鐘立強(qiáng) 王海驍 王明華* 張世勇 姜虎成 陳校輝*

(1. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所, 南京 210017; 2. 南通市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 南通 226000)

大口黑鱸(Micropterus salmoides), 又名加州鱸,原產(chǎn)于北美洲, 是美國(guó)重要的養(yǎng)殖和休閑垂釣品種[1]。1983年引入我國(guó)廣東后, 因其肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)迅速、抗病力強(qiáng), 迅速成為我國(guó)重要的特色淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi), 養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量不斷擴(kuò)大, “十一五”末全國(guó)產(chǎn)量18.59×107kg, 十三五末增加至61.95×107kg[2,3]。大口黑鱸生性?xún)疵? 在自然生態(tài)系統(tǒng)中是頂級(jí)肉食性魚(yú)類(lèi)。因此, 我國(guó)大口黑鱸的養(yǎng)殖長(zhǎng)期以海水冰鮮雜魚(yú)作為主要餌料。然而, 冰鮮魚(yú)餌料轉(zhuǎn)化率低,需求量大, 其野蠻捕撈對(duì)近海漁業(yè)資源和生態(tài)系統(tǒng)造成了難以估量的損失。同時(shí), 在養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期大量的冰鮮魚(yú)投喂也給養(yǎng)殖水體帶來(lái)了巨量的有機(jī)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)鹽, 導(dǎo)致養(yǎng)殖池塘水體富營(yíng)養(yǎng)化。此外, 冰鮮魚(yú)投喂存在將海水致病微生物和病毒帶入養(yǎng)殖池塘的風(fēng)險(xiǎn), 給大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大損失的虹彩病毒(Ranavirus)就可能來(lái)自海水冰鮮魚(yú)[4]。隨著國(guó)家推進(jìn)漁業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革, 實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖的迫切要求, 加快轉(zhuǎn)變水產(chǎn)養(yǎng)殖方式、持續(xù)改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境、提升產(chǎn)業(yè)發(fā)展質(zhì)量、全力推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的目標(biāo)已經(jīng)勢(shì)在必行。2020年, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部決定實(shí)施的水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖“五大行動(dòng)”中, 配合飼料替代幼雜魚(yú)行動(dòng)方案就包含在內(nèi)[5]。大口黑鱸養(yǎng)殖配合飼料取代冰鮮魚(yú)已經(jīng)在各主養(yǎng)省份強(qiáng)力開(kāi)展, 初步統(tǒng)計(jì), 全國(guó)配合飼料替代率平均已超70%。生產(chǎn)一線調(diào)研發(fā)現(xiàn), 冰鮮魚(yú)和配合飼料投喂池塘的產(chǎn)量相當(dāng), 配合飼料投喂的魚(yú)相對(duì)規(guī)格整齊, 但冰鮮魚(yú)投喂池塘?xí)幸徊糠拄~(yú)攝食能力強(qiáng), 生長(zhǎng)快, 可以提前上市, 獲得更高的養(yǎng)殖邊際收益。因此, 配合飼料完全替代幼雜魚(yú)的行動(dòng)存在一定的經(jīng)濟(jì)效益阻力, 依然需要加大推進(jìn)力度。

大口黑鱸配合飼料的前期研究主要關(guān)注于營(yíng)養(yǎng)需求和飼料配方[6—10], 目的是更好地改進(jìn)飼料,提高轉(zhuǎn)化效率。配合飼料投喂對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)[11—15]、肌肉營(yíng)養(yǎng)組成[12,13,16]、免疫和消化功能[11,13—15]的研究已經(jīng)廣泛開(kāi)展。研究表明餌料能改變魚(yú)類(lèi)的腸道菌群[17,18], 并通過(guò)微生物-腸-腦影響?hù)~(yú)類(lèi)的免疫和生長(zhǎng)[19,20]。大口黑鱸的投喂研究表明, 與冰鮮雜魚(yú)相比, 人工配合飼料降低了大口黑鱸腸道菌群多樣性, 也抑制了擬桿菌等有益菌在大口黑鱸腸道內(nèi)的分布[21]。但是該研究采用的變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù), 對(duì)于腸道菌群只能定性研究,且菌群識(shí)別度也存在一定的缺陷。因此, 本研究通過(guò)對(duì)腸道菌群的16S rRNA的V3?V4區(qū)進(jìn)行Illumina測(cè)序, 探討冰鮮魚(yú)和配合飼料對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和腸道菌群的影響, 以期為大口黑鱸配合飼料改進(jìn)和冰鮮魚(yú)替代提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)置

