劉永惠，沈 一，沈 悅，梁 滿，陳志德

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，南京 210014）

0 引言

花生(Arachis hypogaeaL.)是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物，在增加農(nóng)民收入和保障國(guó)家油脂安全方面具有重要的作用[1]。近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高和食品加工業(yè)的快速發(fā)展，食用花生的需求量不斷上升。但目前國(guó)內(nèi)主栽品種以油用花生為主，缺少優(yōu)質(zhì)食用專用型花生品種，不能滿足食用花生市場(chǎng)的需求[2]。含糖量是評(píng)價(jià)食用花生的重要指標(biāo)之一，與花生的口味、加工品質(zhì)密切相關(guān)[3]?；ㄉ讶手械目扇苄蕴侵饕ㄕ崽?、果糖和葡萄糖等，其中蔗糖是最主要的糖分[4]。當(dāng)蔗糖含量達(dá)到6%以上時(shí)，花生籽仁口感較好，而中國(guó)目前大部分花生品種蔗糖含量較低，僅在3%～4%左右。如何提高花生品種的蔗糖含量，培育優(yōu)質(zhì)食用型花生品種是生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題。

花生的含糖量被認(rèn)為是可以遺傳的性狀[5]，且含糖量的大小與品種、籽仁成熟度、生長(zhǎng)環(huán)境、栽培措施等因素有關(guān)[6]，推測(cè)這些因素可能通過(guò)影響相關(guān)酶的活性來(lái)促進(jìn)或減少蔗糖等糖分的積累。研究證實(shí)蔗糖磷酸合酶SPS(sucrose phosphate synthase)、蔗糖合酶SS(sucrose synthase)以及蔗糖轉(zhuǎn)化酶INV(sucrose invertase)是調(diào)控植物蔗糖代謝途徑的關(guān)鍵酶[7]。其中SPS與蔗糖合成密切相關(guān)，是蔗糖合成途徑的關(guān)鍵限速酶[8]；SS負(fù)責(zé)催化蔗糖分解與合成的可逆反應(yīng)，有研究認(rèn)為其更偏向于蔗糖的分解反應(yīng)[9]；INV主要在蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、貯藏和分配中發(fā)揮重要作用[10]，根據(jù)最適pH，可以將其分為中性或堿性轉(zhuǎn)化酶NI(neutral invertase)，可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAI(soluble acid invertase)，以及細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶BAI(cellwall binding acid invertase)[11]。目前上述酶在甘蔗、甜瓜、甜菜等高糖分作物中研究較多，且不同作物的糖分積累機(jī)制及關(guān)鍵酶調(diào)控作用存在差異。如甜瓜果實(shí)中SPS、AI(acid invertase)活性被認(rèn)為是決定其果實(shí)蔗糖含量的關(guān)鍵酶[12]；高糖甘蔗品種莖中的蔗糖含量與SS分解方向活性呈顯著正相關(guān)，但在低糖品種中呈負(fù)相關(guān)[13]。因此，明確作物糖分積累與蔗糖代謝相關(guān)酶的關(guān)系，對(duì)選育優(yōu)良食用品種具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究以不同蔗糖含量的花生品種為試驗(yàn)材料，分析其籽仁發(fā)育過(guò)程中糖分積累及蔗糖代謝相關(guān)酶活性的變化差異，旨在探討花生籽仁的糖代謝積累機(jī)制，為培育高含糖量的優(yōu)質(zhì)食用型花生品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用了3個(gè)不同蔗糖含量的花生品種作為實(shí)驗(yàn)材料，分別是高蔗糖含量的‘冀花甜1號(hào)’（以下簡(jiǎn)稱‘冀甜’），較高蔗糖含量的‘臨花16號(hào)’（以下簡(jiǎn)稱‘臨花’），以及普通品種‘蘇農(nóng)花1號(hào)’（以下簡(jiǎn)稱‘蘇花’）。其中‘冀甜’由河北省農(nóng)林科學(xué)院選育，‘臨花’由山東省臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育，‘蘇花’由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育。

