劉 述，丁 虹，趙可心，白 鋒，張小衛(wèi)*

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科； 2.蘭州大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院； 甘肅 蘭州 730030)

RNA剪接是從前體RNA分子中去除內(nèi)含子并將外顯子連接在一起形成成熟RNA分子的過程。這一過程主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，大致可分為組成性剪接和可變剪接。組成型剪接被認(rèn)為是默認(rèn)的途徑，所有內(nèi)含子從前體mRNA中移除，外顯子以與基因組轉(zhuǎn)錄相同的順序連接在一起。而可變剪接產(chǎn)生的外顯子可以在不同的組合中插入或排除，從而從單個(gè)基因中產(chǎn)生不同功能的RNA，高達(dá)95%的人類基因具有多外顯子可變剪接形式，這表明可變剪接是人類基因組功能復(fù)雜性中最重要的組成部分之一。

1 RNA結(jié)合基序蛋白介導(dǎo)的可變剪接概述

剪接是由剪接體進(jìn)行的，剪接體是一種大的核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體，主要存在于細(xì)胞核的剪接斑點(diǎn)中?？勺兗艚诱{(diào)控是由外顯子和相鄰內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)的順式調(diào)控元件介導(dǎo)的。順式調(diào)控元件可以通過招募與RNA分子結(jié)合并充當(dāng)反式作用因子的RNA結(jié)合蛋白來促進(jìn)外顯子的保留或剪切。

對(duì)可變剪接的適當(dāng)調(diào)控對(duì)細(xì)胞生理學(xué)很重要，與主要反映轉(zhuǎn)錄本豐富度的啟動(dòng)子活性不同，可變剪接影響mRNAs及其潛在編碼蛋白的結(jié)構(gòu)。因此，它會(huì)影響許多基因產(chǎn)物的結(jié)合特性、細(xì)胞內(nèi)定位、酶活性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和翻譯后修飾[1]。所以異常剪接可能導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和臨床表現(xiàn)。越來越多的疾病，如癌、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等都與可變剪接有關(guān)。然而，可變剪接的調(diào)控在心臟病研究中受到的關(guān)注相對(duì)較少。通過高通量測(cè)序和可變剪接分析，發(fā)現(xiàn)181個(gè)已知剪接因子中有47個(gè)在心力衰竭時(shí)上調(diào)。有趣的是，沒有觀察到剪接因子的顯著下調(diào)[2]。

RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein, RBP)參與RNA代謝的各個(gè)方面，包括剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和穩(wěn)定性[3]。任何特定的RBP與其底物的相互作用都是由RBP中的特定序列決定的，例如RNA識(shí)別基序、RNA結(jié)合基序、核糖核蛋白基序、富含精氨酸的基序、冷休克結(jié)構(gòu)域[4]和精氨酸-甘氨酸-甘氨酸盒等，而大多數(shù)RBP有多個(gè)RNA結(jié)合序列，這反映了一個(gè)蛋白質(zhì)與多種RNA分子結(jié)合的能力。RNA結(jié)合基序蛋白(RNA binding motif protein, RBM)，即RBM家族，由雨果基因命名委員會(huì)命名，均含有RNA識(shí)別基序、RNA結(jié)合基序以及核糖核蛋白基序；近年來的研究發(fā)現(xiàn)，RBM家族成員及其介導(dǎo)的可變剪接在一些疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，包括各種原因引起的心力衰竭。RBM家族成員介導(dǎo)的可變剪接與心肌疾病乃至心力衰竭相關(guān)研究目前主要集中在RNA結(jié)合基序蛋白20、24和25。

