唐競桐 綜述陳悅 審校

遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州 遵義 563006

真核生物及原核生物的核苷酸上均存在多種轉錄后修飾類型。一些存在于tRNAs及rRNAs上的核苷酸修飾同樣存在于mRNAs上[1-2]，包括7-甲基腺苷(methylguanosine，m7G)、6-甲 基 腺 苷(N6-methyladenosine，m6A)、5-甲基胞苷(5-formylcytidine，f5C)、4-乙酰胞苷(N4-acetylcytidine，ac4C)、甲基化胞嘧啶(methylated cytosine，Cm)、甲基化鳥嘌呤(methylated guanine，Gm)、甲 基 化 腺 嘌 呤(methylated adenine，Am)、5-甲基胞苷(5-methylcytidine，m5C)及假尿嘧啶(pseudouridine，ψ)修飾等[3-4]。作為第一種發(fā)現(xiàn)的核苷酸乙?；揎棧琣c4C是除m7G、m6A及f5C外同樣在mRNAs[5]上存在的另一種廣泛化學修飾類型[2]。

tRNA、rRNA和mRNA上的ac4C均由N-乙酰轉移酶10(N-acetyltransferase 10，NAT10)及其在不同物種上的同源酶所催化[5]。NAT10催化ac4C的形成需要乙酰輔酶A(acetyl-coenzyme A，CoA)提供乙酰基，ATP水解提供能量[6]。在tRNA的ac4C過程中，NAT10還需要含有THUMP結構域1(THUMP domain containing 1，THUMPD1)蛋白的輔助實現(xiàn)與tRNA的結合[7]。在rRNA的ac4C修飾中，NAT10需要小核仁RNA(snoRNA)的反義序列輔助與靶序列相結合[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，ac4C的存在有助于增加tRNA蛋白質翻譯的高保真[9-10]，并起到維持生物體耐熱性的作用[11-12]。在rRNA上ac4C的存在被發(fā)現(xiàn)是嗜熱微生物的重要特征[12]，對于維持蛋白質翻譯的準確性也很重要[7]。而在mRNA上，目前的研究表明ac4C對于維持其穩(wěn)定性及蛋白翻譯效率功能具有重要作用[5，13]。

在疾病條件下，ac4C的含量在人的體液中發(fā)生顯著改變。例如，與正常人群相比，在某些疾病患者的尿液中發(fā)現(xiàn)ac4C顯著上調，包括妊娠期糖尿病[14]、間質性膀胱炎(interstitial cystitis，IC)[15]、獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)[16]、泌尿生殖道腫瘤[17]、上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)[18]及乳腺癌等疾病[19]，提示ac4C很可能在疾病的發(fā)病及進展中發(fā)揮關鍵功能。本文總結了ac4C的研究歷史及其在調控基因表達及在人類多種疾病特別是在癌癥中的功能及機制，隨后展望了ac4C研究未來可能面臨的挑戰(zhàn)及相關核苷修飾對mRNAs相互作用的研究策略。

1 RNA乙酰化修飾的分類及ac4C

RNA乙?；嬖?種核苷酸修飾類型。其中，N6-乙酰腺苷(N6-acetyladenosine，ac6A)[20]及N4-乙酰-二氧甲基胞苷(N4-acetyl-20-O-methylcytidine，ac4Cm)[21]這兩種修飾類型偏好于嗜熱的古生菌上。與之不同，ac4C無論是在真核生物還是原核生物中均表現(xiàn)為一種更加保守的核酸化學修飾類型。ac4C的化學分子式為C11H15N3O6。通過三維X線衍射儀的方法，tRNA上發(fā)生核苷修飾ac4C的晶體結構證實，其N4位被乙?；〈奈恢每拷黷RNA的C端(即5’末)[22]。