試驗(yàn)在江蘇省淡水水產(chǎn)研究所浦口基地開(kāi)展,選擇標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖池塘6個(gè)(面積0.3公頃左右, 水深1.5 m)。5月初, 按22500 條/公頃的密度投放5 cm左右的大口黑鱸苗。試驗(yàn)設(shè)冰鮮魚(yú)組(B)、配合飼料組(S)和冰鮮魚(yú)配合飼料混合組(H), 每組2個(gè)重復(fù)。每日早晚兩次投喂, 首月配合飼料投喂量為魚(yú)體重4%, 之后逐步下降, 9—10月投喂量為2%, 冰鮮魚(yú)投喂量為配合飼料的4倍, 混合組上午投喂配合飼料,下午投喂冰鮮魚(yú)。配合飼料為加州鱸膨化配合飼料(浙江欣欣天恩水產(chǎn)飼料股份有限公司), 飼料成分和營(yíng)養(yǎng)組成為: 粗蛋白≥45.0%, 粗脂肪≥10.0%,粗纖維≤5.0%, 粗灰分≤16.0%, 水分≤10.0%, 總磷=1.0%—3.0%, 賴(lài)氨酸≥2.5%。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)養(yǎng)殖周期5個(gè)月, 期間所有池塘開(kāi)展正常養(yǎng)殖管理。10月中旬養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束, 饑餓24h后, 每口池塘旋網(wǎng)隨機(jī)捕撈15尾個(gè)體(每組30尾), 測(cè)量體長(zhǎng)、體重, 用解剖剪沿肛門(mén)向上朝前呈弧形剪開(kāi)腹腔, 完整取出內(nèi)臟, 測(cè)量?jī)?nèi)臟、肝臟和魚(yú)體空殼重。

每個(gè)試驗(yàn)組取5尾魚(yú), 用消毒后的解剖剪將腸道剪下, 置于酒精消毒過(guò)的解剖盤(pán), 酒精棉擦拭腸管外壁后, 收集腸道內(nèi)容物, 液氮速凍后, –80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采水器采集每口池?處表層的50 cm水樣, 放入滅菌塑料瓶。水樣放入4℃保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室, 分析時(shí)樣品為每組6個(gè)點(diǎn)水樣的混合樣。取300 mL混合水樣經(jīng)0.22 μm的聚碳酸酯膜(Millipore, Cork, Ireland)負(fù)壓過(guò)濾, 得到3組濾膜樣品(ST), 置于2 mL的無(wú)菌離心管, ?80℃超低溫冰箱冷凍保存。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

水樣濾膜剪碎后, 微生物DNA利用E.Z.N.ATMWater DNA Kit(Omega, USA)試劑盒提取; 腸道微生物DNA使用E.Z.N.ATMSoil DNA Kit(Omega,USA)試劑盒提取, 具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。使用NanoDrop2000對(duì)DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。以通用引物338F和806R擴(kuò)增16S rRNA基因V3—V4區(qū)[22], 擴(kuò)增區(qū)域長(zhǎng)度約450 bp, 建庫(kù)及Illumina Miseq測(cè)序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生物信息學(xué)分析前, 先用Trimmomatic軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控, 再用FLASH軟件完成序列拼接。生信分析利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司生信云平臺(tái)完成(http://www.i-sanger.com/)。使用UPARSE軟件(7.1)將序列以97%的相似性進(jìn)行OTU聚類(lèi)。利用RDP classifier(V2.2)對(duì)序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋, 比對(duì)參考數(shù)據(jù)庫(kù)為Silva_13816S rRNA database[23], 統(tǒng)計(jì)微生物分類(lèi)水平的組成。后續(xù)分析前, 根據(jù)最少序列數(shù)進(jìn)行抽平。利用Mothur軟件(V 1.30.2)評(píng)估微生物群落的α多樣性; 非度量多維尺度分析(NMDS)評(píng)估微生物群落的β多樣性。通過(guò)多物種線性差異判別分析(LEfSe), 找出不同投喂組顯著性差異的菌群[24]。利用PICRUSt菌群代謝功能預(yù)測(cè)工具與基因功能譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 推測(cè)微生物群落的功能類(lèi)別豐度信息[25]。