2 RBM20介導(dǎo)肌聯(lián)蛋白的可變剪接

編碼RBM20的RBM20基因已被初步鑒定為擴(kuò)張性心肌病(dilated cardiomyopathy， DCM)的連鎖基因之一[5]。RBM20是脊椎動(dòng)物特有的RNA結(jié)合蛋白，由1 227個(gè)氨基酸殘基組成，作為剪接因子相對(duì)較大，但它只有3個(gè)保守的可識(shí)別功能結(jié)構(gòu)域：兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)RNA識(shí)別基序型RNA結(jié)合域[6]。其在心臟和骨骼肌中高度表達(dá)，在2%～3%的家族性和散發(fā)性DCM病例中發(fā)現(xiàn)了RBM20基因異常[7]。對(duì)RBM20敲除的大鼠及存在和不存在RBM20突變的人類DCM患者的心臟轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)共發(fā)現(xiàn)了31個(gè)基因，這些基因的可變剪接在大鼠和人類中均依賴于RBM20。RBM20主要通過與目標(biāo)外顯子的上游和/或下游的內(nèi)含子結(jié)合來抑制盒式外顯子，包括TTN (Titin)和Ryr2基因中的那些外顯子。相互排斥的外顯子也在RBM20目標(biāo)外顯子中富集。例如，RBM20抑制外顯子15和16，并促進(jìn)編碼鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ-δ(CaMKⅡ-δ)的CAMK2D基因中的外顯子14。

RBM20是心臟特異性TTN pre-mRNA剪接的主要調(diào)控因子。在人類心力衰竭隊(duì)列中，內(nèi)源性RBM20的低表達(dá)與TTN基因的剪接模式相關(guān)。肌節(jié)是促進(jìn)橫紋肌收縮的基本結(jié)構(gòu)單位。肌聯(lián)蛋白(TTN)是肌節(jié)的一個(gè)重要組成部分。在結(jié)構(gòu)上，TTN起著生物彈簧的作用，橫跨肌節(jié)的一半，并將Z盤連接到M線上。心肌細(xì)胞中基于TTN的被動(dòng)張力占據(jù)了整個(gè)心肌的很大比例。它與TTN彈簧區(qū)的分子質(zhì)量或氨基酸序列長(zhǎng)度呈負(fù)相關(guān)。例如，在心肌中，有兩種主要的肌動(dòng)蛋白亞型表達(dá)：較短的N2B亞型只包含可變區(qū)中的N2B特有元件；較長(zhǎng)的N2BA亞型含有N2B和N2A特有的元件以及可變長(zhǎng)度的中間Ig重復(fù)結(jié)構(gòu)域，與N2BA相比，N2B具有更短的彈性區(qū)域[8]，因此給予心肌細(xì)胞更高的被動(dòng)張力。因此，人們認(rèn)為肌動(dòng)蛋白亞型的比例以及肌動(dòng)蛋白的總量影響心肌被動(dòng)張力[9]。N2B亞型與N2BA亞型的比例在不同的物種間及心房心室之間均不同，在發(fā)育過程中也是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的。在擴(kuò)張型心肌病心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭和慢性缺血性心肌病中，N2BA亞型的數(shù)量增加[10]，而在高血壓心臟病引起的舒張功能障礙中觀察到N2BA亞型的減少。

在動(dòng)物模型中，通過操縱TTN Pre-mRNA剪接來提高TTN的順應(yīng)性，可以扭轉(zhuǎn)舒張功能障礙，從而TTN剪接調(diào)控因子RBM20可以作為潛在的治療靶點(diǎn)。利用RBM20敏感的TTN剪接報(bào)告進(jìn)行了小分子化合物的高通量篩選證明卡烯內(nèi)酯部分地通過降低培養(yǎng)細(xì)胞中RBM20的蛋白水平來抑制RBM20介導(dǎo)的TTN外顯子的抑制[11]。

3 RBM24異常剪接引起心肌發(fā)育障礙

RBM24是一個(gè)進(jìn)化上保守的RBP，在其N-末端含有一個(gè)RNA結(jié)合基序。近年來的研究使它成為細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子和與人類疾病有關(guān)的潛在因子。雖然到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)人類RBM24基因突變與任何疾病有關(guān)，但其表達(dá)水平的不足可能與心肌疾病密切相關(guān)，在不同的動(dòng)物模型中已經(jīng)證明了該基因的關(guān)鍵作用。研究暗示脊椎動(dòng)物的RBM24似乎參與了幾乎所有方面的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。重要的是，在心肌和骨骼肌中，它是調(diào)節(jié)選擇性剪接以建立收縮功能的關(guān)鍵因素[12-14]。

