夏 濤，李夢(mèng)飛，張 雯，陳雪英，史銀連，王紅瑩，李 剛，祝 偉

（國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074）

0 引言

魔芋是中國(guó)中西部十余省市山區(qū)人民的重要經(jīng)濟(jì)作物，是山區(qū)人民的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源之一，魔芋粉是難得的優(yōu)良保健食品，據(jù)估計(jì)中國(guó)魔芋種植業(yè)的價(jià)值在2000億元以上，而近幾年來(lái)，受到魔芋軟腐病的危害，使得曾經(jīng)大規(guī)模種植的魔芋種植面積銳減，山區(qū)人民的收入受到了嚴(yán)重影響。雖然自20世紀(jì)80年代以來(lái)全國(guó)眾多的高校、科研院所投入了大量的人力和財(cái)力開(kāi)展了軟腐病的防治研究，但至今仍然沒(méi)有取得有效的技術(shù)方法來(lái)遏制軟腐病的發(fā)生和泛濫。

軟腐病是魔芋病害中影響最為嚴(yán)重的一種細(xì)菌性病害，公認(rèn)是由Pectobacterium引起的[1-2]，被認(rèn)為是阻礙魔芋加工業(yè)蓬勃發(fā)展的主要原因。軟腐病菌不僅在田間、而且在儲(chǔ)存期間都能對(duì)魔芋球莖侵染導(dǎo)致腐爛、造成重大損失[1-2]。魔芋軟腐病的病原菌包括Pectobacterium屬的胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)和菊果膠桿菌(P.chrysanthemi)[3-5]。早在1945年果膠桿菌屬被分類(lèi)為軟腐歐文氏菌屬的腐爛病原菌[3-4]，現(xiàn)在包含的菌株涵蓋了多種植物病原菌[4]，會(huì)引起這些植物的軟腐、莖腐爛、枯萎和黑腿病[4-5]。該病原菌是一類(lèi)營(yíng)腐生性寄生菌，可從寄主的自然孔口和外部傷口侵入，不過(guò)大多數(shù)病原菌最主要的侵染途徑是從機(jī)械傷口或蟲(chóng)傷侵入。雖然全球范圍內(nèi)已投入了大量人力物力進(jìn)行研究，但到目前為止，在防治魔芋軟腐病方面始終沒(méi)有突破性進(jìn)展，還沒(méi)有找到有效的防治技術(shù)方法。病原菌ZX67菌株分離自魔芋之鄉(xiāng)竹溪縣感染軟腐病的魔芋球莖深處，在此前研究中，依據(jù)細(xì)胞形態(tài)、生理生化、16S rDNA比對(duì)分析的結(jié)果將其鑒定為胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種(P.carotovorumsubsp.carotovorum)，為了能更好地研發(fā)魔芋軟腐病的有效防治方法，進(jìn)一步了解軟腐病病原菌的特性，在用酚-氯仿法提取了全基因組DNA后對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序和分析，為深入研究軟腐病的防治方法提供更豐富的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)于2019年9月—2021年11月在中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 菌株 從腐爛魔芋球莖深處分離出的病原菌胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種ZX67菌株。

1.2.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基。蛋白胨2.0 g，酵母提取物1.0 g，NaCl 1.0 g，H2O 200 mL，固體平板加1.5%瓊脂。121℃，滅菌25 min。

1.2.3 培養(yǎng)條件 固體平板和液體三角瓶均置于30℃培養(yǎng)24 h。

1.3 病原菌基因組DNA的提取方法

將菌株ZX67接種到50 mL液體培養(yǎng)基中，放置于30℃搖床200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，取菌液于離心管中在4℃、11000 g離心7 min，移出上清液，細(xì)胞沉淀加緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，1 mmol/L EDTA)重懸，按比例加入蛋白酶K(1 mg/mL)和SDS(10%w/v)于50℃保溫1 h破細(xì)胞，以堿裂解法抽提基因組DNA[6]，純化基因組DNA是使用酚-氯仿-異戊醇抽提、70%乙醇沉淀的方法，用瓊脂糖凝膠電泳和NanodropOne(Thermo Fisher Scientific,USA)測(cè)量光吸收值來(lái)評(píng)估純化的DNA純度、質(zhì)量和濃度。

