DNA)是cf DNA的一部分，來源于壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞或吞噬壞死腫瘤細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，僅占外周血cf DNA總量的一小部分(有時(shí)<0.01%)[4]。cf DNA在健康人血清中的含量為0～100 ng/mL, 平均為30 ng/mL, 而在腫瘤患者血清中, 血清游離DNA的含量個(gè)體之間的差異比較大, 在0～1 000 ng/mL, 平均約為180 ng/mL[4]。因此通過對(duì)血液cf DNA的含量的檢測(cè)，對(duì)腫瘤早期診斷和治療后監(jiān)測(cè)具有顯著的價(jià)值。

2 淋巴瘤與cf DNA的關(guān)系

健康人血液中cf DNA濃度較低，而淋巴瘤患者體內(nèi)的cf DNA濃度明顯增加，分子生物學(xué)的研究證實(shí)，淋巴瘤患者血漿 cf DNA 具有腫瘤相關(guān)遺傳學(xué)改變，如微衛(wèi)星改變， IgH 和TCRγ基因重排，與淋瘤組織DNA具有相同的臨床意義[5]。相關(guān)研究表明，淋巴瘤患者血液cf DNA水平(約為健康人7倍)和淋巴結(jié)炎患者 DNA 水平(約為健康人2倍)與健康志愿者相比有差異。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)明顯增高的淋巴瘤患者血液cf DNA水平明顯高于LDH正常的患者，此研究提示血液cf DNA水平反映疾病增殖活躍[6]。在初治淋巴瘤患者、治療期患者和健康人體內(nèi)cf DNA水平的比較中，淋巴瘤患者初始階段的cf DNA濃度和完整性顯著高于治療階段的cf DNA濃度和完整性，并且治療期的cf DNA濃度顯著高于健康對(duì)照組的cf DNA濃度。但是，與健康對(duì)照組相比，治療階段的cf DNA完整性沒有顯著差異[7]。

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma, PCNSL)占非霍奇金淋巴瘤的2%～3%和中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的4%[8]。在25名PCNSL患者中，通過下一代基因測(cè)序(NGS)檢測(cè)PCNSL患者腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)ct DNA和腫瘤組織中相關(guān)腫瘤突變基因，檢測(cè)到基因突變匹配率分別為：MYD88 (80%)、PIM1(32%)、CD79B(28%)[9-10]。對(duì)6名疑似CNSL患者的腫瘤組織進(jìn)行了NGS檢測(cè)，同時(shí)和組織病理活檢診斷進(jìn)行了對(duì)比，使用NGS檢測(cè)的特異性和敏感度均為100%，此研究還使用數(shù)字PCR對(duì)CSF和血漿中ct DNA進(jìn)行了基因分析，CSF中cf DNA濃度明顯高于相應(yīng)的血漿樣品，同時(shí)指出，CSF中的cf DNA幾乎都來源于腫瘤細(xì)胞[10]。通過對(duì)腦脊液ct DNA的基因測(cè)序檢測(cè)，可以克服原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤腫瘤組織取材困難的問題，對(duì)腫瘤進(jìn)行基因分型，可以針對(duì)相應(yīng)的基因進(jìn)行靶向治療，同時(shí)還可以進(jìn)行微小殘留的監(jiān)測(cè)來識(shí)別疾病復(fù)發(fā)和指導(dǎo)患者預(yù)后評(píng)估。