1.5 計(jì)算公式

增重率(Weight growth rate,WGR, %)=100×(末體重–初體重)/初體重;

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100×(ln末體重–ln初體重)/試驗(yàn)天數(shù);

飼料系數(shù)(Feed Conversion Rate,FCR)=飼料投喂量/(末體重–初體重);

肥滿(mǎn)度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×魚(yú)體重/魚(yú)體長(zhǎng)3;

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=100×肝臟重/魚(yú)體重;

臟體比(Viscerasomatic index,VSI)=100×內(nèi)臟重/魚(yú)體重;

空殼體質(zhì)比(Deinternal organ rate,DOR)=100×空殼重/魚(yú)體重。

1.6 數(shù)據(jù)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示, 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件以飼料為單因素作方差分析(Oneway ANOVA), 統(tǒng)計(jì)顯著水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同餌料對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)的影響

表1顯示, 配合飼料組試驗(yàn)魚(yú)的末均重、體長(zhǎng)、增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著低于冰鮮魚(yú)組和混合投喂組(P<0.05), 混合投喂組最后養(yǎng)成規(guī)格最大, 生長(zhǎng)速度也最快, 但與冰鮮魚(yú)組差異不顯著(P>0.05)。餌料系數(shù)配合飼料組則顯著低于冰鮮魚(yú)和混合投喂組(P<0.05)。在3組魚(yú)中, 冰鮮魚(yú)組的個(gè)體肥滿(mǎn)度最高, 顯著高于配合飼料組(P<0.05); 混合投喂組居中, 與其他兩組無(wú)顯著差異(P>0.05)。而臟體比剛好相反, 配合飼料組最高, 混合投喂組居中, 兩組都顯著高于冰鮮魚(yú)組(P<0.05)。肝體比則是配合飼料組最高, 冰鮮魚(yú)組其次, 混合投喂組最低, 3組間存在顯著性的差異(P<0.05)。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)和多樣性

Illumina測(cè)序共獲得909538條序列, 平均每個(gè)樣品有50529條序列, 序列平均長(zhǎng)度為440 bp。按97%相似度聚類(lèi)后得到2418個(gè)OTUs, 分屬于38門(mén)、108綱、248目、428科、 892屬、1467種。

稀釋曲線分析中所有樣本的都接近平緩, 表明測(cè)序深度能夠反映每個(gè)樣本細(xì)菌群落的生物信息。選取Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映試驗(yàn)大口黑鱸腸道菌群的α多樣性, 結(jié)果顯示, 配合飼料投喂組Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)最高, 即其腸道菌群物種的豐富度最高, 冰鮮魚(yú)組最低, 混合投喂組居中; 但冰鮮魚(yú)組Shannon指數(shù)最高、Simpson指數(shù)最低, 腸道菌群多樣性最高, 配合飼料投喂組次之, 混合投喂組最低(表2)。

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)及菌群多樣性分析Tab. 2 Numbers of reads and diversity indexs of different samples

非度量多維尺度分析(NMDS)展示不同投喂組大口黑鱸腸道菌群的β多樣性。從NMDS分布圖可見(jiàn)(圖1), 所有分組的樣本呈現(xiàn)出較好聚類(lèi)趨勢(shì), 所有組別可以明顯區(qū)分, 同一組別內(nèi)的樣品間距離更近, 其微生物群落也更相似(R2=0.4366,P=0.001)。NMDS分析的stress值為0.131表明排序結(jié)果相對(duì)可靠。

圖1 大口黑鱸腸道菌群NMDS排序圖Fig. 1 NMDS plot of the compositional dissimilarities of the bacterial communitiesB. 冰鮮魚(yú)組; S. 配合飼料組; H. 混合投喂組; ST. 養(yǎng)殖池塘水體B. Frozen fish group samples; S. Formulated feed group samples;H. Group samples; ST. Water samples of three ponds

2.3 腸道微生物群落組成

韋恩圖表明, 不同投喂組大口黑鱸腸道菌群樣本中OTU數(shù)量從高到低為冰鮮魚(yú)組>混合投喂組>配合飼料組, 且3組魚(yú)類(lèi)腸道菌群的OTU數(shù)量遠(yuǎn)高于養(yǎng)殖池塘水體菌群(圖2)。4組樣本共享的OTU150個(gè), 占全部OTU的6.20%, 而3個(gè)投喂組大口黑鱸腸道菌群間共享OTU為206個(gè), 占比8.52%。3個(gè)投喂組之間, 冰鮮魚(yú)組和混合投喂組共享OTU最多, 為159個(gè), 而冰鮮魚(yú)組和配合飼料組之間共享OTU最少, 僅83個(gè)。冰鮮魚(yú)組獨(dú)有OTU也最多, 有579個(gè),混合投喂組次之, 為459個(gè), 配合飼料組最少, 僅263個(gè)。不同餌料對(duì)腸道菌群造成了明顯的影響。

