孫志廣，潘 根，陳庭木，李景芳，趙利君，遲 銘，徐 波，邢運高，劉金波，劉曉敏，葛高寧，徐錦濤，王寶祥，徐大勇

（1連云港市農(nóng)業(yè)科學院/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222006；2中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙 410000；3南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，南京 210095；4蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院環(huán)境工程學院，江蘇蘇州 215026）

0 引言

作物遺傳種質(zhì)是國家重要的戰(zhàn)略資源，加強種質(zhì)資源保護與利用是開展種源卡脖子技術攻關的重要一環(huán)。由于品種審定制度和商業(yè)化育種的需求，許多育種家在水稻育種過程中過度追求品種推廣面積，雜交組合集中選用生產(chǎn)上大面積推廣應用的品種作為骨干親本，導致育成品種數(shù)量增加的同時，其遺傳多樣性持續(xù)降低，致使近年來水稻產(chǎn)量潛力徘徊不前，抗逆能力愈加脆弱[1-3]。多位學者通過品種多樣性分析表明各地區(qū)主推品種間遺傳相似性較近，遺傳基礎日趨狹窄[4-6]，因此，在育種過程中亟待進一步拓寬親本選擇范圍，豐富遺傳背景、提高遺傳多樣性。

穞稻是中國長江下游特有的具有雜草生長習性的稻種資源，曾廣泛分布于江蘇省連云港市云臺山地區(qū)（北緯34°33′—34°46′，東經(jīng)119°13′—119°30′），不種自生，黑殼長芒，落粒性極強（種子邊成熟邊落粒，甚至未成熟就落粒），其種子休眠性強，一旦條件適宜即可生長發(fā)芽，因此得以長期延存下來[7]。相比于栽培稻，穞稻的生長環(huán)境更加惡劣，因此穞稻保留了許多栽培稻沒有的優(yōu)良性狀，其根系發(fā)達，分蘗能力強，具有耐寒、耐鹽、耐貧瘠等特性。種子是農(nóng)業(yè)的芯片，而種質(zhì)資源中蘊含的優(yōu)異基因則是種子的芯片，雜草稻作為新基因/QTL的重要來源，通常能更好地適應不同的生態(tài)環(huán)境，并能耐受許多生物和非生物脅迫，為栽培稻的培育提供重要的遺傳基礎。充分利用包括穞稻在內(nèi)的雜草稻的優(yōu)良基因?qū)λ居N有著十分重要的價值。然而由于耕作制度的改變、氣候的變化以及棲息地的減少，穞稻正處于瀕臨滅絕的境地，因此穞稻優(yōu)異性狀的評價、利用以及保護性工作已刻不容緩。

SNP(Single Nucleotide Polymorphism)標記是指在基因組上單個核苷酸變異形成的遺傳標記，其多態(tài)性豐富，數(shù)量多且分布廣泛，相比于其他類型分子標記，更能真實反映水稻品種間的親緣關系，可用于水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析[8-9]。水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究能夠指導水稻育種實踐，為親本選配、品種鑒定提供幫助，從而促進利用MAS技術培育水稻新品種[10-11]。近年來，國內(nèi)外學者已對諸多普通野生稻的遺傳多樣性開展了大量研究，挖掘了許多優(yōu)異性狀基因，并利用其作為親本培育出多個優(yōu)良品種或不育系[12-15]。陳成斌等[16]利用廣西野生稻與栽培稻進行雜交，在后代中選育出5個優(yōu)異的穩(wěn)定品系，將廣西藥用野生稻DNA導入到栽培稻‘中鐵31’中培育出高光效糯稻新品種‘桂D1號’，該品種得到了大面積推廣應用；陳明亮等[17]以‘贛香B’為母本，耐冷和耐低氧萌發(fā)的東鄉(xiāng)野生稻為父本進行雜交，后通過連續(xù)回交，在后代中選育出不育性穩(wěn)定野敗型三系不育系贛野A，該不育系敗育徹底，異交結實率高，配合力強，具有很強的耐冷性和耐低氧萌發(fā)能力，該不育系于2019年通過江西省品種審定委員會審定。相比于此，關于穞稻的遺傳多樣性研究數(shù)量較少。魏興華[18]于2004年利用30對SSR標記對穞稻進行了分類地位鑒定，揭示了穞稻與亞洲栽培稻、栽培稻野生祖先種的親緣關系，為穞稻優(yōu)良性狀的遺傳利用提供依據(jù)，但此后關于穞稻遺傳多樣性的研究鮮有報道。隨著直播稻的大面積推廣，直播稻生產(chǎn)中遇到的關鍵問題日益受到育種家的重視，其中以出苗率低、出苗不齊最為突出。而篩選萌發(fā)耐淹性資源、發(fā)掘耐淹性基因并且選育耐淹性品種被認為是解決直播水稻出苗率低的一種有效手段[19]。本研究擬利用SNP標記對包括穞稻在內(nèi)的48份水稻種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，并對參試材料進行萌發(fā)耐淹性鑒定，以期為穞稻優(yōu)良基因的育種利用和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 參試品種