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是最常見的侵襲性的非霍奇金淋巴瘤之一?；贜GS方法將16例DLBCL患者的血漿cf DNA和腫瘤組織進(jìn)行基因分析，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，cf DNA與腫瘤組織突變的等位基因的一致性為87.5%，表明cf DNA可以在大部分患者中代替?zhèn)鹘y(tǒng)組織活檢標(biāo)本用于基因分析[11]。通過免疫球蛋白基因的高通量測(cè)序(high-throughput sequencing of immunoglobulin genes Ig-HTS)方法對(duì)75例DLBCL患者的311份血漿ct DNA樣本進(jìn)行基因檢測(cè)，與PET-CT相比，ct DNA測(cè)序檢測(cè)的特異性更高(100%比56%)，但敏感性相似[12]。根據(jù)對(duì)DLBCL患者的免疫球蛋白受體基因重排的分析，與沒有檢測(cè)到ct DNA的患者相比，在監(jiān)測(cè)期間ct DNA陽性的患者臨床進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。此外，ct DNA監(jiān)測(cè)方法具有較高的陽性預(yù)測(cè)率(PPV 88%)和陰性預(yù)測(cè)率(NPV 98%)[13]。15例經(jīng)治療后血漿中可檢測(cè)到ct DNA的DLBCL患者的無進(jìn)展生存期(progress-free survival, PFS)比10例檢測(cè)不到ct DNA患者的PFS顯著縮短[14]。還可以通過ct DNA分析以區(qū)分惰性淋巴瘤的惰性狀態(tài)與組織學(xué)轉(zhuǎn)化(histological transformation, HT)。組織學(xué)轉(zhuǎn)化是惰性淋巴瘤轉(zhuǎn)化為侵襲性淋巴瘤。比較組織學(xué)轉(zhuǎn)化的濾泡細(xì)胞淋巴瘤(tFL)和濾泡細(xì)胞淋巴瘤(FL)之間的cf DNA基因組特征，發(fā)現(xiàn)tFL中單核苷酸變異的比例更高，ct DNA的含量也更高。盡管在進(jìn)一步的研究中應(yīng)驗(yàn)證ct DNA分析的效用，但本研究中計(jì)算出的PPV(91%)和NPV(80%)提示其能夠區(qū)分tFL和FL[14]?；贜GS對(duì)79例DLBCL患者的血清cf DNA分析發(fā)現(xiàn)87%的患者可以檢測(cè)到至少一種腫瘤相關(guān)基因突變，cf DNA檢測(cè)突變的敏感性為68%，在cf DNA樣本中發(fā)現(xiàn)的基因突變與組織樣本高度一致，并在43%的病例中可用于腫瘤的遺傳分類。另外，ct DNA水平與腫瘤負(fù)荷相關(guān)的臨床參數(shù)(乳酸脫氫酶和β2-微球蛋白血清水平、分期和國(guó)際預(yù)后指數(shù))和PET-CT評(píng)估的腫瘤總代謝體積顯著相關(guān)。在接受治愈性治療的患者中，高ct DNA水平(>2.5 log hGE/mL)與較低的完全緩解(65%比96%)、更短的無進(jìn)展生存期(65%比85%)和較低的2年總生存期(73%比100%)相關(guān)[15]?；贜GS對(duì)8例接受嵌合抗原受體T(CAR-T) 細(xì)胞治療后的難治或復(fù)發(fā)(r/r)DLBCL患者的血清及腫瘤組織樣本進(jìn)行了腫瘤相關(guān)基因分析，發(fā)現(xiàn)9份組織樣本的DNA測(cè)序與同一時(shí)間點(diǎn)血漿中的ct DNA結(jié)果基本一致，ct DNA檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因突變的敏感性和特異性分別為94.7%和83.3%，保持長(zhǎng)期完全緩解的患者與復(fù)發(fā)或?qū)AR-T治療無效的患者相比，其血漿ct DNA突變的中位數(shù)分別為3和14.3。在連續(xù)41個(gè)月的中位隨訪中發(fā)現(xiàn)，cf DNA監(jiān)測(cè)的趨勢(shì)與PET-CT一致，且與攜帶≥8個(gè)血清ct DNA突變的患者相比，攜帶<8個(gè)突變的患者生存期更長(zhǎng)。因此，ct DNA有望代替PET-CT在治療后用于DLBCL微小殘留的監(jiān)測(cè)，同時(shí)ct DNA測(cè)序的便利性還可以在PET-CT檢查間期實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步促進(jìn)DLBCL的精確治療[16]?；贜GS或PCR等技術(shù)通過對(duì)非霍奇金淋巴瘤患者外周血cf DNA的分析，在治療前用于識(shí)別基因克隆類型及腫瘤負(fù)荷的定量；治療中用于判斷療效反應(yīng)的預(yù)后；治療結(jié)束后可以用于識(shí)別腫瘤清除率及預(yù)判整體生存和復(fù)發(fā)率；對(duì)于完全緩解的患者用于識(shí)別疾病復(fù)發(fā)[17]。當(dāng)然，在cf DNA檢測(cè)過程中受腫瘤自身特性、實(shí)驗(yàn)條件及標(biāo)本等各方面因素的影響，也存在假陰性和假陽性的概率，因此還需大量的臨床數(shù)據(jù)，根據(jù)不同腫瘤制定相應(yīng)的可信區(qū)間，為淋巴瘤的標(biāo)準(zhǔn)化診療提供新的更有效的檢測(cè)方法。