1.4 全基因組測(cè)序及數(shù)據(jù)處理與分析

將提取的基因組DNA樣品利用第三代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序儀器為第三代測(cè)序儀PacBio RSII(Pacific Biosciences,USA)[7]。經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)合格后，使用建庫(kù)試劑SMRTbellTM Template prep kit 1.0完成對(duì)樣本的文庫(kù)構(gòu)建工作，用測(cè)序試劑盒DNA Binding kit P6 V2和DNA Sequencing Kit 4.0 V2進(jìn)行測(cè)序[7]。用de novo（基因組從頭測(cè)序）即在不需要任何參考序列的情況下，對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序，然后使用生物信息學(xué)軟件和分析方法對(duì)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和組裝。將蛋白序列基于BLAST與各數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(blastp,evalue≤1e-5)后得到對(duì)應(yīng)的功能注釋信息。所有的注釋均使用BLAST軟件結(jié)合各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的特點(diǎn)完成，目前已知基因功能的數(shù)據(jù)庫(kù)有KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)[8]，COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)[9]，GO(Gene Ontology) (http://geneontology.org/)[10]，NR(Non-Redundant Protein Database)[11]，Swissprot[12]，Trembl[13]，Pfam[14]。為了鑒定RNA基因，用tRNAscan-SE軟件預(yù)測(cè)得到tRNA[15]；rRNA分別由通過(guò)與近緣參考序列的rRNA庫(kù)比對(duì)，及使用rRNAmmer軟件預(yù)測(cè)得到[16]；sRNA首先基于Rfam軟件與Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋[17]，然后通過(guò)cmsearch程序進(jìn)行最終確定[18]。基于其序列組成，由IslandPath-DIOMB軟件預(yù)測(cè)得到基因島[19]，該軟件主要通過(guò)檢測(cè)序列中核苷酸偏向性和移動(dòng)性基因（如轉(zhuǎn)座酶或整合酶）來(lái)預(yù)測(cè)基因島及潛在的水平基因轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)座子主要由TransposonPSI軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，該軟件是基于PSI-Blast的同源比對(duì)來(lái)對(duì)基因組或者蛋白序列進(jìn)行轉(zhuǎn)座子預(yù)測(cè)的，適用于細(xì)菌和真菌。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PHAST軟件預(yù)測(cè)前噬菌體[20]。同時(shí)，分別使用RepeatMasker軟件[21]和TRF(Tandem repeats finder)軟件[22]對(duì)散在重復(fù)序列和串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。并采用CRISPRFinder對(duì)樣品基因組進(jìn)行CRISPR預(yù)測(cè)[23]。同時(shí)將測(cè)序得到的序列對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)后確認(rèn)基因組上存在的與降解細(xì)胞壁相關(guān)的酶基因和蛋白分泌系統(tǒng)，并查找與致病性相關(guān)的毒力因子[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌基因組DNA的提取和質(zhì)量分析

采用堿裂解法提取了菌株ZX67的基因組DNA，經(jīng)過(guò)反復(fù)純化后得到200 μL的樣品，取2 μL DNA樣品用于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在電泳后的凝膠上顯示所提取DNA條帶清晰完整（圖1），取1 μL該樣品在Nanodrop One上檢測(cè)，測(cè)得其DNA濃度約為107.6 ng/μL，質(zhì)量為21.5 μg，260:230為2.3，260:280為1.87，樣品質(zhì)量、濃度、純度均符合測(cè)序要求。