圖2 不同組別OTUs的韋恩圖Fig. 2 The venn diagram of each groups’s OTUs

ANOSIM檢驗(yàn)表明4個(gè)組別樣品間細(xì)菌群落組成在門(mén)水平上存在顯著性差異(P=0.029)。鑒定出的38個(gè)門(mén)中, 厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteriota)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetota)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota)是主要菌門(mén), 其余30個(gè)門(mén)相對(duì)豐度都低于1%。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)是4個(gè)組的優(yōu)勢(shì)菌群, 相對(duì)豐度都超過(guò)了50%(圖3a)。3個(gè)投喂組間比較, 冰鮮魚(yú)組藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)相對(duì)豐度最高, 配合飼料組則是變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線菌門(mén)(Actinobacteriota)相對(duì)豐度最高, 混合投喂組則是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetota)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota)相對(duì)豐度最高。養(yǎng)殖水體的群落結(jié)構(gòu)與腸道菌群存在著明顯的差異。單因素方差分析(One-way ANOVA)顯示, 厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在4個(gè)試驗(yàn)組間存在顯著性差異(P=0.02)。

圖3 不同試驗(yàn)組在門(mén)和屬水平物種相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of species in phylum and genus levela. 門(mén)水平; b. 屬水平a. Phylum level; b. Genus level

屬水平上(圖3b), 冰鮮魚(yú)組的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為支原體屬(Mycoplasma, 27.45%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella, 12.63%)及聚球菌屬(Synechococcus_CC9902, 6.53%); 配合飼料組優(yōu)勢(shì)菌屬分別為克雷伯氏菌屬(Klebsiella, 27.78%)、羅姆布茨菌(Romboutsia, 15.26%)及分枝桿菌屬(Mycobacterium,15.25%); 混合投喂組優(yōu)勢(shì)菌屬則是支原體屬(Mycoplasma, 40.91%)、厭氧氨氧化菌(Candidatus_Brocadia, 7.70%)及羅姆布茨菌(Romboutsia, 5.58%);而養(yǎng)殖水體中菌屬與大口黑鱸腸道菌群存在明顯的差異, 優(yōu)勢(shì)菌群主要是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter,21.40%)、(hgcI_clade, 8.07%)、微小桿菌屬(Exiguobacterium, 7.87%)及棲湖菌屬(Limnohabitans,7.52%)。單因素方差分析(One-way ANOVA)顯示,在主要菌屬中, 支原體屬 (Mycoplasma)在4個(gè)試驗(yàn)組間存在顯著性差異(P=0.01)。

2.4 菌群差異性分析

為了進(jìn)一步分析不同餌料對(duì)大口黑鱸腸道菌群的影響, 采用LefSe軟件對(duì)3組腸道菌群樣本進(jìn)行線性判別分析(LDA), 以找到對(duì)不同投喂方法顯著性響應(yīng)的類(lèi)群。對(duì)LDA判別值大于4的細(xì)菌類(lèi)群進(jìn)行分析, 共有不同分類(lèi)水平的25個(gè)細(xì)菌類(lèi)群在3個(gè)投喂組間具有顯著差異(P<0.05, 圖 4)。3個(gè)投喂組的顯著優(yōu)勢(shì)菌群都相對(duì)集中, 冰鮮魚(yú)組集中于擬桿菌門(mén)(Bacteroidota), 擬桿菌目(Bacteroidia), 擬桿菌綱(Bacteroidales), 以及海水藍(lán)藻藍(lán)菌屬(Cyanobium)和聚球菌屬(Synechococcus); 配合飼料組顯著性?xún)?yōu)勢(shì)菌群包括放線菌綱下的分枝桿菌和PeM15等6個(gè)類(lèi)群, 以及厚壁菌門(mén)下的芽孢桿菌科(Bacillaceae);混合投喂組顯著性?xún)?yōu)勢(shì)菌群則包括芽孢桿菌綱(Bacilli)下支原體目(Mycoplasmatales)的4個(gè)類(lèi)群,以及小月菌屬(Microlunatus)和羅氏菌屬(Roseburia)。