霍奇金淋巴瘤主要發(fā)生于青年人，老年人少見。多數(shù)來源于生發(fā)中心B細(xì)胞。經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤占所有霍奇金淋巴瘤的95%。其中兒童霍奇金淋巴瘤占兒童惡性腫瘤的5%[18]。對(duì)于HL，cf DNA分析使用了NGS和數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(digital polymerase chain reaction, dPCR)，NGS用于監(jiān)測(cè)淋巴瘤免疫球蛋白基因突變區(qū)段，數(shù)字PCR用于XPO1熱點(diǎn)突變的分析，研究表明霍奇金淋巴瘤的鏡影(Reed-Sternberg, RS)細(xì)胞所產(chǎn)生的ct DNA也可以在血漿中檢測(cè)到[19]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了霍奇金淋巴瘤ct DNA的基因分型，使用混合捕獲靶向下一代測(cè)序的方法對(duì)霍奇金淋巴瘤患者cf DNA進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)到RS細(xì)胞產(chǎn)生的ct DNA單核苷酸變異、插入/刪除、易位和 VH-DH-JH重排，在96例患者中，有72例患者在治療前可監(jiān)測(cè)到外周血cf DNA的突變，每個(gè)患者的基因變異數(shù)從1到21不等，帶等位基因頻率從0.6%到42%，突變基因中檢測(cè)到9個(gè)易位斷裂點(diǎn)，其中涉及JAK/STAT、NF-κB、PI3K信號(hào)傳導(dǎo)和抗原表達(dá)的基因最常受到影響，VH-DH-JH重排分析揭示了RS細(xì)胞大部分來源于生發(fā)中心B細(xì)胞[20]。同時(shí)在對(duì)49例正在接受化療的HL患者的研究中，43例ct DNA檢測(cè)陰性的患者，其正電子發(fā)射斷層掃描(FDG-PET)的評(píng)估也為陰性結(jié)果，在正電子發(fā)射斷層掃描顯示疾病持續(xù)存在的6例患者中，有5例患者ct DNA也為陽性。HL患者化療期間ct DNA的消失與FDG-PET陰性和患者長(zhǎng)期無進(jìn)展生存密切相關(guān)[20]。同樣，在34例經(jīng)典霍奇金淋巴瘤患者cf DNA的下降水平與PET/CT掃描腫瘤體積縮小范圍成正比[21]。因此cf DNA可能代替PET-CT用于治療期間疾病的評(píng)估及腫瘤負(fù)荷的測(cè)量，同時(shí)也可以代替組織活檢用于基因分析，進(jìn)一步指導(dǎo)靶向藥物的選擇和研發(fā)。

3 淋巴瘤ct DNA的檢測(cè)方法

3.1 免疫球蛋白VDJ基因測(cè)序(variable-diversity-joining rearrangements sequencing, VDJ-seq)

每個(gè)B細(xì)胞來源的淋巴瘤細(xì)胞都攜帶了一個(gè)單一型的免疫球蛋白VDJ基因，該克隆型重排可以作為一個(gè)“條形碼”樣的標(biāo)志，通過簡(jiǎn)單的外周血樣迅速檢測(cè)以及時(shí)發(fā)現(xiàn)疾病是否復(fù)發(fā)。VDJ基因克隆型高通量測(cè)序技術(shù)(VDJ-seq)可以較大范圍預(yù)測(cè)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)患者的復(fù)發(fā)，甚至比常規(guī)影像學(xué)所確定的復(fù)發(fā)早數(shù)個(gè)月[12-13]。此外，VDJ-seq在診斷中可以揭示腫瘤活檢和血漿樣本之間克隆的差異性，血cf DNA高水平狀態(tài)似乎是一個(gè)可以定義高風(fēng)險(xiǎn)濾泡細(xì)胞淋巴瘤的強(qiáng)有力的因素[13, 22]。當(dāng)然，VDJ基因重排檢測(cè)也具有很大不足，如對(duì)于免疫球蛋白陰性表型的原發(fā)縱隔B細(xì)胞淋巴瘤，以及一些具有無效VDJ基因重排的DLBCL中無法檢測(cè)，同時(shí)該技術(shù)也不適合用于確定靶向治療的靶點(diǎn)以及監(jiān)測(cè)治療過程中抗性克隆的出現(xiàn)[23]。

3.2 二代基因測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)