圖1 基因組DNA電泳圖譜

2.2 全基因組組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

從感染軟腐病的腐爛魔芋球莖中分離到的菌株ZX67，其16S rDNA序列與胡蘿卜果膠桿菌(P.carotovora)具有99%以上的同源性，P.carotovora在魔芋、土豆等許多植物中都能引起軟腐病[25]。利用pacbio rsii技術(shù)（單分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)）[26]對(duì)該菌株的全基因組進(jìn)行測(cè)序，用de novo進(jìn)行了組裝。最后得出的基因組參考序列總長(zhǎng)度為4,909,724 bp，GC含量為51.27%（表1）。組裝后，將原始數(shù)據(jù)與組裝后的參考基因組序列進(jìn)行比較，并計(jì)算參考基因組序列每個(gè)位置的覆蓋深度來(lái)評(píng)估基因組的完整性、裝配和排序均勻性，從覆蓋分布來(lái)看，每個(gè)區(qū)域的覆蓋深度都很高，平均覆蓋深度為107 x，一般測(cè)序深度在30 x以上，基因組覆蓋度和測(cè)序錯(cuò)誤率的控制得以保證，該結(jié)果表明所獲得的基因組被高度覆蓋，裝配結(jié)果具有良好的完整性。針對(duì)測(cè)序樣品的組裝基因組序列，結(jié)合編碼基因的預(yù)測(cè)結(jié)果，使用Circos軟件[27]對(duì)樣品基因組進(jìn)行展示，全基因組圖譜如圖2，從外向內(nèi)分別展示了堿基數(shù)目對(duì)應(yīng)位置、正鏈編碼基因的對(duì)應(yīng)位置、負(fù)鏈編碼基因?qū)?yīng)位置、基因組GC含量分布、基因組GC skew（偏移）值分布。菌株ZX67全基因組序列在基因庫(kù)(GenBank)中的登錄號(hào)為：CP034211。

表1 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

圖2 全基因組圈圖

2.3 基因組注釋結(jié)果和特性分析

P.carotovorumZX67菌株基因組序列包含了4,909,724 bp，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有P.carotovorum序列相比較，堿基數(shù)目較高，測(cè)序的覆蓋率較高。其基因組的GC含量為51.27%，一般的GC%越高，則DNA結(jié)構(gòu)就趨于高穩(wěn)定性，而較高的AT%易于解鏈、可能與較高的基因突變率相關(guān)，這也可能與該類(lèi)菌種在20～30℃左右的生存環(huán)境溫度相適應(yīng)，在一定程度上也暗示了作為病原菌需要適應(yīng)宿主防衛(wèi)行為的變化尤其是增強(qiáng)時(shí)適者生存的堿基高自由能狀態(tài)向高突變率狀態(tài)轉(zhuǎn)變的可跨越閾值。采用Prodigal v2.6.3[19,26]軟件對(duì)該基因組分析，總共計(jì)算和預(yù)測(cè)了4,977個(gè)編碼基因，編碼基因的平均長(zhǎng)度為1,041 bp，其序列長(zhǎng)度占總基因組的85.25%，預(yù)測(cè)的非編碼RNA(ncRNA)主要包括tRNA（74個(gè)），rRNA（22個(gè)）及sRNA（100個(gè)）。基因島有10個(gè)，每個(gè)基因島的平均長(zhǎng)度為36,027 bp。預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)座子6個(gè)，每個(gè)轉(zhuǎn)座子的平均長(zhǎng)度為363 bp。預(yù)測(cè)的散在重復(fù)序列有261個(gè)以及串聯(lián)重復(fù)序列103個(gè)（表2）。預(yù)測(cè)存在2個(gè)前噬菌體，每個(gè)前噬菌體的平均長(zhǎng)度為26,258 bp，有5個(gè)CRISPR序列，每個(gè)序列的平均長(zhǎng)度為621 bp（表2、表3）。

表2 基因組特征數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

該菌株的全基因組測(cè)序后產(chǎn)生了大量數(shù)據(jù)，為了解析、注釋其包含的編碼基因數(shù)目、功能等，筆者采用了目前普遍采用比對(duì)的方法對(duì)預(yù)測(cè)出來(lái)的編碼基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)虿煌诘鞍祝荒芡ㄟ^(guò)結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)功能，所以分別通過(guò)與已知的基因功能數(shù)據(jù)庫(kù)NR、Swiss-Prot、GO、GOG、KEGG、Trembl和Pfam的比對(duì)來(lái)推測(cè)了該基因組的編碼基因數(shù)目、功能等；而與每一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)所得到的編碼基因數(shù)目、種類(lèi)等數(shù)據(jù)結(jié)果存在較大的差異。雖然在得到的結(jié)果中，一般都是采用氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)，但其中通過(guò)與GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究具有更重要的作用，因?yàn)樗鼈兎謩e在基因功能和代謝通路研究中占據(jù)重要地位，這對(duì)于后續(xù)的改造、尋找防控的靶點(diǎn)等研究很重要。