剪接因子RBM24控制著大量的肌肉特異性剪接事件[15]。小鼠體內(nèi)RBM24的靶向失活擾亂了心臟發(fā)育，并導(dǎo)致胚胎在13.5 d左右死亡。這些胚胎顯示出多種心臟畸形，例如室間隔缺損，以及室壁的小梁減少和增加。然而，最引人注目的觀察是在突變的心肌細(xì)胞中肌節(jié)幾乎完全消失。這與斑馬魚的心功能喪失研究是一致的[16]， RBM24缺乏導(dǎo)致肌節(jié)蛋白減少，Z盤異常和心肌收縮力減弱[15]。對(duì)RBM24基因敲除小鼠心臟的RNA測(cè)序(在表型開始之前)和隨后的體外剪接分析顯示，RBM24至少控制68個(gè)剪接事件，主要是通過促進(jìn)肌肉特異性外顯子的保留。一些依賴于RBM24的剪接轉(zhuǎn)錄本在心臟發(fā)育、肌節(jié)形成、肥大或擴(kuò)張型心肌病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與心臟生物學(xué)相關(guān)的RBM24剪接靶基因包括Naca[16]、Fxr1、Abcc9、Slc25a3、Usp25和Usp28。然而RBM24敲除小鼠的胚胎致死性降低了其在成人心臟中的功能分析的可能。因此，為了闡明RBM24在成人心臟中調(diào)控的剪接事件，人們對(duì)RBM24條件性敲除等位基因的產(chǎn)生和分析充滿了極大的興趣。

RBM24作為關(guān)鍵的剪接調(diào)節(jié)因子對(duì)心臟早期發(fā)育必不可少幾乎已經(jīng)被明確[12, 17]。然而，出生后的心臟伴隨著重大的剪接變化。對(duì)出生后RBM24的功能進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)500多個(gè)與RBM24有關(guān)的調(diào)控不當(dāng)?shù)漠悩?gòu)體開關(guān)[14]，而其中大多數(shù)在研究心臟早期發(fā)育的研究中是沒有發(fā)現(xiàn)的[12, 17]。這些異常的異構(gòu)體開關(guān)可能導(dǎo)致生物力學(xué)和信號(hào)通路的改變，最終導(dǎo)致收縮受損、心力衰竭和出生后死亡。TTN即是其中之一，RBM24促進(jìn)了TTN外顯子11和13的保留，這兩個(gè)外顯子位于Z盤，參與肌原纖維的組裝、穩(wěn)定和維持。因此，RBM24基因的缺失可能導(dǎo)致RBM24基因缺陷小鼠Z盤內(nèi)細(xì)絲數(shù)量和分布減少，影響Z盤結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致心功能不全[14]。RBM24亦可能與p53 mRNA結(jié)合并與翻譯起始因子eIF4E相互作用，通過阻止eIF4E與p53 mRNA結(jié)合并抑制翻譯起始復(fù)合物的裝配來參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[18]。

4 RBM25介導(dǎo)鈉通道的可變剪接可引起心臟疾病

RBM25定位于核斑點(diǎn)，研究強(qiáng)烈提示它在前體mRNA的加工過程中起作用，并且這種調(diào)節(jié)是基因特異性的。對(duì)心力衰竭患者和健康對(duì)照人的心臟樣本進(jìn)行微陣列分析顯示LUC7L3和RBM25分別上調(diào)了1.7倍和1.5倍。RBM25的作用是由LUC7L3介導(dǎo)的，LUC7L3是一種酸中毒和低氧敏感的剪接因子，是酵母U1 snRNP相關(guān)因子的人類同源物，在mRNA前體剪接中起作用。LUC7L3有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)[19]。第一個(gè)使Pre-mRNA交聯(lián)，是LUC7L3剪接活動(dòng)所必需的。LUC7L3通過其第二個(gè)鋅指在Pre-mRNA和U1 snRNP之間起橋梁作用。RBM25選擇性地與LUC7L3結(jié)合，并通過與外顯子剪接增強(qiáng)子順式元件CGGGCA的相互作用激活剪接，如促凋亡的Bcl-xs 5′端等。