供試種質(zhì)總計48份，除包含穞稻及其改良系外，還包含19份秈稻、17份粳稻、7份連云港地區(qū)的自生稻以及3份普通野生稻）。其中穞稻由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源與生物技術研究所提供，其他資源均來自本單位水稻種質(zhì)資源庫（表1）。

表1 參試品種信息

1.2 SNP分型和染色體作圖

選取48份參試種質(zhì)幼苗葉片，參照CTAB法提取水稻基因組DNA[20]，利用華智水稻生物技術有限公司1K mGPS芯片對參試材料進行全基因組掃描，根據(jù)SNP分型結果利用MG2C version 2.1(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)進行染色體作圖。

1.3 SNP位點的多態(tài)性信息含量分析

利用多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)對SNP位點的遺傳多樣性進行評價。按照Powermarker v3.25軟件的格式要求對芯片分型數(shù)據(jù)進行整理并導入計算，見公式(1)。

其中Pij表示第i個標記第j個等位變異出現(xiàn)的頻率。

1.4 品種的遺傳多樣性及聚類分析

將SNP分型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為[0、1]二元矩陣，應用PowerMaker 3.25軟件計算每個SNP位點的重要等位基因頻率(major allele frequency,MAF)和基因多樣性指數(shù)(gene diversity index,GD)，利用Minitab 18軟件進行每條染色體MAF、GD和PIC箱式圖的繪制，同時用Nei's方法計算遺傳距離，采用非加權配對算術平均法(UPGMA)構建遺傳關系樹狀圖，利用FigTree version 1.4.3進行樹狀圖的修飾和亞群分類。

1.5 萌發(fā)耐淹性鑒定

參照孫志廣等[21]的方法進行參試種質(zhì)萌發(fā)耐淹性鑒定，以淹水10 cm、萌發(fā)7天的胚芽鞘長(coleoptile length,CL)為指標，對48份參試種質(zhì)資源進行萌發(fā)耐淹性鑒定，隨機區(qū)組排列，3次重復，每重復調(diào)查12粒種子胚芽鞘長度，精確到1 mm，剔除雙極值后，取3次胚芽鞘長度平均值作為表型值。利用HemI 1.0軟件，采用Kendall's tau距離的相似度測度算法，進行參試種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性聚類分析。試驗于2020年12月—2021年3月在連云港市農(nóng)業(yè)科學院中心實驗室進行。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)性SNP位點的分布

利用1K mGPS水稻SNP芯片對所有參試種質(zhì)資源進行檢測，共獲得位于水稻12條染色體上的5207個SNP分型數(shù)據(jù)位點，其中4785個具有良好的多態(tài)性，比率高達91.9%。統(tǒng)計分析顯示，平均每條染色體上分布398.8個多態(tài)性SNP位點（圖1），其中位于水稻第1染色體上的有572個，占比11.95%，為所有染色體上最多；第8染色體上最少，總計310個，占比6.48%。這些多態(tài)性SNP標記相對均勻的分布在水稻12條染色體上，平均每1 Mb的區(qū)間內(nèi)含有13個多態(tài)性SNP標記，能夠滿足遺傳多樣性分析的需要。

圖1 多態(tài)性SNP位點在水稻染色體上的分布

2.2 SNP位點的多態(tài)性信息含量分析

利用上述4785個多態(tài)性SNP標記在參試水稻種質(zhì)中共檢測出9570個等位基因，平均每個位點檢測出2個等位變異，多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍為0.0400～0.5957，中值為0.3639，眾數(shù)為0.0400，平均值為0.3123。多態(tài)性信息含量分布結果表明，在0.3～0.4范圍內(nèi)的多態(tài)性SNP數(shù)量出現(xiàn)峰值，達到2020個（圖2）；主基因頻率(MAF)變化范圍為0.3333～0.9792，中值為0.6667，眾數(shù)為0.5208，平均值為0.6972；基因多樣性指數(shù)(GD)變化范圍為 0.0408～0.6667，中 值 為0.4575，眾數(shù)為0.4965，平均值為0.3839。箱線圖結果顯示，水稻第2、5染色體上MAF、GD和PIC相對集中，第8、10和11則相對離散。在所有染色體中，第6染色體上的MAF中位數(shù)數(shù)值最大，但是GD和PIC數(shù)值最小。值得注意的是，基因多樣性指數(shù)在第2、5染色體上出現(xiàn)異常值，多態(tài)性信息含量在第2、3、5、7染色體上出現(xiàn)較多異常值（圖3）。

