陳秋霞，楊黎星，馬 瑞，趙永晶，王鈺鋮，鞠 瑞，郭 磊

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系，北京 100005)

胰腺癌(pancreatic cancer)是一種高度致命的惡性腫瘤，被診斷后患者5年內(nèi)的生存率在10%左右[1]。由于患者在癌早期階段癥狀表現(xiàn)不明顯，因此胰腺癌的早期診斷非常困難，即使通過手術(shù)治療后，預(yù)后情況也比較差。目前，胰腺癌的治療手段包括手術(shù)切除、輔助化學(xué)治療及免疫治療等[2]。吉西他濱則是術(shù)后輔助化學(xué)治療的標(biāo)準(zhǔn)一線化學(xué)治療藥物，但是吉西他濱耐藥問題日益成為胰腺癌輔助化學(xué)治療的突出問題。因此，探索克服胰腺癌吉西他濱耐藥的方法和策略對人類的生命健康具有重要意義[3]。

羧胺三唑乳清酸鹽(carboxyamidotriazole-oro-tate，CTO)是小分子抗腫瘤藥物羧胺三唑的乳清酸鹽形式。羧胺三唑是一種非電壓性鈣通道和鈣通道介導(dǎo)的信號通路的細(xì)胞抑制劑，具有抗癌，抗感染活性和抗血管生成作用[4]。研究表明羧胺三唑能夠抑制線粒體復(fù)合物I活性，降低腫瘤細(xì)胞氧化磷酸化水平從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[5]。產(chǎn)生化學(xué)耐藥性的胰腺癌細(xì)胞的代謝方式則發(fā)生明顯重編程現(xiàn)象，較對細(xì)胞毒類藥物敏感的胰腺癌細(xì)胞，產(chǎn)生化學(xué)耐藥性的胰腺癌細(xì)胞則有更高的糖酵解水平,而先天性耐藥的胰腺癌腫瘤干細(xì)胞則有更高的氧化磷酸化水平[6]。目前，CTO對胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞的影響尚不明確。本研究旨在探索胰腺癌耐藥株和敏感株在能量代謝上的差異以及CTO對胰腺癌耐藥細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步探究CTO在干擾胰腺癌耐藥株能量代謝上的作用機制，為進一步優(yōu)化胰腺癌耐藥問題的解決方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞株：人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株ASPC-1-GEM(哈靈生物,以下簡稱為AG細(xì)胞)。

1.1.2 藥品與試劑：CTO(MCE公司)；DMSO(Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；胎牛血清(Gibco公司)；磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B, SRB)細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑盒、annexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；XF Mito Stress Test Kit(Agilent公司)；NAD+/NADH檢測試劑盒(BioAssay公司)。兔抗LC3-Ⅱ單克隆抗體和兔抗P62抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：15%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基,在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)AG細(xì)胞。實驗分組為：對照組(control組)；給藥組(CTO)，CTO用DMSO配制成40 mmol/L母液,后用DMEM培養(yǎng)基配制不同終濃度CTO處理細(xì)胞。

1.2.2 SRB法檢測細(xì)胞活力：用DMEM高糖培養(yǎng)基進行AG細(xì)胞培養(yǎng)與傳代。在96孔板中接種AG細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞為2×106個/mL,每孔100 μL，分組給藥，給藥組以20和40 μmol/L CTO給藥，培養(yǎng)48和72 h。隨后棄去孔中的培養(yǎng)液，按照SRB檢測試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀上機檢測激發(fā)波長在515 nm處的吸光度值，并依據(jù)吸光度值計算細(xì)胞存活率。計算公式為存活率=(A-A空白)/(Acon-A空白)×100%。