2 不同種類RNAs上的ac4C

2.1 tRNA上的ac4C 1966年，ac4C在線 蟲的tRNA上被首次報道[23]。1972年，大腸桿菌(E.coli)延伸體蛋氨酸t(yī)RNA(methionine tRNA，tRNAMet)擺動位置處的ac4C修飾被發(fā)現(xiàn)[24]。隨后，ac4C被證實能夠通過穩(wěn)定核糖C3’末端構象的方式來輔助tRNA正確地閱讀密碼子[9，25]。ac4C修飾同樣在線蟲的亮氨酸t(yī)RNA(leucine tRNA，tRNALeu)上第12號位置[26]和在啤酒酵母的線蟲絲氨酸t(yī)RNA(serine tRNAs，tRNASer)上被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[27-28]。近期研究表明，在真核生物的tRNA上，ac4C僅能發(fā)生在其第12號位置上[27，29]。2004年，JOHANSSON等[30]發(fā)現(xiàn)了ac4C可在釀酒酵母中起到穩(wěn)定絲氨酸t(yī)RNA(tRNASer)的作用。

2.2 rRNA上的ac4C ac4C不僅能夠發(fā)生在tRNA上，在rRNA上也同樣發(fā)現(xiàn)了ac4C的存在。1978年，THOMAS等[31]發(fā)現(xiàn)ac4C可存在于大鼠18S rRNA的小亞基上，該研究首次表明了ac4C在真核生物18S rRNA上的存在。隨后，JOHANSEN等[32]在網(wǎng)柄菌18S rRNA的3’末端螺旋上也發(fā)現(xiàn)了ac4C修飾的存在。1993年，ΒRUENGER等[12]發(fā)現(xiàn)了四膜蟲5S rRNA上存在ac4C。在人的HEK293T細胞中，NAT10催 化18S rRNA第1 842位 置 上ac4C的 形 成[33]。SHARMA等[7]研究表明，在萌發(fā)的裂殖酵母和人HCT116細胞系的18S rRNA上發(fā)現(xiàn)了兩個ac4C修飾位點：一個在螺旋34處，該位點對于翻譯的準確性至關重要，而另一個則在螺旋45處，該位置位于解碼位點附近。

2.3 mRNA上的ac4C既往關于ac4C的發(fā)現(xiàn)主要集中于tRNA和rRNA上。近年來，研究發(fā)現(xiàn)大量的ac4C修飾同樣在人類及線蟲的mRNAs上被檢測到[2，5]。2018年，ARANGO等[5]首次報道了人類轉錄本上4 000多個區(qū)域上存在ac4C修飾。在人的Hela細胞中，ac4C被發(fā)現(xiàn)主要富集在編碼區(qū)(coding sequence，CDS)，且從轉錄本5’端至3’端，ac4C的含量逐漸降低[5]。2019年，TARDU等[2]亦報道了ac4C的含量在線蟲mRNA樣本中同樣具有較高的豐度，且ac4C修飾在氧化應激條件下可發(fā)生顯著上調。

3 調節(jié)ac4C的相關酶

2000 年，KUΒOKI等[34]從黑曲霉脂肪酶水解的過乙酰胞苷中提取了ac4C，這是一種與ac4C合成有關的高效酶。隨后發(fā)現(xiàn)釀酒酵母假定的tRNA乙酰轉移酶(Tan1)在tRNALeu和tRNASerac4C形成中發(fā)揮重要作用[30]。此外，OASHI等[24]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌延伸器tRNAMet上擺動堿基位置的ac4C可防止AUA密碼子的誤讀，以確保能夠準確識別AUG密碼子。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在乙酰輔酶A和tRNAMet存在的情況下，tRNAMet胞苷乙酰轉移酶(tRNAMet cytidine acetyltransferase，TmcA)可刺激ATP/GTP水解，進而催化細菌tRNAMet的擺動堿基處形成ac4C[6]。