圖2 SNP標記在48份水稻種質(zhì)中多態(tài)性信息含量(PIC)的分布

圖3 參試種質(zhì)12條染色體上MAF(A)、GD(B)和PIC(C)比較

2.3 遺傳多樣性分析

聚類分析結果表明，參試種質(zhì)被劃分為2大類群，即秈稻亞群和粳稻亞群。秈稻亞群由25份種質(zhì)組成，其中18份為來自中國不同省份的秈稻品種（品系）、5份為連云港地區(qū)來源的秈型自生稻，2份為印度來源常規(guī)秈稻品種(Dular、N22)；粳稻亞群由23份種質(zhì)組成，其中18份為來自中國不同省份的粳稻品種（品系）、2份為來自連云港地區(qū)的粳型自生稻和3份普通野生稻（文昌野生稻、元江野生稻、東鄉(xiāng)野生稻）（圖4）。穞稻及其改良系被分類于粳稻亞群中，說明穞稻可作為栽培稻尤其是栽培粳稻遺傳改良的優(yōu)異種質(zhì)資源。

圖4 根據(jù)Nei’s遺傳距離的水稻資源UPGMA聚類圖

2.4 萌發(fā)耐淹性鑒定

參照聚類分析，將所有參試材料分為秈稻亞群和粳稻亞群進行萌發(fā)耐淹性鑒定。結果顯示，在低氧萌發(fā)狀態(tài)下，秈稻亞群的胚芽鞘長平均值為1.98 cm，而粳稻亞群的胚芽鞘長平均值為2.70 cm，兩者之間存在極顯著差異（圖5A），說明粳稻較秈稻具有更強的萌發(fā)耐淹能力?；诿劝l(fā)耐淹性的聚類分析結果顯示，萌發(fā)耐淹能力最強的4個種質(zhì)明顯聚為一類，這4個種質(zhì)分別是穞稻改良系、穞稻、SH16311和東鄉(xiāng)野生稻，在淹水條件下它們的平均胚芽鞘長均超過3.10 cm。參試秈稻種質(zhì)中萌發(fā)耐淹性最強的為贛73B，其在淹水情況下的胚芽鞘長度為2.46 cm，在所有參試種質(zhì)中排名第20，這也間接說明秈稻萌發(fā)耐淹能力弱于粳稻（圖5B）。值得注意的是，在萌發(fā)耐淹能力最強的4個資源中有3個是野生稻或雜草稻，進一步說明野生稻或雜草稻蘊含有較多優(yōu)異性狀，應加強對野生稻或雜草稻有利基因的挖掘和利用。

圖5 參試種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性比較及其聚類分析

3 討論與結論

穞稻是江蘇連云港地區(qū)特有的稻種資源，具有根系發(fā)達、分蘗能力強、抗旱、耐鹽等優(yōu)良性狀，能夠為栽培稻品種改良和生物技術研究提供豐富的基因資源，探討江蘇穞稻與秈粳栽培稻的遺傳多樣性對于指導穞稻的研究和利用有著重要的價值。1985年，江蘇省農(nóng)科院糧食作物研究所的蔣荷先生已開展穞稻特征特性的研究，從根系、莖稈、葉片、生育期、落粒性、休眠性、抗逆性等系統(tǒng)性的對穞稻進行了研究，充分肯定了穞稻的優(yōu)良特征特性，并呼吁加強穞稻的保護和利用[7]；陳增建等[22]于1990年對江蘇穞稻的核型進行了初步分析，表明穞稻染色體帶型豐富、特征明顯，為穞稻的生物學特性提供了細胞遺傳學方面的證據(jù)；2004年魏興華等[18]利用30對SSR標記比較了穞稻與野生稻以及亞洲栽培稻的遺傳差異，認為穞稻是較原始的亞洲栽培稻種粳稻類型，這與本研究結果是一致的，相比于RFLP、AFLP和SSR標記，本研究采用的SNP標記數(shù)量巨多且分布廣泛，能夠區(qū)分野生稻和栽培稻，也能將秈粳稻區(qū)分開，更能真實反映水稻品種間的親緣關系。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，基于檢測全基因組上各堿基變異的全基因組重測序技術將逐漸成為遺傳多樣性分析的有效方法。2007年井文等[23]利用秋光/穞稻/秋光BC1F1群體定位了2個花粉不育性QTL；隨后的2008年，其利用該群體檢測到4個控制種子休眠性的QTL和1個控制抽穗期的QTL[24]；2009年張啟武等[25]比較了穞稻與粳稻恢復系C堡籽粒灌漿速率，并對其進行遺傳分析。此后，鮮有關于江蘇穞稻的研究被報道，由此可見，穞稻的的發(fā)現(xiàn)和研究工作起步并不晚，但是此后真正的保護和利用工作卻十分滯后。

