陳 思，楊富國，彭紅軍，曹衛(wèi)樂，王振宇

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第991醫(yī)院 麻醉科， 湖北 襄陽 441000)

缺血性心臟病是臨床上常見的心血管疾病，主要是因?yàn)楣跔顒?dòng)脈狹窄或閉塞引起的心臟病，是導(dǎo)致心血管疾病死亡的主要原因之一[1]，對人類健康和生活帶來不便，因此，如何有效的減緩或避免心肌缺血/再灌注損傷引起的心血管疾病是當(dāng)前臨床上急需解決的問題。丙泊酚(Propofol, Pro)是一種短效的靜脈麻醉藥，化學(xué)名為2,6-二異丙基苯酚(2,6-Diisopropylphenol)，具有起效快、毒副作用少、蘇醒快等特點(diǎn)，在心臟、肝臟和腎臟等器官上具有保護(hù)作用[2-3]。Pro通過激活PI3K/Akt信號通路減緩缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)乳鼠心肌的凋亡[4]。c-Jun氨基末端激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶(JNK/p38 MAPK)通路在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制JNK/p38 MAPK可以減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，并促進(jìn)細(xì)胞的活力[5]。因此，本研究通過誘導(dǎo)建立心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧模型，探討Pro是否可以通過調(diào)控JNK/p38 MAPK通路發(fā)揮在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的作用，以及相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物公司)；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基(上海江林生物公司)；丙泊酚注射液(西安力邦制藥公司)；p38 MAPK通路抑制劑SB203580(Sigma Adrich公司)；MTT試劑盒、凋亡試劑盒(上海碧云天生物公司)；Bcl-2抗體、Bax抗體、cleaved caspase-3抗體、p-JNK抗體、p-p38 MAPK抗體、JNK抗體、p38 MAPK抗體和GAPDH抗體(北京中杉金橋生物公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、丙二醛(malondia dehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒和過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒(南京建成生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:將對數(shù)期心肌細(xì)胞H9c2分為對照(control)組；缺氧/復(fù)氧(A/R)組：在95% N2、5% CO2進(jìn)行缺氧處理3 h，在37 ℃、5% CO2的條件下進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)6 h；缺氧/復(fù)氧+Pro低、中、高劑量(A/R+Pro-L、A/R+Pro-M、A/R+Pro-H)組：將Pro分別為12.5、25、50 μmol/L時(shí)添加在心肌細(xì)胞H9c2內(nèi)，然后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理；缺氧/復(fù)氧+Pro+p38 MAPK通路抑制劑(A/R+Pro+SB203580)組：將Pro濃度為50 μmol/L和p38 MAPK通路抑制劑SB203580濃度為15 μmol/L添加在心肌細(xì)胞H9c2內(nèi)，然后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理。

1.2.2 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集各組心肌細(xì)胞H9c2，將細(xì)胞(1×106個(gè)/mL)接種至6孔板內(nèi)。嚴(yán)格按照凋亡試劑盒說明書的指示，加入相應(yīng)的緩沖液重懸細(xì)胞后，加入5 μL annexin V-FITC和PI混勻，遮光反應(yīng)15 min，置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡。

1.2.3 Weatern blot檢測Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和JNK/p38 MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá):收集各組心肌細(xì)胞H9c2，加入RIPA蛋白裂解液用于提取細(xì)胞的總蛋白。在100 ℃沸水變性10 min，取上樣蛋白在10%的SDS-PAGE進(jìn)行分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉處理1.5 h，加入稀釋的Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-JNK、p-p38 MAPK、JNK、p38 MAPK和GAPDH抗體，4 ℃過夜孵育，加入二抗，室溫下孵育1.5 h，滴加化學(xué)發(fā)光液，顯影。以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白的表達(dá)。

1.2.4 ELISA檢測LDH活性、MDA含量、SOD活性和CAT活性:收集各組心肌細(xì)胞H9C2，離心后去細(xì)胞的上清液，參照LDH試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒和CAT試劑盒說明書的步驟，檢測LDH活性、MDA含量、SOD活性、CAT活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Pro對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和蛋白表達(dá)的影響

與control組相比，A/R組的細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與A/R組相比，A/R+Pro-L組、A/R+Pro-M組、A/R+Pro-H組的細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax、cleavedpase cas-3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖1，表1)。

2.2 Pro對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與control組相比，A/R組的LDH、MDA明顯增加(P<0.05)，SOD、CAT明顯降低(P<0.05)；與A/R組相比，A/R+Pro-L組、A/R+Pro-M組、A/R+Pro-H組的LDH、MDA明顯降低(P<0.05)，SOD、CAT明顯增加(P<0.05)(表2)。