NAT10是組蛋白乙酰轉移酶GCN5相關NAT(GCN5-related NAT，GNAT)家族的一員[35]。NAT10在其他物種中的同源基因包括DROME(黑腹果蠅)、SCHPO(粟酒裂殖酵母)、ARATH(擬南芥)、CAEEL(線蟲)[35]和Kre33(釀酒裂殖酵母)。NAT10是一種催化rRNA、tRNA和mRNA上ac4C形成的乙酰化酶。其中，催化tRNA和rRNA的ac4C分別需要輔因子THUMPD1和snoRNA的輔助。目前尚未發(fā)現(xiàn)催化mRNA形成ac4C過程中需要的輔因子。ITO等[33]發(fā)現(xiàn)Kre33是目前唯一同時具有乙?；附Y構域和RNA結合結構域的蛋白，因此其被認為是RNA的ac4C修飾酶。Kre33(NAT10的同源基因)催化釀酒酵母18S rRNA的1773位形成ac4C[36]。與NAT10相似，Kre33還催化1842位釀酒酵母18S rRNA(39)和線蟲12位酵母tRNALeu和tRNASer的ac4C形成[37]。此外，Kre33還需要Tan1基因在釀酒酵母tRNA在乙?；^程中與tRNA結合，這與人類NAT10和THUMPD1之間的協(xié)作過程類似[7，37]。Tan1和THUMPD1都有一個tRNA結合域，在熱自養(yǎng)嗜熱細菌中，MTH_RS04295(Tan1基因的同源基因)對于tRNA上ac4C的催化合成至關重要[35]。

ARANGO等[5]證明了人HeLa細胞mRNA中ac4C的存在，發(fā)現(xiàn)NAT10敲除的細胞系中mRNA中ac4C修飾水平發(fā)生明顯下降。在酵母中，ac4C的形成也與前體mRNA保留和剪接復合體(retention and splicing complex，RES)有關。研究發(fā)現(xiàn)，RES復合物高度保守，在 酵 母 中 由Βud13p、Snu17p和Pml1p組 成。Βud13p或Snu17p的缺失將導致tRNA中ac4C的顯著降低，而Pml1p的缺乏顯著降低了高溫條件下的ac4C水平。RES通過控制Tan1的前體mRNA的剪接效率影響Tan1的翻譯，進而調控tRNA上ac4C的形成[38]。TARDU等[2]發(fā)現(xiàn)，如果將酵母暴露于氧化應激條件下，其mRNA上可出現(xiàn)了大量的ac4C，而在Rra1(NAT10同系物)敲除后，即使在H2O2誘導下，酵母mRNA上幾乎檢測不到ac4C的發(fā)生；同時，高氧化應激條件下酵母mRNA中ac4C含量被發(fā)現(xiàn)顯著增加，提示ac4C很可能在氧化應激反應中發(fā)揮關鍵作用。

4 ac4C參與蛋白質的翻譯過程

4.1 ac4C幫助維持翻譯的保真性研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在大腸桿菌tRNAMMet反密碼子環(huán)中“擺動”位置(第34位)的ac4C可以幫助tRNA準確讀取非起始AUG密碼子[24]。tRNAMMet擺動位置的ac4C降低了tRNA對密碼子AUG的親和力，從而減少了蛋白質合成過程中密碼子的翻譯作用[25]。同時，擺動堿基位置的ac4C可穩(wěn)定核糖的C3’末端構象，從而促進了與CG堿基對的相互作用，保證了AUG密碼子正確解碼為蛋氨酸[9]。同時，KUMΒHAR等[10]發(fā)現(xiàn)ac4C的N4-乙?；鶄孺湹倪h端構象可能是避免蛋白質翻譯過程中異亮氨酸AUA密碼子錯誤解碼的重要原因。