遺傳多樣性研究對種質(zhì)資源評價和利用具有重要意義，明確江蘇穞稻的遺傳背景，準確評估其與栽培稻間的遺傳多樣性，有利于穞稻優(yōu)異基因的挖掘和高效利用。從分子水平上看，PIC數(shù)值越大，物種間遺傳背景差異越大，遺傳多樣性越高。本研究利用4785個多態(tài)性SNP標記進行遺傳多樣性分析，PIC平均值為0.3123，介于0.25和0.50之間，按照BOTSTEIN等[26]的理論，參試種質(zhì)資源具有中度的多態(tài)性。此外遺傳多樣性分析能夠準確區(qū)分秈粳稻，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)來自印度的2個秈稻品種（Dular和N22）明顯歸為一類，說明不同地理來源間種質(zhì)資源遺傳多樣性差異較大，這可能是由于我國和印度接壤地區(qū)多為高海拔地帶，加之國界限制，導致兩國間水稻種質(zhì)資源逐漸形成了不同的遺傳背景。在國內(nèi)秈稻種質(zhì)中，來自廣東省的品種被歸為一類，表明來源相同的種質(zhì)在親緣關系上較近，遺傳差異較小，從一定程度上揭示中國同一地區(qū)品種遺傳基礎相對狹窄，亟需引入更多的優(yōu)異基因、拓寬品種的遺傳多樣性。在粳稻亞群里，3個普通野生稻（文昌野生稻、東鄉(xiāng)野生稻和元江野生稻）在聚類分析中和其他粳稻種質(zhì)資源差異較大，親緣關系較遠，屬于典型的野生稻種質(zhì)資源。穞稻及其改良系同樣被聚類于粳稻亞群中，說明從分子水平上看，穞稻更加接近粳稻類型，從形態(tài)學上，通過比較穞稻的粒型、穎毛，也驗證了聚類分析的結果。由于本研究中選用的種質(zhì)資源較少且種類不全，尤其是古老地方品種較少，穞稻的起源是由于栽培稻的突變野化還是原始粳稻與野生稻自然雜交的結果尚需更多的證據(jù)。與普通野生稻不同的是，穞稻和栽培粳稻品種間的親緣關系相對較近，但是穞稻較好的保留了普通野生稻的優(yōu)良性狀。由于穞稻和粳稻品種具有良好的親和力，與栽培粳稻配組更易成功，因此更加有利于穞稻優(yōu)良基因在栽培粳稻遺傳改良上的利用。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析也可以利用表型性狀進行。本研究對參試種質(zhì)進行了萌發(fā)耐淹性鑒定，并根據(jù)淹水條件下的胚芽鞘長度對參試種質(zhì)進行了聚類分析。結果表明，萌發(fā)耐淹能力最強的4個種質(zhì)均來自粳稻亞群，在淹水條件下平均胚芽鞘長均超過了3.10 cm，遠遠高于其他種質(zhì)，它們中有3個為野生稻或雜草稻，說明野生稻或雜草稻具有較強的萌發(fā)耐淹性，而栽培稻在馴化過程中丟失了該優(yōu)異等位基因，這可能和野生稻或雜草稻惡劣的生長環(huán)境相關，進一步說明野生稻或雜草稻含有較多的栽培稻所不具有的優(yōu)良性狀等位基因，是栽培稻改良的重要遺傳基礎，因此加強對野生稻或雜草稻遺傳多樣性研究及其就地保護工作十分必要。充分利用穞稻等雜草稻不同的遺傳特性，拓寬水稻新品種的遺傳基礎，對水稻種質(zhì)資源的開發(fā)和利用以及突破性重大品種的創(chuàng)制具有非常重要的現(xiàn)實意義。

本研究利用SNP分子標記技術對48份參試種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，并通過UPGMA法根據(jù)遺傳距離進行聚類分析。結果表明SNP可以有效用于供試材料的遺傳多樣性分析，參試種質(zhì)多態(tài)性信息含量(PIC)平均值為0.3123，基因多樣性指數(shù)(GD)的平均值為0.3839，表明參試種質(zhì)具有中度的多態(tài)性。聚類分析將穞稻劃分于粳稻亞群，說明穞稻與粳稻具有較近的親緣關系。表型鑒定結果表明，穞稻具有很強的耐低氧萌發(fā)能力。本研究為穞稻優(yōu)異基因的挖掘和創(chuàng)新利用提供理論參考。