A.apoptosis rate; B.apoptosis-related protein圖1 Pro對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和蛋白表達(dá)的影響Fig 1 Effect of propofol on cardiomyocyte apoptosis and protein expression induced by anoxia-reoxygenation

表1 Pro對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和蛋白表達(dá)的影響

表2 Pro對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Table 2 Effect of propofol on the oxidative stress of cardiomyocytes induced by anoxia-reoxygenation

2.3 Pro對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞JNK/p38 MAPK通路的影響

與control組相比，A/R組的p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)； 與A/R組相比A/R+Pro-L組、A/R+Pro-M組、A/R+Pro-H組的p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖2，表3)。

圖2 Pro對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞JNK/p38 MAPK通路的影響Fig 2 Effect of propofol on the JNK/p38 MAPK pathway of cardiomyocytes induced by anoxia-reoxygenation

2.4 加入JNK/p38 MAPK通路抑制劑對JNK、p38 MAPK蛋白的影響

與A/R+Pro組相比， A/R+Pro+SB203580組p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖3，表4)。

2.5 Pro通過調(diào)控JNK/p38 MAPK通路對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

與A/R+Pro組相比， A/R+Pro+SB203580組的細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)， 細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖4，表5)。

圖3 加入JNK/p38 MAPK通路抑制劑對JNK、p38 MAPK蛋白的影響Fig 3 Effect of JNK/p38 MAPK pathway inhibitor on JNK and p38 MAPK proteins

表3 Pro對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞JNK/p38 MAPK通路的影響

2.6 Pro通過調(diào)控JNK/p38 MAPK通路對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與A/R+Pro組相比，A/R+Pro+SB203580組的LDH、MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD、CAT活性明顯增加(P<0.05)(表6)。

3 討論

Pro是臨床上廣泛使用的一種烷基類麻醉劑，對心肌細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用，具有抗凋亡、抗氧化的作用[6-7]。Pro可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激[8]。Pro通過激活ERK1/2通路抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激[9]。Pro通過調(diào)控Sirt1/FoxO1通路減緩氯化鈷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷，促進(jìn)其細(xì)胞增殖[10]。本研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧組的細(xì)胞SOD、CAT活性受到抑制，促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡率、增加LDH、MDA含量，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，這表明模型構(gòu)建成功。經(jīng)過Pro處理細(xì)胞后，Pro各劑量組能夠促進(jìn)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的SOD、CAT活性，抑制心肌的凋亡率、減少LDH、MDA含量，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，這說明Pro可以減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

表4 加入JNK/p38 MAPK通路抑制劑對JNK、p38 MAPK蛋白的影響Table 4 Effect of JNK/p38 MAPK pathway inhibitor on JNK and p38 MAPK proteins

A.apoptosis rate; B.apoptosis-related protein圖4 Pro通過調(diào)控JNK/p38 MAPK通路對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

表5 Pro通過調(diào)控JNK/p38 MAPK通路對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

表6 Pro通過調(diào)控JNK/p38 MAPK通路對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

JNK是一種促進(jìn)分裂原活化的蛋白激酶，屬于MAPK家族的成員之一，JNK廣泛存在與細(xì)胞和組織內(nèi)，活化的JNK與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖及分化、細(xì)胞凋亡等過程有關(guān)；p38 MAPK也是MAPK家族的成員之一，可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等[11-12]。大量研究結(jié)果顯示JNK/p38 MAPK通路與心肌缺血/再灌注損傷相關(guān)，如ERK、P38的磷酸化水平在心肌缺血/再灌注的肝臟組織中高表達(dá)，下調(diào)JNK可以減緩缺血/再灌注肝臟損傷的程度[13]。鹽酸羥考酮可以減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制JNK/p38 MAPK通路有關(guān)[14]。右美托咪定可以通過抑制p38 MAPK通路促進(jìn)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力，抑制心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[15]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧組的p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)上調(diào)，經(jīng)過Pro處理p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)下調(diào)，說明Pro可以調(diào)控JNK/p38 MAPK通路的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加入p38 MAPK通路的抑制劑SB203580后，p-JNK、p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)下調(diào)，明顯增加細(xì)胞的SOD、CAT，抑制心肌的凋亡率、LDH、MDA，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，說明Pro可以通過抑制JNK/p38 MAPK通路發(fā)揮在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，Pro可以抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，這可能與抑制JNK/p38 MAPK通路有關(guān)。