在已經(jīng)預(yù)測(cè)的10個(gè)基因島內(nèi)，通過(guò)數(shù)據(jù)查找分析發(fā)現(xiàn)在果膠桿菌ZX67菌株的基因組中存在有5種與致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，其中III型分泌系統(tǒng)位于預(yù)測(cè)的第4個(gè)基因島內(nèi)，而IV型分泌系統(tǒng)位于預(yù)測(cè)的第5個(gè)基因島內(nèi)，通過(guò)在抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)(https://card.mcmaster.ca/analyze)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)到基因島中還可能含有可抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的黃色霉素(kirromycin ARO:3003368)的抗性基因（相似性為92%），表明基因島可能與細(xì)菌的適應(yīng)性和致病性相關(guān)[28]。

而在基因組中預(yù)測(cè)到的兩個(gè)前噬菌體區(qū)域不是完整的前噬菌體，第一個(gè)前噬菌體序列的長(zhǎng)度為38,859 bp，GC含量為48.79%，包含48個(gè)CDS編碼區(qū)域，可編碼外殼蛋白和整合酶。另一個(gè)前噬菌體長(zhǎng)度為13,658 bp，GC含量為53.51%，包含18個(gè)CDS編碼區(qū)域，能編碼噬菌體主要的尾管蛋白。此兩個(gè)噬菌體序列均為不完整的噬菌體，不具有典型噬菌體基因組的完整特性，將這兩個(gè)前噬菌體序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的71種果膠桿菌和2種歐文氏菌的噬菌體基因組序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)的前噬菌體與其他噬菌體的同源性都不高，均為30%左右，一方面可能是由于序列不完整，另一方面也可能證實(shí)了噬菌體基因具有很高的遺傳多樣性。

另外，此次分離的病原菌基因組上含有5個(gè)長(zhǎng)度不一的CRISPR區(qū)，最長(zhǎng)的CRISPR序列長(zhǎng)度是1,529 bp，含有25條間隔序列，最短的CRISPR序列長(zhǎng)度是98 bp，只含有1條間隔序列（表3）。這預(yù)測(cè)到的5種CRISPR序列，在數(shù)據(jù)庫(kù)中的Pectobacterium屬的多個(gè)種、Acinetobactersp.NEB 394、Clostridioides difficilestrain CD10010、Proteus terraesubsp.cibarius strain HNCF44W等菌種的全基因組序列上都可以搜索到高度相似的序列。

在全球范圍內(nèi)由果膠桿菌侵染導(dǎo)致的植物軟腐病均有發(fā)生[12]，為探究菌株ZX67與其他胡蘿卜果膠桿菌之間的差異，筆者將菌株ZX67與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已完成測(cè)序的果膠桿菌屬的部分菌株信息進(jìn)行比較（表4），所選菌株分別分離自中國(guó)、日本、白俄羅斯、波蘭、挪威、巴基斯坦以及南韓等不同國(guó)家，它們的寄主也有所不同，除了ZX67是從魔芋中分離出來(lái)的，其他菌株則是以山葵、黃瓜、馬鈴薯和蘿卜為寄主，其中來(lái)源于馬鈴薯的居多，如P.versatile14A、P.parmentieriIFB5604、P.parmentieriIFB5432、P.polarisNIBIO1006和P.punjabenseSS95，這表明馬鈴薯軟腐病是由這幾種果膠桿菌單獨(dú)或混合侵染而發(fā)生軟腐病。菌株ZX67在基因組大小與GC含量上與這些菌株的差異并不明顯，但CDS和CRISPR的數(shù)量比其他菌株都要多，表明其基因組上能編碼的蛋白數(shù)量和種類(lèi)相對(duì)要多，這些蛋白可能與細(xì)胞壁的降解及致病性相關(guān)。