RBM25和LUC7L3共同介導(dǎo)了心臟鈉通道(sodium voltage-gated channel alpha subunit 5, SCN5A) mRNA的可變剪接，進(jìn)而引起一系列的心臟事件，如心力衰竭和心律失常，觀察整個(gè)SCN5A mRNA序列發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)到SCN5A剪接變異體的地方，RBM25只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[2]。凝膠電泳遷移率分析顯示，SCN5A外顯子28上的序列CGGGCA結(jié)合了RBM25，剪接調(diào)控因子的上調(diào)和下調(diào)證實(shí)了RBM25是必要的，也是足以導(dǎo)致SCN5A mRNA異常剪接的。事實(shí)上，心力衰竭會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)SCN5A變異體的增加，分別命名為E28C(39 bp)和E28D(114 bp)，SCN5A mRNA變異是由SCN5A末端外顯子(外顯子28)的隱性剪接序列剪接引起的。與全長(zhǎng)鈉通道相比，SCN5A變異體更短，編碼的鈉通道蛋白過早截短，沒有從結(jié)構(gòu)域Ⅳ、S3或S4到C末端的片段。

血管緊張素2(angiotensin2, Ang2)和低氧是LUC7L3/RBM25復(fù)合體上調(diào)和SCN5A mRNA剪接異常的信號(hào)。在人胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞(human embryonic stem cells-cardiomyocytes, hESCs-CMs)中，低氧使SCN5A變異體E28C和E28D的表達(dá)分別增加3.7倍和6.4倍，而全長(zhǎng)SCN5A轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)降低0.7倍。在Ang2作用下，SCN5A變異體E28C和E28D的表達(dá)分別增加2.9倍和4.3倍，而全長(zhǎng)SCN5A轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)降低0.8倍[2]。

這種異常的RNA剪接效應(yīng)可能是由于RAS激活而導(dǎo)致Na+通道啟動(dòng)子下調(diào)的相加作用。根據(jù)芯片分析和NF-κB亞基的過度表達(dá)顯示，Na+通道下調(diào)似乎是由p50/p65亞基與SCN5A啟動(dòng)子結(jié)合介導(dǎo)的[20]。這種的慢性效應(yīng)可能與之前報(bào)道的Ang2或氧化應(yīng)激的急性效應(yīng)相加，增強(qiáng)了Na+通道的功能障礙。因此，在與氧化應(yīng)激和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)激活相關(guān)的病理生理?xiàng)l件下，可能會(huì)對(duì)Na+通道產(chǎn)生多種急性和慢性的有害影響。

除了NF-κB對(duì)Na+通道啟動(dòng)子的直接作用外，該轉(zhuǎn)錄因子可能在可變剪接中發(fā)揮作用。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)是低氧時(shí)升高的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子。HIF-1α的啟動(dòng)子含有NF-κB結(jié)合元件，NF-κB是HIF-1α激活過程中的上游調(diào)控因子[21]。其中，HIF-1α mRNA調(diào)控剪接因子LUC7L3和RBM25，提示NF-κB激活可能是心臟氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)或低氧過程中該通道選擇性剪接的上游。

5 問題與展望

雖然已經(jīng)從遺傳學(xué)上證明了某些RBM(如RBM20)的突變導(dǎo)致了DCM，但隨后的心臟轉(zhuǎn)錄組分析和動(dòng)物模型均尚未確定RBM20所調(diào)節(jié)的其異常剪接與DCM的每一種癥狀(如收縮功能障礙、左心室擴(kuò)大和室性心律失常)密切相關(guān)的基因。將最新的全長(zhǎng)cDNA/mRNA直接測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于超長(zhǎng)TTN轉(zhuǎn)錄本，將有助于闡明RBM依賴的異構(gòu)體的精確剪接模式，有助于理解調(diào)控機(jī)制，闡明這些機(jī)制將有助于進(jìn)一步理解心臟特異的選擇性剪接調(diào)控，以及未來可能操縱RBM活性的治療方法。

高度的調(diào)控使選擇性剪接成為心臟病治療的潛在靶點(diǎn)。在干擾剪接的方法中，反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides, AONs)的使用備受關(guān)注[22]。AONs的設(shè)計(jì)方式是將它們綁定到特定的剪接序列以操縱剪接。是否可以通過針對(duì)可變剪接調(diào)控的靶mRNA中RBM的RNA識(shí)別元件設(shè)計(jì)的AONs來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)將是一件值得探索和期待的事情。