目前，隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷深入發(fā)展，二代基因測(cè)序技術(shù)也逐步取代一代基因測(cè)序成為主流的基因測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)發(fā)展迅速，具有高通量、快速度、低成本的特點(diǎn)[24]。相比其他的基因測(cè)序技術(shù)，NGS無需基因克隆這一繁瑣的過程，而是將連接同一通用型高通量測(cè)序接頭的基因組DNA片段進(jìn)行高通量的并行PCR及測(cè)序反應(yīng)，所獲得的大量測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)高效能的計(jì)算機(jī)生物信息技術(shù)分析整合即可獲得完整的核酸序列信息[24]。近年來NGS也逐漸應(yīng)用于淋巴瘤的精準(zhǔn)診斷、基因異常、發(fā)病機(jī)制研究、化療后療效評(píng)估、預(yù)后評(píng)估和微小殘留的監(jiān)測(cè)等方面?；贜GS的深度測(cè)序(CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing, CAPP-Seq)方法實(shí)現(xiàn)了迄今為止ct DNA分析的最低背景錯(cuò)誤率和最低檢測(cè)限值[25]。在一項(xiàng)研究中對(duì)30例接受R-CHOP方案治療的新診斷的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者使用CAPP-Seq方法測(cè)序循環(huán)cf DNA，在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化治療方案有應(yīng)答的患者，循環(huán)cf DNA突變也可被迅速清除，而難治性DLBCL患者循環(huán)cf DNA突變持續(xù)存在，表明基于cf DNA測(cè)序檢測(cè)特征性基因突變對(duì)治療反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的有效性，敏感度達(dá)到90%，特異性達(dá)到100%[26]。使用CAPP-Seq方法對(duì)淋巴瘤患者治療前后cf DNA測(cè)序的同時(shí)使用PET-CT評(píng)估實(shí)體腫瘤大小，并比較兩者之間的相關(guān)性，從而對(duì)疾病進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[14]。總之通過NGS測(cè)序?qū)α馨土龌颊哐h(huán)cf DNA特異性基因異常進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可為淋巴瘤的早期診斷、治療后評(píng)估及微小殘留的監(jiān)測(cè)提供新的方法，但目前該技術(shù)尚沒有用于臨床診療，其具體的臨床應(yīng)用和意義還有待進(jìn)一步的研究和探索。

3.3 數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(digital, PCR)

雖然NGS技術(shù)的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本已經(jīng)較一代測(cè)序技術(shù)大為降低，但仍然價(jià)格不菲。數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(digital PCR)是近幾年新興的一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的核酸定量技術(shù)，只需要少量的血漿就可以對(duì)cf DNA進(jìn)行分析；因此，dPCR可以成為血漿cf DNA分析的工具之一。dPCR的優(yōu)點(diǎn)包括應(yīng)用迅速、成本效益高、快速和高靈敏度和特異性，使其成為特定熱點(diǎn)單核苷酸變異檢測(cè)的有力工具，可以作為NGS的重要補(bǔ)充[23]。在實(shí)驗(yàn)中將NGS和dPCR方案結(jié)合起來用于液體活檢，比較不同技術(shù)所需的成本和時(shí)間時(shí)，與NGS方案相比，dPCR工作流程方便的多，因?yàn)樗枰俚南钠泛椭苻D(zhuǎn)時(shí)間來監(jiān)視后續(xù)研究中的特定突變。此外，dPCR能夠準(zhǔn)確測(cè)定大量野生型DNA中的突變體DNA，即等位基因突變頻率低的DNA(> 0.1%)，通常用于NGS結(jié)果的獨(dú)立驗(yàn)證[27]。因此，dPCR可以聯(lián)合NGS用于淋巴瘤cf DNA基因變異的檢測(cè)，同時(shí)可以獨(dú)立應(yīng)用于NGS確定的特定核苷酸異常的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為淋巴瘤的基因診斷和ctDNA監(jiān)測(cè)提供了更多可供選擇的方案。

4 問題與展望

綜上，淋巴瘤特別是DLBCL等高侵襲性淋巴瘤的基于細(xì)胞來源的病理分型已經(jīng)不能準(zhǔn)確指導(dǎo)靶向治療時(shí)代的藥物選擇，基于基因突變的基因分型對(duì)靶向治療選擇的意義日益突出。淋巴瘤的實(shí)體性決定病灶取材遠(yuǎn)不如白血病等循環(huán)性腫瘤方便，為基因分型診斷和微小殘留的檢測(cè)帶來困難。在診斷時(shí)采用NGS技術(shù)對(duì)組織和cf DNA進(jìn)行測(cè)序，鑒定特征性基因變異進(jìn)行基因分型，并在治療后的疾病監(jiān)測(cè)過程中利用dPCR技術(shù)檢測(cè)cf DNA中特定基因含量的變化，將是一個(gè)既經(jīng)濟(jì)又方便的淋巴瘤基因診斷和疾病監(jiān)測(cè)策略。當(dāng)然，目前對(duì)于多數(shù)淋巴瘤類型來講，對(duì)其基因變異特征以及特定基因變異類型的研究都未達(dá)到可以用來準(zhǔn)確定義疾病基因類型的程度，尚有很多工作要做。基于目前研究進(jìn)展，繼續(xù)開展淋巴瘤特征性基因變異的鑒定，并不斷開展研究分析驗(yàn)證其與淋巴瘤生物學(xué)特征、疾病預(yù)后的相關(guān)性，進(jìn)一步制定基于NGS的基因分型策略和基于cf DNA的疾病監(jiān)測(cè)策略是進(jìn)一步研究的重要內(nèi)容。