表4 菌株ZX67與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中果膠桿菌屬菌株的比較

2.4 基于基因組序列的重要代謝途徑分析

果膠桿菌感染的特征在于分泌大量降解植物細(xì)胞壁的酶引起的誘發(fā)腐爛癥狀[29]。果膠桿菌可編碼多種酶協(xié)同作用以降解植物細(xì)胞壁。果膠酶是致病過(guò)程中最重要的酶，受許多調(diào)節(jié)因素的控制，以多種形式存在并利用中間薄層和果膠質(zhì)，使細(xì)胞瓦解、內(nèi)含物外流。在預(yù)測(cè)的全基因組編碼的基因組成中，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜果膠桿菌ZX67菌株的基因組中包含有18種果膠酸裂解酶基因（pelABCLWX、pel123、KKH3_37720、KKH3_37730、KKH3_37740、KKH3_21450、KKH3_21500、KKH3_28390、KKH3_17430、KKH3_08410和PCC21_038530），2種果膠裂解酶(pnl、KKH3_12920)，1種多聚半乳糖醛酸酶(KKH3_42200)，2種鼠李糖半乳糖醛酸裂解酶(rhiE、KKH3_05330)，1種果膠甲基酯酶(pemA)，2 種果膠乙?；?KKH3_29960、KKH3_18740)，3 種纖維素酶(celA1、KKH3_20670、KKH3_14460)，5種葡聚糖酶(bcsZ、cel5、celS、KKH3_22720、KKH3_41050)。此外，該基因組還含有5個(gè)基因編碼的纖維素酶prt1、prtCDEF，其中一些酶可能在植物細(xì)胞壁降解中起作用。這些纖維素酶主要表現(xiàn)內(nèi)切、外切葡聚糖酶和β-Glucosidase活性，首先降解纖維素釋放寡糖、纖維二糖和葡萄糖，然后降解植物的細(xì)胞壁（表5）。有人研究和比較了在菊果膠桿菌和胡蘿卜果膠桿菌中一些調(diào)控基因參與生產(chǎn)這些細(xì)胞壁降解酶，如菊果膠桿菌上的pir、pecS-pecM、fur、hns、crp、pecT、expI-expR、kdgR，胡蘿卜果膠桿菌中的aepA、rexZ、hor、pehR-pehS、expM、rpoS、rsmA-rsmB-rsmC、hexA、kdgR和expI-expR等基因[29]；在ZX67的全基因組上則發(fā)現(xiàn)了kdgR、crp、pir、pecS和rpoS調(diào)控基因的存在，這5個(gè)調(diào)控基因中，既有均出現(xiàn)在2種病原菌中的kdgR，也有分別出現(xiàn)在菊果膠桿菌上的crp、pir、pecS和胡蘿卜果膠桿菌中的rpoS，具有一定的復(fù)雜性。在果膠酶表達(dá)分泌的過(guò)程中，會(huì)受到一些調(diào)節(jié)因素的調(diào)控，主要的調(diào)節(jié)蛋白有kdgR、crp、pir和pecS。除果膠酶外，其他與細(xì)胞壁降解相關(guān)的酶如果膠裂解酶(pel)、多聚半乳糖醛酸酶(peh)、纖維素酶(pel)和蛋白酶(prt)等也被認(rèn)為是致病的主要因素，這些酶大量產(chǎn)生并分泌到外部環(huán)境中[29]。

表5 ZX67基因組中與植物細(xì)胞壁降解相關(guān)的酶

根據(jù)對(duì)基因組編碼的基因組成分析，在果膠桿菌ZX67菌株的基因組中存在5種類(lèi)型的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)（表6）。蛋白質(zhì)分泌在軟腐病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[30]。菌株ZX67基因組上的這5種類(lèi)型蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)分述如下：Ⅰ型分泌系統(tǒng)包括6個(gè)基因，分別為 PC_1299、PC_3006、PC_3169、PC_3686、PC_3688、PC_3689，編碼permease/ATPase和外膜蛋白。Ⅱ型分泌系統(tǒng)包括 15個(gè)基因，PC_783、PC_784、PC_1484～1493、PC_1495～1497，是果膠桿菌最重要的分泌系統(tǒng)，又稱(chēng)out系統(tǒng)(outcdefghijklmn)。Ⅱ型分泌系統(tǒng)的15個(gè)基因編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HofC同源物和Ⅱ型分泌系統(tǒng)蛋白各組分：C、D、E、F、G、H、I、J、K、M和N。II型分泌系統(tǒng)可將各種蛋白質(zhì)從周質(zhì)空間運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外環(huán)境。它負(fù)責(zé)分泌大多數(shù)植物細(xì)胞壁降解酶，如纖維素酶、果膠酶和其他一些毒力因子，從而破壞宿主細(xì)胞，引起組織壞死和疾病[30]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)包括19個(gè)基因，編碼發(fā)病機(jī)制、蛋白質(zhì)分泌、膜和質(zhì)膜的組成部分。在菌株ZX67的基因組中，還發(fā)現(xiàn)存在IV型分泌系統(tǒng)，它包括16個(gè)基因，編碼ATPase、轉(zhuǎn)糖基化酶、P-type DNA transfer ATPase VirB11、Rhs蛋白、DotU蛋白等基因。與菌株ZX67不同的是，在胡蘿卜果膠桿菌SCC1菌株的基因組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)IV型分泌系統(tǒng)(T4SS)[30]。一些病原菌中的T4SS成分通過(guò)細(xì)菌與宿主細(xì)胞的粘附起到毒力和感染的作用[31]。VI型分泌系統(tǒng)編碼包括hcp1、vgrGA蛋白、icmF等17個(gè)基因。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，VI型分泌系統(tǒng)基因在果膠桿菌ZX67基因組中呈零星分布，但在胡蘿卜果膠桿菌SCC1菌株的基因組中，VI型分泌系統(tǒng)的基因是成簇分布的[30]。據(jù)報(bào)道，VI型分泌系統(tǒng)對(duì)某些果膠桿菌的毒力幾乎沒(méi)有影響[30]。但在P.carotovorumZX67基因組中，VI蛋白分泌系統(tǒng)成分hcp1是分泌性細(xì)胞毒素hcp。