1.2.3 CFSE染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分裂速度：用無血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基配制5 μmol/L的CFSE工作液備用。準(zhǔn)備1 mL AG細(xì)胞懸液，用不含血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106個/mL。取500 μL細(xì)胞懸液至15 mL離心管中，加入適量濃度的CFSE工作液。將離心管放入37 ℃培養(yǎng)箱中15～30 min。離心去上清，加入2 mL PBS溶液，重懸細(xì)胞，再離心去上清。加入DMEM(高糖)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，重新種板并分組給藥，藥物處理之后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分裂，激發(fā)波長為488 nm。

1.2.4 Annexin V/PI雙染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)增殖期的AG細(xì)胞接種于中皿中，2.0×105個/孔，隔天分組給藥。藥物作用48 h后收集細(xì)胞，PBS洗3遍。按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作，室溫避光孵育10～15 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，激發(fā)波長為488 nm。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞內(nèi)NAD+、NADH含量：取對數(shù)增殖期的AG細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，2.0×106個/皿，隔天分組給藥，藥物作用6 h后，收集細(xì)胞，調(diào)整各組細(xì)胞數(shù)目一致。按照NAD+/NADH檢測試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測定565 nm處的吸光度(A)值。

1.2.6 Seahorse生物能量實驗檢測細(xì)胞耗氧速率(oxygen consumption rate,OCR):取對數(shù)增殖期的AG細(xì)胞接種于24孔板中，1×105個/孔，隔天給藥，給藥組以20 μmol/L CTO給藥。藥物作用6 h后按照XF Mito Stress檢測試劑盒的說明書進行操作，使用Seahorse XF分析儀上機檢測。

1.2.7 Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達：取對數(shù)增殖期的AG細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，5×105個/皿，隔天給藥，給藥組以20 μmol/L CTO給藥。藥物給藥48 h后提取蛋白，并將提取出的蛋白溶液進行BCA蛋白定量。之后用Western blot檢測相關(guān)蛋白表達，具體步驟包括：SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、雜交與封閉、化學(xué)發(fā)光與成像，用Image J軟件進行吸光度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CTO抑制AG細(xì)胞存活

AG細(xì)胞與CTO共同孵育48和72 h后，與對照組相比，細(xì)胞存活率呈時間-劑量依賴性明顯降低(P<0.05，P<0.01和P<0.001)(圖1)。

2.2 CTO減緩AG細(xì)胞分裂

20 μmol/L CTO組熒光強度明顯右移，平均熒光強度明顯高于對照組(P<0.05)(圖2)。

2.3 CTO促進AG細(xì)胞凋亡

與對照組相比，10、20和40 μmol/L CTO組早期凋亡的細(xì)胞比例隨著藥物濃度明顯增加,20、40 μmol/L CTO組晚期凋亡的細(xì)胞比例隨著藥物濃度明顯增加(P<0.05或P<0.01)(圖3)。

2.4 CTO升高AG細(xì)胞內(nèi)NADH含量，降低NAD+/NADH比值

與對照組相比，20、40 μmol/LCTO組AG細(xì)胞內(nèi)NADH的量隨著劑量的增加顯著升高(P<0.05或P<0.001)。與對照組相比，20、40 μmol/L CTO組AG細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH的比值隨著劑量的增加明顯降低(P<0.01)(圖4)。

A.bar graph of survival rate of AG cells after being treated with CTO for 48 hours; B.bar graph of survival rate of AG cells after being treated with CTO for 72 hours; *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 compared with control group

A.division rate of AG cells by flow cytometry; B.bar graph of mean fluorescence intensity in AG cells after being staining with CFSE; *P<0.05 compared with control group

A.apoptosis of AG cells by flow cytometry; B.bar graph of early and late apoptotic AG cells; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

2.5 CTO能夠抑制AG細(xì)胞線粒體呼吸

在Seahorse生物能量實驗中，與對照組相比，20 μmol/L CTO組AG細(xì)胞的OCR降低，基礎(chǔ)呼吸值、剩余呼吸能力和最大呼吸值都明顯降低(P<0.05)(圖5)。

2.6 CTO降低AG細(xì)胞的LC3-Ⅱ、P62蛋白表達

與對照組相比，CTO給藥組明顯降低AG細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(P<0.05)(圖6)。

