杜雪梅，張運(yùn)梅，周文婷，呂 宏

(成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院 病理科， 四川 成都 610100)

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見的組織學(xué)亞型，其死亡率較高，5年總生存率低于20%[1-2]。盡管近年來對(duì)于肺腺癌的診斷和治療已經(jīng)得到了改善，但肺腺癌患者的預(yù)后仍然很差[3]。因此，更好地了解肺腺癌發(fā)生的分子機(jī)制將有助于確定有效的治療策略。據(jù)報(bào)道，miR-655-3p在頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞系中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲[4]，而驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員20A(kinesin family member 20A，KIF20A)在肺腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床分期、T分期及N分期顯著相關(guān)[5]。但miR-655-3p及KIF20A對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響鮮有報(bào)道，因此，本研究旨在探索miR-655-3p對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響以及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人肺腺癌細(xì)胞系H460、A549、HCC-2935、H1299及人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B(北京科瑞思搏生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑:miR-655-3p模擬物(miR-655-3p mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、KIF20A siRNA(si-KIF20A)及其陰性對(duì)照(si-NC)、KIF20A過表達(dá)物(OE-KIF20A)及其陰性對(duì)照(OE-NC)(ThermoFisher Scientific公司)；CCK-8 試劑盒(Bio-Rad公司)；TransStart?Green qPCR SuperMix(TaKaRa公司)；MMP-2、MMP-9、KIF20A、p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT、ERK1/2、PI3K、AKT、β-actin兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理: H460、A549、HCC-2935、H1299、BEAS-2B細(xì)胞在含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)增殖期的A549細(xì)胞，分組為：空白組、miR-NC組、miR-655-3p mimics組、si-NC組、si-KIF20A組、miR-655-3p mimics+OE-NC組、miR-655-3p mimics+OE-KIF20A組。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)A549細(xì)胞中miR-655-3p表達(dá)水平: 用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行RT-qPCR。用U6作為內(nèi)部參照，通過2-ΔΔCt檢測(cè)miR-655-3p表達(dá)。引物序列：miR-655-3p-F：5′-CCGCGATAATAC ATGGTTAACCTC-3′，miR-655-3p-R：5′-ATCTCGAGG CAGGGAGAGAGAGATAA-3′；U6-F：5′-GCCCATCTT GACCCGAAT-3′，U6-R：5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′。

1.2.3 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中蛋白表達(dá): 用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行定量后，通過10% SDS-PAGE電泳分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉PVDF膜1 h后，加入一抗KIF20A、MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT、ERK1/2、PI3K、AKT、β-actin，在4 ℃下孵育過夜。然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h。通過Image J軟件評(píng)估蛋白的吸光度值。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖: 按照1×103個(gè)/孔接種細(xì)胞于96孔板中。培養(yǎng)48 h后，加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)A549細(xì)胞遷移與侵襲: 遷移實(shí)驗(yàn)，在Transwell上腔室中加入不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液，下室加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，甲醛固定細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色后，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)。

侵襲實(shí)驗(yàn)，除在Transwell小室中預(yù)先加入Matrigel外，其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-655-3p與KIF20A的靶向關(guān)系: 分別構(gòu)建KIF20A的野生型(WT)和突變型(MUT)3′-UTR區(qū)質(zhì)粒，記為WT-KIF20A、MUT-KIF20A。將質(zhì)粒分別與miR-NC或miR-655-3p mimics共轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-655-3p在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

與BEAS-2B細(xì)胞比較，H460、A549、HCC-2935、H1299細(xì)胞中miR-655-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且miR-655-3p在A549細(xì)胞中的表達(dá)量最低，因此，選用A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究(圖1)。

*P<0.05 compared with BEAS-2B group圖1 miR-655-3p在不同肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 1 Expression levels of miR-655-3p in different lung adenocarcinoma cell n=6)

2.2 過表達(dá)miR-655-3p對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

與空白組和miR-NC組比較，miR-655-3p mimics組miR-655-3p表達(dá)顯著升高，細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 miR-655-3p靶向調(diào)控KIF20A的表達(dá)

使用targetscan預(yù)測(cè)miR-655-3p與KIF20A的結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告基因顯示，與miR-NC+WT-KIF20A組比較，miR-655-3p mimics+WT-KIF20A組熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P<0.05)(圖3B)。miR-655-3p mimics組KIF20A蛋白表達(dá)水平顯著低于空白組和miR-NC組(P<0.05)(圖4)。

2.4 下調(diào)KIF20A表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響

與空白組和si-NC組比較，si-KIF20A組KIF20A、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖、遷移、侵襲顯著降低(P<0.05)(圖5)。

2.5 過表達(dá)miR-655-3p或沉默KIF20A對(duì)RAS蛋白(rat sarcoma protein，RAS)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組和miR-NC組比較，miR-655-3p mimics組p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與空白組和si-NC組比較，si-KIF20A組p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖6)。

