黃丕英，蔡 錕，韋良婉，王星媛，王 哲，儲引娣， 范恩國

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 病原生物學系 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

革蘭陰性菌V型分泌系統(tǒng)分為Va-Ve亞型，由乘客結構域或蛋白質(passenger domains or proteins)和β-桶狀結構域組成[1]，因其結構簡單而被廣泛應用在生物工程領域。其中Vb亞型的乘客蛋白與β-桶狀結構域是分離的，通常稱為雙組分轉運系統(tǒng)(two-partner secretion， TPS)[2]。其乘客結構域習慣被稱為TpsA(two-partner secretion protein A)，桶狀部分稱為TpsB[3]。

目前研究較多的是百日咳桿菌(Bordetellapertussis)的TPS系統(tǒng)[4]。其胞外蛋白絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin, FHA)[5]的前體FhaB，分子質量367 ku，由FhaC轉運至細菌表面，經加工形成230 ku的成熟蛋白[6]。對于FhaB如何由FhaC轉運至細胞表面的機制，目前還知之甚少。

為了解TPS系統(tǒng)的機制，需建立便捷的體外研究體系。前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)haC在體外能轉運37 ku的FhaB截短底物[7]。而FhaB的分子質量為367 ku，體外重組系統(tǒng)是否能轉運大分子質量的底物？利用已建立的離體重組系統(tǒng)，檢測其在體外是否能轉運更大分子質量的底物，探討該系統(tǒng)用于TPS機制研究的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

EscherichiacoliTrans5α感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài)(北京全式金生物技術有限公司)；pTrc99a質粒、FhaC的表達載體(德國弗萊堡大學Matthias Mueller教授饋贈)；FhaB*37、FhaB*60和FhaB*80的上下游引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；EasyTagTMEXPRESS 35S Protein Labeling Mix(PerkinElmer)(中國同福公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制：10×檸檬酸鹽緩沖液：20 mg/mL一水檸檬酸、131 mg/mL三水合磷酸氫二鉀、35 mg/mL四水合磷酸氫銨鈉、1 mg/mL七水合硫酸鎂。E1培養(yǎng)基：1×檸檬酸鹽緩沖液、除Met/Cys外濃度為100 μmol/L的18種氨基酸、0.4%葡萄糖。E2培養(yǎng)基：1×檸檬酸鹽緩沖液、除Met/Cys外濃度為100 μmol/L的18種氨基酸、2%甘油、0.25 mol/L蔗糖。

1.2.2 載體的構建：以載體pFJD12[8]為模板，擴增FhaB*37、FhaB*60和FhaB*80的DNA片段。FhaB*37的上游引物：5′-CCCTCATGAAAAAGAC AGCTATCGCGATTGCAGTGG-3′，F(xiàn)haB*37的下游引物：5′-CGGCTCGAGCATCATCATCATCATGTCGAC CCGTCGCGTCGCCGACAGC-3′；FhaB*60的上游引物：5′-CCCCGCTCAGCCTCAAGGGC-3′，F(xiàn)haB*60的下游引物：5′-GCCTTGTCGATCGATAGCATGATGAT GATGATGATGCTCGAGGGGG-3′；FhaB*80的上游引物：5′-CCCCGCTCAGCCTCAAGGGC-3′，F(xiàn)haB*80的下游引物：5′-TGCGCGGCGGATCCATGATGATGAT GATGCTCGAGGGGG-3′。利用BspHⅠ和XhoⅠ酶切位點，連接至pTrc99a載體，轉化入E.coliTrans5α感受態(tài)，測序驗證正確后轉化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)。

1.2.3 外膜的制備：FhaC的表達載體轉化E.coliBL21(DE3)，表達菌株接種至LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至A600=0.8左右，加入1 mmol/L IPTG誘導，37 ℃誘導2～3 h，收集細胞。具體的純化步驟見參考文獻[9]：裂解細胞后獲得含膜的組分，進行蔗糖密度梯度(0.77、1.44和2.02 mol/L 蔗糖)于4 ℃，25 000 r/min離心16 h。外膜是一層淡黃色的圓環(huán)，位于1.44 mol/L和2.02 mol/L之間的界面，使用緩沖液 (50 mmol/L三乙醇胺醋酸鹽緩沖液, pH 7.5，250 mmol/L蔗糖，1 mmol/L DTT) 溶解外膜。