A.concentration of NADH in AG cells after being treated with CTO for 6 hours; B.concentration of NAD+ in AG cells after being treated with CTO for 6 hours; C.the radio of NAD+/NADH in AG cells;*P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.OCR data of AG cells after being treated with CTO for 6 hours; B.bar graph of basal respiration; C.bar graph of spare respiratory capacity; D.bar graph of maximal respiration;*P<0.05 compared with control group

3 討論

羧胺三唑是一種具有抗腫瘤作用的小分子化合物，而羧胺三唑的乳清酸鹽形式(CTO)能夠增加羧胺三唑的生物利用度，提高羧胺三唑的血藥濃度，從而達到低細(xì)胞毒性的效果[7]。本研究證實了CTO能夠通過減緩細(xì)胞分裂速率和促進細(xì)胞凋亡來抑制AG細(xì)胞增殖，并且呈時間-劑量依賴性。

胰腺癌發(fā)展進程中廣泛的代謝重編程與治療抗性有密切關(guān)系，這種代謝復(fù)雜性使胰腺癌細(xì)胞在各種應(yīng)激環(huán)境下通過線粒體呼吸獲取能量，保持存活。而有關(guān)不同亞群的胰腺癌細(xì)胞的代謝異質(zhì)性已有相關(guān)報道。非胰腺癌腫瘤干細(xì)胞是高度糖酵解依賴的，但胰腺癌腫瘤干細(xì)胞依賴于氧化磷酸化代謝 (oxidative phosphorylation，OXPHOS)[8]。因此，線粒體呼吸成為腫瘤治療上的一個新興靶點。本實驗室前期多項研究結(jié)果表明，羧胺三唑能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的線粒體呼吸[9-10]。本研究繼續(xù)探究CTO對胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞線粒體呼吸的作用，結(jié)果顯示CTO能夠降低AG細(xì)胞OCR、基礎(chǔ)呼吸值、最大呼吸值和剩余呼吸能力，并且能夠呈劑量依賴性地增加胞內(nèi)NADH的含量，降低NAD+/NADH比值，提示CTO能夠影響AG細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)復(fù)合物I對NADH的利用，造成細(xì)胞內(nèi)NADH蓄積抑制線粒體功能。已有文獻報道，在卵巢癌中對順鉑產(chǎn)生多藥耐藥性的腫瘤細(xì)胞有更高的自噬水平，自噬一定程度上也維持腫瘤細(xì)胞耐藥性[11]。自噬與線粒體功能密切相關(guān)，在關(guān)于炎性反應(yīng)的研究中表明線粒體功能障礙能夠誘發(fā)細(xì)胞自噬水平降低，從而加速細(xì)胞凋亡和壞死[12]。為了探究CTO作用之后線粒體功能障礙對AG細(xì)胞自噬水平的影響，通過Western blot實驗驗證CTO作用之后LC3-Ⅱ、P62在AG細(xì)胞中表達減少，提示CTO對AG細(xì)胞的自噬水平也有影響。

A.expression of LC3-Ⅱ,P62 proteins by Western blot; B.bar graph of LC3-Ⅱ, P62 proteins expression; *P<0.05 compared with control group

綜上所述，本研究初步證實CTO通過破壞線粒體呼吸功能造成胞內(nèi)NADH蓄積，減緩AG細(xì)胞分裂速率誘導(dǎo)AG細(xì)胞凋亡，降低自噬相關(guān)蛋白表達從而抑制AG增殖細(xì)胞。本研究為進一步探索在胰腺癌耐吉西他濱治療方法提供實驗依據(jù)，但同時也存在一定的局限性。自噬與腫瘤細(xì)胞的增殖有密切關(guān)系，本文關(guān)于CTO對AG細(xì)胞自噬的影響探討較淺，將會在日后進一步完善自噬與AG耐藥性及CTO減少AG自噬相關(guān)蛋白表達的機制探索。