4.2 ac4C提高翻譯效率及穩(wěn)定性近年來，ARANGO等[5]采用全轉錄組測序的方法研究了ac4C在人mRNA中的定位及其功能。該研究結果發(fā)現(xiàn)，ac4C主要富集在mRNA的CDS區(qū)，且發(fā)生ac4C修飾的mRNA擁有更長的半衰期。進一步發(fā)現(xiàn)含ac4C的mRNA主要富集到一個擺動位點C的密碼子上。熒光素酶報告基因檢測表明，擺動位點C密碼子的ac4C修飾顯著促進了蛋白質翻譯效率。該研究假設，ac4C或可通過增強堿基相關鳥苷的熱穩(wěn)定性來增強翻譯效率，影響mRNA翻譯過程中與同源tRNA的相互作用。

4.3 ac4C維持tRNA的穩(wěn)定性和細胞的高耐熱性研究發(fā)現(xiàn)，Tan1基因缺失的釀酒酵母突變體中ac4C和tRNASerCGA水平降低，提示ac4C和Tan1在維持成熟tRNASerCGA的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用[30]。XU等[39]證實酵母Tan1基因上催化位點的失活導致tRNA中ac4C的降低和tRNASerCGA豐度的下降。ΒRUENGER等[12]發(fā)現(xiàn)ac4C和ac4Cm存在于2株耐熱菌株(嗜熱嗜血桿菌和?；撬?5S rRNA的相同序列中，提示ac4C可能與高耐熱性有關。KAWAI等[21]分析了ac4Cm在極端嗜熱t(yī)RNA上的構象特征，發(fā)現(xiàn)胞嘧啶的2’-氧-甲基化及ac4C可穩(wěn)定tRNA的C3末內構象，導致極端嗜熱t(yī)RNA的產(chǎn)生。2019年，ORITA等[11]通過人工轉座子技術將突變隨機插入到嗜熱古細菌中，發(fā)現(xiàn)一些核苷修飾從tRNA上的消失會導致耐熱性差的突變體產(chǎn)生。然而，他們并沒有進一步觀察到缺乏ac4C的tRNA的發(fā)生熔點的顯著下降。上述證據(jù)均表明ac4C在維持tRNA的穩(wěn)定性中起重要作用，且與細胞的高耐熱性有關。

5 ac4C與多種疾病的發(fā)生發(fā)展

5.1 ac4C與炎癥反應DOSKOCIL等[40]發(fā)現(xiàn)包括ac4C在內的一些發(fā)生修飾的核苷類型，可促進焦土霉素對大腸桿菌的抗菌作用。據(jù)推測，這些核苷類似物可能通過競爭細胞表面細菌遺傳活性的核苷結合位點，進而抑制細菌增殖引發(fā)的炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，尿液中ac4C水平升高也可能與炎癥反應有關。PARSONS等[15]分析了62例IC患者和33例對照者的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)IC患者尿液ac4C的含量增加了24%。該研究還發(fā)現(xiàn)，高尿調蛋白水平與ac4C和其他代謝物水平降低相關。新近研究表明，尿調蛋白還可通過核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLR)家族(包含NLRP3等)觸發(fā)白細胞介素-1β(IL-1β)依賴性天然免疫[41]。炎癥反應中ac4C的含量也可在血漿中發(fā)生減少。LAGUNA等[42]分析了25例肺纖維化患者血漿樣本中的代謝情況，他們發(fā)現(xiàn)肺纖維化患者血漿中的5種核苷，如ac4C的水平明顯低于標準水平。此外，DUAN等[43]還發(fā)現(xiàn)ac4C可以興奮神經(jīng)膠質，誘導高遷移率族蛋白Β1(HMGΒ1)信號維持NLRP3神經(jīng)源性炎癥反應。上述證據(jù)表明，ac4C可能廣泛參與炎癥相關的人類疾病。