2.6 過表達(dá)KIF20A可抑制上調(diào)miR-655-3p表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞遷移與侵襲的影響

與miR-655-3p mimics組和miR-655-3p mimics +OE-NC組比較，miR-655-3p mimics+OE-KIF20A組KIF20A、MMP-2、MMP-9蛋白、細(xì)胞增殖、遷移、侵襲顯著升高(P<0.05)(圖7)。

2.7 過表達(dá)KIF20A可抑制上調(diào)miR-655-3p表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞中RAS/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與miR-655-3p mimics組和miR-655-3p mimics +OE-NC組比較，miR-655-3p mimics+OE-KIF20A組p-ERK1/2、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖8)。

*P<0.05 compared with blank group; △P<0.05 compared with miR-NC group圖2 過表達(dá)miR-655-3p對(duì)A549細(xì)胞中miR-655-3p表達(dá)(A)、細(xì)胞增殖(B)、遷移與侵襲(C，D)的影響

3 討論

miRNA在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色。例如，miR-655-3p通過靶向RAB1A抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移[6]；miR-655-3p在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，過表達(dá)miR-655-3p通過靶向下調(diào)PTTG1的表達(dá)，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移和侵襲[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-655-3p在肺腺癌H460、A549、HCC-2935、H1299細(xì)胞中低表達(dá)，且miR-655-3p在A549細(xì)胞中的表達(dá)量最低，因此，選用A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-655-3p可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。據(jù)報(bào)道，MMP-2和MMP-9屬于明膠酶類，在多種腫瘤組織中可檢測(cè)到MMP-2的激活，激活的MMP-2則促進(jìn)MMP-9活化，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-655-3p可抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，再次驗(yàn)證了過表達(dá)miR-655-3p可抑制細(xì)胞的遷移與侵襲。提示miR-655-3p在A549細(xì)胞中發(fā)揮著抑癌基因的作用。

A.the prediction result of targetscan; B.the verification result of dual luciferase reporter gene; *P<0.05 compared with miR-NC+WT-KIF20A group圖3 miR-655-3p靶向調(diào)控KIF20A的表達(dá)Fig 3 miR-655-3p targeted regulation of KIF20A

*P<0.05 compared with blank group;△P<0.05compared with miR-NC group圖4 Western blot檢測(cè)KIF20A蛋白表達(dá)Fig 4 Western blot was used to detect KIF20A

*P<0.05 compared with blank group;△P<0.05 compared with si-NC group圖5 下調(diào)KIF20A表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖(B)、遷移與侵襲(A，C)的影響

A.blank group; B.miR-NC group; C.miR-655-3p mimics group; D.si-NC group;E.si-KIF20A group; *P<0.05 compared with blank group;△P<0.05 compared with miR-NC group;▲P<0.05 compared with si-NC group

*P<0.05 compared with miR-655-3p mimics group;△P<0.05 compared with miR-655-3p mimics+OE-NC group圖7 過表達(dá)KIF20A可抑制上調(diào)miR-655-3p表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖(B)、遷移與侵襲(A，C)的影響

A.miR-655-3p mimics group;B.miR-655-3p mimics+OE-NC group;C.miR-655-3p mimics +OE-KIF20A group; *P<0.05 compared with miR-655-3p mimics group; △P<0.05 compared with miR-655-3p mimics+OE-NC group

KIF20A可參與有絲分裂紡錘體的形成和染色體的分區(qū)等不同的細(xì)胞過程[9]。最近的研究表明，KIF20A在膀胱癌組織中高表達(dá)[10]，其高表達(dá)與患者的預(yù)后差顯著相關(guān)；沉默KIF20A可抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移、侵襲和增殖[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-655-3p靶向負(fù)調(diào)控KIF20A的表達(dá)；下調(diào)KIF20A表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力；上調(diào)KIF20A抑制了過表達(dá)miR-655-3p對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響。

RAS-MAPK通路可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，據(jù)報(bào)道RAS與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signa1 regulated kinase,ERK1/2)結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，同時(shí)導(dǎo)致磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl-inositol 3 kinase，PI-3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)蛋白的磷酸化[12-13]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-655-3p或沉默KIF20A可抑制RAS-MAPK通路下游蛋白ERK1/2、PI3K、AKT的磷酸化水平，上調(diào)KIF20A抑制了過表達(dá)miR-655-3p對(duì)A549細(xì)胞中ERK1/2、PI3K、AKT蛋白磷酸化的影響，提示過表達(dá)miR-655-3p通過靶向下調(diào)KIF20A抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，該機(jī)制可能與抑制RAS/MAPK通路有關(guān)。

綜上所述，過表達(dá)miR-655-3p通過靶向下調(diào)KIF20A，抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，該機(jī)制可能與抑制RAS/MAPK通路有關(guān)。