1.2.4 原生質球的制備：5 mL含F(xiàn)haB*37、FhaB*60和FhaB*80的表達菌株在E1培養(yǎng)基(加100 μg/mL的氨芐青霉素和1 mmol/L 的甲硫氨酸和半胱氨酸)過夜培養(yǎng)后，8 000 r/min、離心2 min，棄去上清。沉淀用T/S緩沖液(100 mmol/L Tris/HCl, pH 7.5, 0.5 mol/L蔗糖)重懸成A580為4的溶液。分別加入等體積的L/E溶液(0.1 mg/mL lysozyme，8 mmol/L EDTA，pH 8.0)于上述離心管中，用移液槍輕緩吹打以形成均一的溶液，后立即置于冰上15 min。10 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入等體積的E2培養(yǎng)基并重懸均勻，然后置于冰上備用。

1.2.5 FhaB轉運的檢測：向制備好的原生質球中加入[35S]標記的甲硫氨酸/半胱氨酸、 ITPG誘導蛋白的表達，37 ℃，2 min。離心，上清加至含F(xiàn)haC的蛋白質脂質體，37 ℃孵育15 min。反應體系分成兩份，一份直接加入TCA進行沉淀，另一份加入蛋白酶K，25 ℃孵育25 min后，加入TCA進行沉淀。SDS-PAGE后，用磷屏檢測同位素信號。

2 結果

2.1 FhaB突變體的構建

周質中全長的FhaB的分子質量為367 ku(圖1)，由N端TPSD(N-terminal two-partner secretion domain)、長的重復的β-螺旋組成的長軸、成熟的C端結構域MCD(mature C-terminal domain)和前體結構域(prodomain)組成。前體結構域分子質量為147 ku，在周質空間被切除。在FhaB的DNA片段的上游將其自身信號肽的N端延長區(qū)替換成大腸桿菌OmpA的信號肽，在C端額外加入5個連續(xù)的甲硫氨酸以增強同位素信號，加入組氨酸標簽以作后續(xù)純化使用(圖1)。成功構建了分子質量為37、60和80 ku的FhaB截短突變體。

2.2 原生質球檢測FhaB*37分泌

FhaB*37的原生質球被同位素標記后，在3、10、30、90和120 min不同時間點取出相同量的原生質球。離心后的沉淀在圖2A中1～5泳道，檢測原生質球內的FhaB的情況，上清在6～10泳道，檢測從原生質球釋放的FhaB的情況。第1泳道中，在35～40 ku有3個主要的條帶。最大的條帶(分子質量約39 ku)在120 min的時候幾乎完全消失(泳道5)。隨著最大條帶逐漸消失，中間38 ku左右的條帶的強度在逐漸增加(圖2A1～5泳道)。37 ku的條帶在原生質球中含量較穩(wěn)定，是上清中唯一的主帶(圖2A 6～10泳道)，上清中該條帶的量在逐漸增加。

2.3 FhaC轉運FhaB*80

FhaB*37轉運試驗中，加入蛋白酶K處理后，仍能在37 ku處檢測到FhaB*37條帶(圖3A泳道2)，但當加入1% Trition X-100處理后，再用蛋白酶K 處理，則該37 ku條帶完全消失，故FhaB*37被FhaC蛋白成功轉運至脂質體內。設定轉運效率(transport efficiency)為蛋白酶K處理后條帶的強度與原生質球分泌的FhaB*37條帶強度的比值。經計算，F(xiàn)haB*37的轉運效率在58%左右。

The OmpA signal peptide (SP) was directly followed by the native FhaB SP that lacks its N-terminal extension； the N-terminal fragment of FhaB ends with a methionine repeat for an optimized radioactive labeling and a C-terminal His-tag for Western blot analysis and purification

圖1 FhaB結構示意圖
Fig 1 Schematic representation of the FhaB-truncations and modifications

A:expression of FhaB*37 in spheroplasts, 1-5 represent 3, 10, 30, 90, and 120 min time point, respectively, 6-10 are samples of supernatant from lanes 1-5; B:schematic diagram of FhaB release from spheroplasts, the solid circle represents the spheroplasts 1) harboring the cytosolic precursor of FhaB,2) upon secretion the signal peptide is cleaved off and FhaB remains associated to the periplasmic side of the inner membrane before 3)it is finally released into the periplasm