5.2 ac4C與代謝性疾病FURMAN等[44]發(fā)現(xiàn)大鼠ac4C和腺嘌呤水平升高與大鼠高血壓相關。ac4C和腺嘌呤聯(lián)合應用促進NLR家族Caspase募集結構域蛋白4(NLR family caspase recruitment domain-containing protein 4，NLRC4)基因的表達，激活NLRC4炎性小體，增加IL-1β的產(chǎn)生，進一步激活血小板和白細胞，從而升高血壓。他們推測，老年人群氧化應激的增強是由于加速了tRNA的分解，增加了ac4C修飾水平。研究表明，ac4C與妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)相關。LAW等[14]分析了27例中國GDM患者和34例正常孕婦的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)GMD患者尿液中的一些甲基化或修飾堿基(包括ac4C)顯著增加。為了探討尿毒癥與人核苷代謝的關系，NIWA等[45]比較了多組血清和尿液樣本中核苷代謝物水平的差異，包括10例健康人群(5例男性和5例女性)、11例未透析慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)患者(6例男性和5例女性)、17例血液透析(hemodialysis，HD)尿毒癥患者(9例男性和8例女性)和14例持續(xù)性非臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)尿毒癥患者(5例男性和9例女性)、他們發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，所有尿毒癥患者(尤其是CAPD患者)的ac4C的水平均顯著升高；此外，與正常對照相比，CAPD患者血清中ac4C水平升高幅度顯著大于HD患者，而未透析的慢性CRF患者尿液中ac4C含量明顯下降，說明尿毒癥患者RNA代謝發(fā)生改變，并導致包括如ac4C修飾在內的核苷異常積累[45]。

5.3 ac4C與自身免疫性疾病為探索進展性復發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化(progressive relapsing-remitting multiple sclerosis，PRMS)與核苷代謝產(chǎn)物的關系，ΒHARGAVA等[46]分析了18例健康個體和18例患者血漿中的代謝物，研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，代謝物ac4C在多發(fā)性硬化癥患者中顯著升高。尿液中核苷代謝水平與艾滋病存在關聯(lián)。ΒOREK等[16]比較了多組血清和尿液樣本中核苷代謝物水平的差異，包括14例患有AIDS癥狀的患者、21例診斷為AIDS的同性戀患者和52例未受累的雙性戀人群(18～60歲)。該研究結果顯示，在感染人類T細胞白血病-淋巴瘤病毒3型(human T cell leukemia-lymphoma virus 3，HTLV-3)和診斷艾滋病的患者尿液中，ac4C的水平顯著升高。這提示ac4C或可用于鑒定對AIDS的易感性。

5.4 ac4C與癌癥大量研究表明，ac4C在癌癥的診斷和治療中具有重要意義。THOMALE等[47]通過給小鼠注射單劑量致癌物3-甲基膽嘌呤后測定小鼠尿液中12種修飾核苷的排泄率。他們發(fā)現(xiàn)，晚期腫瘤小鼠排泄的核苷水平是正常小鼠的數(shù)倍。在腫瘤診斷前，其中的核酸組分(如ac4C)的排泄率顯著增加，而對照小鼠和接受致癌物注射但無腫瘤形成的小鼠的排泄值均無顯著變化。LIEΒICH等[48]發(fā)現(xiàn)癌癥患者尿液中的核苷明顯升高，其中，ac4C升高較普通核苷明顯，揭示出ac4C可能是診斷腫瘤的有效指標。SZYMANSKA等[17]檢查了160例泌尿生殖系統(tǒng)癌癥(urogenital cancer，UC)疾病患者和96例健康人的尿液樣本，他們發(fā)現(xiàn)，泌尿生殖系統(tǒng)癌癥患者尿核苷代謝物水平升高(ac4C增加25%)，這些尿苷可應用于UC的診斷。ZHANG等[18]對患者多組尿液標本進行代謝分析，其中術前EOC患者40例，術后上皮性卵巢癌患者18例，卵巢良性腫瘤患者62例，健康人53例。他們發(fā)現(xiàn)，術前卵巢上皮癌患者尿液中有22種代謝物標志物(包括ac4C)顯著增加，而且，18例接受手術的上皮性卵巢癌患者在手術7 d后尿液樣本中ac4C水平明顯下降，其中4例幾乎恢復到正常水平。LI等[19]發(fā)現(xiàn)17例ΒC患者尿液中4種代謝修飾因子水平明顯高于正常對照組的19種，他們還指出，通過ac4C用于診斷乳腺癌的受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)下曲線面積為0.825，提示ac4C可成為乳腺癌的潛在生物標志物。