1.2 方法

將上述材料于2020年5月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院本部試驗(yàn)田進(jìn)行播種，常規(guī)田間管理，待進(jìn)入結(jié)莢期后每隔10天收集各品種代表性莢果樣品。從中選取發(fā)育均勻一致的莢果，快速剝?nèi)∽讶剩⒏鶕?jù)籽仁發(fā)育的大小及狀態(tài)細(xì)分為發(fā)育初期、中期、后期。各時(shí)期的樣品一部分及時(shí)烘干，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過(guò)0.64 mm孔徑篩，置于密閉容器中保存，用于可溶性總糖、蔗糖、果糖及葡萄糖等糖組分含量的測(cè)定；另一部分液氮冷凍，-80℃冰箱保存，用于SPS、SSⅠ（SS分解方向）、SSⅡ（SS合成方向）、NI、SAI等蔗糖代謝酶活力測(cè)定。

1.2.1 糖組分含量測(cè)定 可溶性總糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[14]。蔗糖、果糖及葡萄糖含量的測(cè)定采用高效液相色譜法，色譜型號(hào)為Aglient1260，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，色譜柱為氨基柱(Kromasil，4.6 mm×250 mm，5 μm)。參考國(guó)標(biāo)GB/T 30390-2013的方法制備樣品提取液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾至上樣瓶中待測(cè)；按照國(guó)標(biāo)GB 5009.8-2016的方法設(shè)置色譜條件：流動(dòng)相為70:30(v/v)乙腈/水溶液，流速1.0 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量20 μL；以色譜級(jí)的蔗糖、果糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合配制0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/g的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行色譜分析，記錄不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)各測(cè)試樣品最終測(cè)得的目標(biāo)峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中折算出樣品所含蔗糖、果糖和葡萄糖的濃度。

1.2.2 蔗糖代謝相關(guān)酶活性測(cè)定 采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行SPS、SSⅠ、SSⅡ、NI、SAI等蔗糖代謝酶活性測(cè)定。分別稱取1.0 g左右的冷凍樣品放入預(yù)冷的研缽中；加入10 mL相應(yīng)的提取緩沖液，快速冰浴研磨成均勻糊狀，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中；4℃，12000 g離心10 min，上清液即為粗酶液。根據(jù)酶的種類選擇不同的反應(yīng)介質(zhì)及反應(yīng)條件，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的改良型Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行樣品粗酶液的蛋白濃度測(cè)定。使用SparkTM10M多功能酶標(biāo)儀測(cè)量不同波長(zhǎng)的吸光度，并折算出酶的活性值。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Microsoft Office Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖組分含量比較分析

如圖1所示，分別將各品種發(fā)育不同時(shí)期的籽仁進(jìn)行烘干處理后，‘冀甜’、‘臨花’的種皮為紅色，‘蘇花’的種皮為淺紅色。發(fā)育初期的籽仁主要來(lái)自果針入土后10～20天左右的雞頭狀幼果；發(fā)育中期是果針入土后約30～40天、果殼表面光滑、網(wǎng)紋不明顯的莢果籽仁；發(fā)育后期是果針入土后50～60天左右的莢果籽仁，此時(shí)莢果趨于成熟，果殼網(wǎng)紋清晰，內(nèi)果殼可見(jiàn)褐斑。

籽仁研磨成粉末后分別測(cè)定可溶性總糖、蔗糖、果糖及葡萄糖含量（表1），結(jié)果顯示3個(gè)品種的糖組分變化規(guī)律相似，含量都是隨著種子的發(fā)育呈下降趨勢(shì)：發(fā)育初期＞發(fā)育中期＞發(fā)育后期?；ㄉ讶手锌扇苄蕴且哉崽菫橹?，含量變化范圍在18.14～97.01 mg/g，而果糖和葡萄糖的含量較低，分別僅為0.77～3.81 mg/g和0.39～3.28 mg/g。糖組分含量在發(fā)育早期下降迅速，在中后期變化相對(duì)緩慢，如‘冀甜’籽仁的蔗糖、果糖、葡萄糖含量分別從初期到中期，含量下降了26.1%、44.6%、52.4%；從中期到后期，含量?jī)H下降12.1%、10.9%、7.7%。