同理檢測FhaB*60的轉運。構建FhaB*60和FhaB*37帶組氨酸標簽的載體，用抗組氨酸標簽的抗體進行Western blot檢測(圖3B)，發(fā)現(xiàn)FhaB*37和FhaB*60電泳遷移率與理論一致(圖3A)。加入含F(xiàn)haC的蛋白質脂質體后看見有不被蛋白酶K降解的FhaB*60條帶(圖3A泳道5)，而且加入1% Triton X-100后，F(xiàn)haB*60的條帶經蛋白酶處理消失，故FhaB*60被FhaC成功轉運至脂質體內(圖3A泳道4～6)。計算FhaB*60的轉運效率為30%左右。

IPTG誘導原生質球表達FhaB*80突變體后，在70～100 ku觀察到FhaB*80條帶(圖3C,泳道1)。加入蛋白酶K后，含有FhaC 的蛋白脂質體體系中檢測到FhaB*80能被成功轉運(圖3C，比較泳道3和6)。

3 討論

雙組分系統(tǒng)廣泛存在于革蘭陰性菌，在細菌與環(huán)境的相互作用中有重要功能。TpsB 蛋白屬于Omp85超家族，該家族包括來源于細菌的BAM復合物中的BamA、線粒體的Tob55/Sam50、葉綠體的Toc75[10]。TpsA蛋白通常分子質量大，其如何由TpsB轉運出細胞的機制目前仍不清楚，亟需建立簡單有效的體系來研究該轉運機制。

目前研究比較多的TPS系統(tǒng)是Bordetellapertussis來源的FhaC和FhaB。本研究通過構建不同大小的FhaB突變體，使用含F(xiàn)haC的蛋白脂質體離體重組系統(tǒng)檢測轉運不同大小FhaB的能力，從而探討該系統(tǒng)用于研究TPS轉運機制的可能性。在使用FhaB*37原生質球分泌蛋白時發(fā)現(xiàn)，存在3條主帶。在圖2中120 min幾乎完全消失的條帶，推測是被信號肽切除的前體蛋白pre FhaB*37。而中間強度逐漸增加的條帶，推測是由于只切除了OmpA的信號肽形成。而在37 ku處的條帶為釋放的成熟FhaB*37，說明原生質球成功分泌出了FhaB*37(圖2B)。從實驗結果可以看出，構建的體外重組系統(tǒng)可轉運分子質量80 ku大小的底物蛋白。因而，該系統(tǒng)有望用于對FhaB分泌、加工機制的深入研究，并為其他TPS系統(tǒng)機制研究提供可行性。

雙組份系統(tǒng)中TpsA蛋白獨立于TpsB蛋白合成，因而在周質空間中需要有TpsA和TpsB的識別機制，同時需要TpsB的重復使用以轉運多個拷貝的底物[11]。TpsB蛋白的插膜需要BAM復合物，本體系中TpsA蛋白的轉運可以僅僅由TpsB蛋白完成。有假說認為BAM蛋白復合體(β-barrel assembly machinery)除了參與β-桶狀蛋白的折疊和插入外[12]，還參與了乘客結構域的跨外膜轉運[13]。體系中將TpsB制備成蛋白脂質體后， 可能因缺少BAM復合物的某些功能，或缺少足夠分子伴侶維持大分子質量TpsA蛋白的穩(wěn)定，因而該體系轉運大分子質量底物明顯低于小分子質量底物。將來在體系中會考慮優(yōu)化這些方面。

A:in vitro translocation experiment of FhaB*37, and FhaB*60, 1-3.represent translocation of FhaB*37 without PK, with PK, with PK and Triton X-100, respectively, 4-6.represent translocation of FhaB*60 without PK, with PK, with PK and Triton X-100, respectively; B:metal-affinity isolation of C-terminally His-tagged and radioactively labeled FhaB*37 (lane 1) and FhaB*60 (lane 2) using magnetic beads; C:in vitro translocation experiment of FhaB*80. FhaB*80 translocation without FhaC (lanes 1-3) or with FhaC (lanes 4-6), without IPTG (Lanes 1 and 4), with IPTG (Lanes 2 and 5), with IPTG and PK (Lanes 3 and 6)