表6 菌株ZX67的基因組中蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)

2.5 基于全基因組序列的菌株ZX67分類(lèi)地位分析

病原菌ZX67全基因組測(cè)序完成后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到大約20條已公布測(cè)序結(jié)果的P.carotovorum菌株的基因組信息(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/1799)，建樹(shù)觀察ZX67基因組與各胡蘿卜果膠桿菌菌株之間的親緣關(guān)系（圖3）。在胡蘿卜果膠桿菌種中，雖都是同一個(gè)種的菌株，但其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近都存在差異，菌株ZX67與P.carotovorumsubsp.carotovorumPC1[25]的親緣關(guān)系緊密，而與菌株DSM 30168[25]的關(guān)系較遠(yuǎn)，由于測(cè)序的年代和技術(shù)差異，部分測(cè)序結(jié)果未能覆蓋全基因組，不同環(huán)境分離出來(lái)的菌株其基因組也可能存在差異，依據(jù)這些差異，把P.carotovorum又劃分為不同的亞種，其中P.carotovorumsubsp.carotovorum是最早提出來(lái)的亞種。不同來(lái)源的亞種基因組上的差異可能是適應(yīng)寄主植物的環(huán)境變化選擇的結(jié)果。

圖3 菌株ZX67在P.carotovorum種的基因組中的分布位置

3 討論與結(jié)論

胡蘿卜果膠桿菌是馬鈴薯、胡蘿卜、白菜等經(jīng)濟(jì)作物的常見(jiàn)病原菌，曾經(jīng)甚至目前還在繼續(xù)造成經(jīng)濟(jì)損失，早已引起世界各國(guó)的重視。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)分離自竹溪縣高山上發(fā)生軟腐病的魔芋球莖中的病原菌菌株ZX67進(jìn)行了全基因組測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果覆蓋全面，組裝了基因組全長(zhǎng)序列，用多個(gè)基因分析軟件對(duì)基因組進(jìn)行了分析，與已發(fā)布的同一個(gè)種的基因組序列及其文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)相比較，更加深入、全面、先進(jìn)。目前，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，已經(jīng)有大約60個(gè)胡蘿卜果膠桿菌的全基因組測(cè)序結(jié)果，其中大約20條P.carotovorum的全基因組測(cè)序結(jié)果比較完整，另外的40余條由于測(cè)序的年代較早和技術(shù)差異，測(cè)序結(jié)果未能覆蓋全基因組。在20條全序列比對(duì)中，菌株ZX67與菌株DSM 30168的關(guān)系較遠(yuǎn)，而與P.carotovorumsubsp.carotovorumPC1的親緣關(guān)系緊密。這些菌株由于來(lái)源不同又存在著部分的差異，依據(jù)這些差異，已把P.carotovorum劃分為不同的亞種，其中P.carotovorumsubsp.carotovorum是最早提出來(lái)的亞種。不同來(lái)源的亞種基因組上的差異可能與適應(yīng)不同的環(huán)境變化的結(jié)果。