表1 參試品種不同發(fā)育階段的糖組分含量

在參試的3個(gè)品種中，各發(fā)育時(shí)期的糖組分都以‘冀甜’含量最高，其次為‘臨花’，‘蘇花’的含量最低，多重比較顯示除了‘冀甜’和‘臨花’在籽仁發(fā)育中期的蔗糖含量沒(méi)有顯著性差異，其余都為極顯著差異。蔗糖含量較低的品種，其籽仁發(fā)育過(guò)程中蔗糖含量的下降速率高于蔗糖含量較高的品種，如：‘蘇花’的籽仁從發(fā)育初期到中期、中期到后期，蔗糖含量的下降速率分別為57.6%、41.7%；而‘臨花’的僅為23.6%、20.6%。

2.2 蔗糖代謝相關(guān)酶活性分析

根據(jù)酶的不同功能，將參與蔗糖代謝的關(guān)鍵酶進(jìn)一步劃分為合成方向和分解方向。合成方向上主要是蔗糖磷酸合酶SPS和蔗糖合酶（合成方向）SSⅡ，其中SSⅡ的活性值較大，活性變化區(qū)間介于0.226～0.656 μmol/(mg·protein·min)之間（圖2-B）；SPS的活性變化區(qū)間為0.043～0.153 μmol/(mg·protein·min)（圖2-A）；這兩種酶的活性都隨著籽仁的發(fā)育呈下降趨勢(shì)，其中各品種籽仁發(fā)育初期的SPS活性為發(fā)育后期的2.3～2.6倍，SSⅡ活性為發(fā)育后期的2.2～2.7倍。

圖2 各參試品種發(fā)育不同階段蔗糖代謝相關(guān)酶活性分析

分解方向上主要分析了蔗糖合酶（分解方向）SSⅠ、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAI和中性轉(zhuǎn)化酶NI。其中SSⅠ活性值相對(duì)最高，在0.051～0.253 μmol/(mg·protein·min)之間（圖2-E）；S-AI和NI的活性值都較低，變化區(qū)間分別介于0.002～0.007、0.004～0.021 μmol/(mg·protein·min)之間（圖2-C/D）；分解方向上的酶活性隨著籽仁的發(fā)育總體上呈上升趨勢(shì)，其中NI活性值從初期到后期上升了2.2～3.3倍，SAI和SSⅠ的活性值分別上升了2.2～2.9倍和2.2～4.0倍。

不同品種的酶活性變化趨勢(shì)基本相似。多重比較顯示，3個(gè)品種在不同發(fā)育時(shí)期的酶活性差異大部分達(dá)到了顯著或極顯著水平；除了可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAI在發(fā)育初期和中期的差異不顯著；‘臨花’籽仁中NI活性在發(fā)育中期和后期差異不顯著；‘蘇花’籽仁中SSⅠ活性在發(fā)育中期和后期差異不顯著。發(fā)育初期以‘冀甜’的SPS、SSⅡ、SSⅠ活性最高，‘蘇花’對(duì)應(yīng)的酶活性最低，這與品種的糖組分含量差異趨勢(shì)一致；發(fā)育中期品種間的差異變小，尤其是‘臨花’和‘蘇花’，兩者僅在SSⅡ活性方面的差異達(dá)到顯著水平，‘冀甜’在SPS、SSⅡ、NI活性方面都與剩余2個(gè)品種呈極顯著差異；發(fā)育后期不同品種間僅NI活性差異達(dá)到極顯著水平，‘冀甜’品種的蔗糖合酶SS無(wú)論是合成還是分解方向都極顯著高于其他品種。

2.3 蔗糖和蔗糖代謝酶活性的相關(guān)性分析

將不同品種或不同發(fā)育階段的蔗糖含量及其相應(yīng)的蔗糖代謝酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析。如表2所示，不同品種的蔗糖含量與酶活性的相關(guān)性趨勢(shì)相同，表現(xiàn)為與蔗糖合成方向的酶SPS、SSⅡ及兩者總和(SPS+SSⅡ)呈正相關(guān)；與蔗糖分解方向的酶SAI、NI、SSⅠ及三者總和(SAI+NI+SSⅠ)呈負(fù)相關(guān)；除‘冀甜’的蔗糖含量與SAI活性的相關(guān)性不顯著外，其他都達(dá)到了顯著或極顯著水平。不同發(fā)育階段的蔗糖含量與酶活性的相關(guān)性存在一定的差異，發(fā)育初期的蔗糖含量與SPS、SSⅡ、SSⅠ、SPS+SSⅡ及SAI+NI+SSⅠ呈極顯著正相關(guān)，與SAI成正相關(guān)，與NI成負(fù)相關(guān)，但相關(guān)值較小，未能達(dá)到顯著水平；發(fā)育中期的相關(guān)值其絕對(duì)值都低于0.8，僅與SSⅡ和SPS+SSⅡ呈顯著正相關(guān)；發(fā)育后期的蔗糖含量與NI的相關(guān)性最高，為極顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.945)，其次與SPS、SAI顯著正相關(guān)，其他指標(biāo)不顯著。