6 展望

ac4C已在各種原核和真核生物的tRNA、rRNA上被檢測到。與之相比，有關mRNA的ac4C研究相對較少，未來需要通過更多的研究來探索有關mRNA上的ac4C修飾。當前研究表明，ac4C的形成與不同物種中NAT10及其同系物有關[2，5]。NAT10需要THUMPD1蛋白參與tRNA的ac4C形成，需要snoRNA的輔助情況下催化18S rRNA ac4C的形成[7-8]。然而，目前尚不清楚在mRNA中ac4C的形成中是否存在NAT10的其他輔因子。同時，亦不清楚ac4C在各種RNA中是否存在去乙?；瘷C制。

在人HeLa細胞中敲除NAT10后，mRNA中ac4C含量顯著降低，但mRNA上仍能檢測到約20%的ac4C修飾殘留[5]。而在Rra1敲除的酵母中，ac4C幾乎完全消失[2]。造成該結果的原因可能為HeLa細胞NAT10敲低并不完全，或提示在人mRNA中還存在參與ac4C形成的其他替代過程。另外，在mRNA上目前發(fā)現(xiàn)至少有15種核苷酸修飾的存在。其中，m6A和1-甲基腺苷(N1-methyladenosine，m1A)功能與ac4C相似，它們均可參與mRNA的翻譯過程，調節(jié)翻譯效率和mRNA的穩(wěn)定性[4-5，49-51]。然而，目前尚不清楚ac4C是否或如何與其他核苷修飾類型發(fā)生相互作用[5]。

ac4C參與基因表達調控過程，如基因翻譯、密碼子的配對識別。目前，ac4C被發(fā)現(xiàn)存在于tRNAMet的擺動和tRNASer的D臂tRNALeu上[5，28]。在人HeLa細胞mRNA中，ac4C峰似乎富集在編碼氨基酸的第三個密碼子中，從而提高其翻譯的效率和準確性[5，13]。然而，目前還沒有核苷分辨率圖譜證據(jù)支持這種富集，ac4C在第一和第二密碼子中的作用仍不明確[5]。在人類和酵母中，ac4C主要存在于具有poly-A尾的mRNA的CDS區(qū)域[2，5]。除CDS和UTRs處存在ac4C外，內含子區(qū)也存在ac4C，但內含子區(qū)的ac4C不受NAT10活性喪失的影響[5]。此外，尚不清楚mRNA和無poly-A尾的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是否存在ac4C修飾。其他高度穩(wěn)定的RNA，如環(huán)狀RNA和微小RNA(micro RNA，miRNA)中ac4C修飾的存在，未來也需要進一步的深入研究。

ac4C作為人類mRNA上的修飾類型之一，與許多人類疾病密切相關。但當前關于人類ac4C在mRNA中的發(fā)現(xiàn)是基于人的HeLa細胞來源。相關研究需要在更多的物種和其他細胞類型中去進一步闡述。另外，在真核生物中，ac4C修飾絕大多數(shù)被發(fā)現(xiàn)存在于mRNA上，且ac4C含量在氧化應激條件下發(fā)生顯著增加[2]。未來，需要進一步研究證實在患者尿液中ac4C含量的增加是否由于氧化應激所引起。另外，針對ac4C在疾病的診斷和治療中的特異性和敏感性需要進一步的大規(guī)模臨床研究來證實。相信隨著檢測方法的改進，ac4C對疾病的診治和預后的價值將得到更好的闡明，為人類相關疾病的預防和治療提供新的思路。