通過(guò)對(duì)病原菌全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)在菌株ZX67基因組上存在大量與降解細(xì)胞壁相關(guān)的酶基因，并且與其他的菌株有一定的差異，例如胡蘿卜果膠桿菌PCC1基因組上有1種果膠裂解酶，4種多聚半乳糖醛酸酶，1種鼠李糖半乳糖醛酸裂解酶，2種果膠甲基酯酶，2種果膠乙?；?，3種纖維素酶和11種果膠酸裂解酶，各酶系在數(shù)量上與ZX67基因組上的有所不同（表5），ZX67基因組上有8種纖維素酶，有18種果膠酸裂解酶等。其次，二者的分泌蛋白系統(tǒng)也有所差異，除了菌株P(guān)CC1含有的分泌系統(tǒng)外，在菌株ZX67基因組上還發(fā)現(xiàn)了IV型分泌系統(tǒng)的多個(gè)基因；另外VI型分泌系統(tǒng)在分布上也有所不同，有些菌株是成簇分布的，還有一些菌株是分散的基因。在測(cè)序方面，本次測(cè)序重點(diǎn)突出了對(duì)CRISPR、重復(fù)序列、前噬菌體等與噬菌體的侵染、防御相關(guān)的基因序列的測(cè)序與分析，為后續(xù)利用噬菌體防治魔芋軟腐病的技術(shù)改造提供了一個(gè)良好的基礎(chǔ)。目前，在尚無(wú)有效方法能夠攻克魔芋軟腐病防治難題的困境下，加強(qiáng)CRISPR系統(tǒng)和前噬菌體的相關(guān)研究將可能是研發(fā)新的防治方法的有效切入點(diǎn)。因細(xì)菌基因組中包含的CRISPR序列是病原菌識(shí)別并抵御噬菌體侵染的重要元件，通常與CRISPR相關(guān)蛋白一起構(gòu)成自身的獲得性免疫系統(tǒng)，CRISPR序列由短重復(fù)序列和間區(qū)序列組成，重復(fù)序列大多高度保守[23,25]；而間區(qū)序列是從外源DNA序列中獲得的，具有很高的多態(tài)性，當(dāng)含有相同序列的外源DNA入侵時(shí)，就會(huì)被機(jī)體識(shí)別，對(duì)其進(jìn)行剪切使之沉默而消除了噬菌體侵染的能力。CRISPR系統(tǒng)能夠?yàn)榧?xì)胞提供抵抗噬菌體侵染的免疫能力，相應(yīng)地，噬菌體以其基因組的高頻突變方式去躲避被識(shí)別被裂解、以anti-CRISPRs（抗CRISPR蛋白）反攻擊宿主細(xì)胞，雙方在互殺互搏的生存斗爭(zhēng)中不斷進(jìn)化，通過(guò)激烈爭(zhēng)奪生存壓力制高點(diǎn)的殊死搏擊恰恰使雙方達(dá)到了互動(dòng)平衡，并推動(dòng)了二者基因組的快速進(jìn)化。因此，若能夠利用這些序列作為改造的靶點(diǎn)，將有可能規(guī)避宿主細(xì)胞的防衛(wèi)系統(tǒng)而達(dá)到防治的目標(biāo)。

在這項(xiàng)研究中，筆者提出了魔芋軟腐病病原菌P.carotovorumZX67菌株的注釋基因組序列，其由一個(gè)總長(zhǎng)度為4,909,724 bp、GC含量為51.27%的片段組成，是從發(fā)病魔芋球莖深處分離出來(lái)的，根據(jù)病原菌生活方式，發(fā)現(xiàn)菌株ZX67的基因組具有與其他已測(cè)序的Pectobacteriumgenomes類(lèi)似的大量植物細(xì)胞壁降解酶，有與侵染相關(guān)的毒力和蛋白分泌系統(tǒng)，并重點(diǎn)分析了CRISPR系統(tǒng)和前噬菌體等有助于建立防治新方法的序列。對(duì)胡蘿卜果膠桿菌ZX67菌株全基因組的測(cè)序及分析的豐富結(jié)果，為進(jìn)一步了解軟腐病菌的特性提供了機(jī)會(huì)，也為研究新的防治措施提供了新的出發(fā)點(diǎn)和思路。