表2 蔗糖含量與蔗糖代謝酶活性相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

花生作為世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料作物，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。近年來(lái)，除含油量[15]、蛋白質(zhì)[16]、脂肪酸[17]等品質(zhì)性狀外，含糖量的相關(guān)研究報(bào)道也明顯增多。在花生籽仁蔗糖含量測(cè)定方法上，通過(guò)利用不同類型的近紅外光譜儀不斷建立和完善花生蔗糖含量測(cè)定的近紅外模型[18-19]，實(shí)現(xiàn)了蔗糖含量的無(wú)損、快速、高效預(yù)測(cè)。秦利等[20]通過(guò)對(duì)花生籽仁蔗糖含量進(jìn)行遺傳分析，揭示該性狀受2對(duì)加性主基因+多基因控制，且具有明顯的母體效應(yīng)。郭建斌等[21]通過(guò)分析不同油酸花生品種籽仁中營(yíng)養(yǎng)成分的變化，認(rèn)為蔗糖含量胚中顯著高于子葉，且蔗糖含量和油脂含量變化呈負(fù)相關(guān)，與高糖品種往往具有較低含油量的特征相符。相信隨著越來(lái)越多有關(guān)花生含糖量性狀的深入研究，將進(jìn)一步加快優(yōu)質(zhì)食用型花生品種的選育進(jìn)程。

糖分積累是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，由多種酶調(diào)控，探明蔗糖代謝相關(guān)酶活性與蔗糖積累的關(guān)系，可以為高糖品種的選育提供理論依據(jù)，但目前花生中相關(guān)研究報(bào)道較少。從本研究結(jié)果來(lái)看不同品種籽仁發(fā)育過(guò)程中的糖組分含量及酶活性變化規(guī)律基本相似；含糖量高的品種籽仁發(fā)育各時(shí)期糖組分含量始終高于含糖量低的品種；并證實(shí)了蔗糖是花生籽仁中最主要的可溶性糖；果糖、葡萄糖含量較低且呈下降趨勢(shì)，在發(fā)育后期達(dá)到了極低的水平。酶活性方面，無(wú)論是合成方向的蔗糖合酶SSⅡ或是分解方向的蔗糖合酶SSⅠ，其相對(duì)酶活性值都較高，尤其是分解方向，是蔗糖轉(zhuǎn)化酶的10倍以上，與前人研究結(jié)果一致[14]。表明蔗糖合酶在花生蔗糖代謝途徑中起著重要作用。此外，相關(guān)性分析顯示籽仁發(fā)育后期蔗糖含量與中性轉(zhuǎn)化酶NI呈極顯著負(fù)相關(guān)，與蔗糖磷酸合酶SPS呈顯著正相關(guān)。即蔗糖含量高的品種，其SPS活性越高，NI活性越低，推測(cè)兩者在花生籽仁發(fā)育后期起重要作用，可以通過(guò)抑制NI活性，減少蔗糖向葡萄糖和果糖的分解，并調(diào)控SPS活性來(lái)促進(jìn)花生籽仁蔗糖積累，提高品種的含糖量。不足之處，文中僅測(cè)定比較了3個(gè)不同花生品種，樣本量較小，可能不能充分反映出品種在糖組分含量及蔗糖代謝相關(guān)酶活性變化趨勢(shì)方面的差異。

綜上所述，花生籽仁中的可溶性糖以蔗糖為主，果糖、葡萄糖含量較低；蔗糖含量較高的品種其籽仁發(fā)育各時(shí)期相對(duì)糖組分含量也較高；酶活性方面，蔗糖合酶(SS)在花生蔗糖代謝途徑關(guān)鍵酶中活性值最高；籽仁發(fā)育后期蔗糖含量與中性轉(zhuǎn)化酶NI負(fù)相關(guān)，與蔗糖磷酸合酶SPS正相關(guān)。