圖4 不同餌料組間差異性菌群多物種線性差異判別分析Fig. 4 LEfSe identified the most differentially abundant taxa in different diet groups

2.5 細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)

利用PICRUSt 對(duì)不同投喂組大口黑鱸腸道菌群細(xì)菌群落的16S rRNA基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)?；诟鳂悠稫EGG比對(duì)獲得的功能信息組成, 共獲得322個(gè)代謝功能途徑。KEGG代謝通路分析表明: 不同投喂組大口黑鱸腸道微生物主要參與新陳代謝, 其次參與遺傳信息處理和環(huán)境信息處理(表3)。COG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明: 配合飼料投喂組大口黑鱸腸道菌群在“能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化”“碳水化合物運(yùn)輸和代謝”“氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝”和“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝”等功能類(lèi)群的相對(duì)豐度高于冰鮮魚(yú)組和混合投喂組, 冰鮮魚(yú)組大口黑鱸腸道菌群在“核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”“輔酶運(yùn)輸和代謝和翻譯”“核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生”等功能類(lèi)群的相對(duì)豐度高于配合飼料投喂組和混合投喂組(圖5)。

圖5 不同投喂組腸道微生物的COG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)Fig. 5 The COG function classification of intestinal microorganisms in different dietA. RNA處理和修飾RNA processing and modification; B. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)Chromatin structure and dynamics; C. 能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化Energy production and conversion; D. 細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分裂Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E. 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝Amino acid transport and metabolism; F. 核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝Nucleotide transport and metabolism; G. 碳水化合物運(yùn)輸和代謝Carbohydrate transport and metabolism; H. 輔酶運(yùn)輸和代謝Coenzyme transport and metabolism; I. 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝Lipid transport and metabolism;J. 翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生Translation, ribosomal structure and biogenesis; K. 轉(zhuǎn)錄Transcription; L. 復(fù)制、重組和修復(fù)Replication, recombination and repair; M. 細(xì)胞壁/膜/信封生源論Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N. 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)Cell motility; O. 翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P. 無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸與代謝Inorganic ion transport and metabolism; Q. 次生代謝產(chǎn)物的合成、運(yùn)輸和分解代謝Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R. 一般功能預(yù)測(cè)General function prediction only; S. 功能未知Function unknown; T. 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制Signal transduction mechanisms; U. 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V. 防御機(jī)制Defense mechanisms; W. 真核細(xì)胞的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)Extracellular structures; Y. 核結(jié)構(gòu)Nuclear structure; Z. 細(xì)胞骨架Cytoskeleton

表3 KEGG代謝通路統(tǒng)計(jì)Tab. 3 Metabolic pathway statistics based on KEGG

3 討論

3.1 不同餌料對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)的分析

飼料是養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源,因此決定著魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育, 對(duì)魚(yú)類(lèi)的健康免疫功能也具有重要影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 不同餌料對(duì)大口黑鱸的生長(zhǎng)具有顯著影響(P<0.05), 配合飼料投喂組試驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)顯著低于冰鮮魚(yú)和混合投喂組。這與大菱鲆(Scophthalmus maximus)[26]、斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)[27]和珍珠龍膽石斑魚(yú)(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂)[28]等肉食性魚(yú)類(lèi)的養(yǎng)殖對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果一致。究其原因, 可能是冰鮮魚(yú)的誘食效果好, 適口性強(qiáng), 更利于大口黑鱸的攝食、消化與吸收。解剖取樣現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn), 3組大口黑鱸腹腔內(nèi)臟團(tuán)都被脂肪包裹, 這是由餌料中過(guò)高的能量/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比所致[29],能量物質(zhì)攝入體內(nèi)部分用于新陳代謝, 過(guò)量部分就以脂肪的形式沉積在體內(nèi)組織中。配合飼料中碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)含量高于冰鮮魚(yú)[30], 其餌料系數(shù)顯著低于冰鮮魚(yú), 飼料利用轉(zhuǎn)化效率極高。而冰鮮魚(yú)能量物質(zhì)含量低, 水分占比極高(通常在65%—70%)[26,30], 因此其利用轉(zhuǎn)化效率極低, 投喂量是配合飼料的4倍。3組魚(yú)腹腔內(nèi)都存在大量脂肪, 說(shuō)明日常養(yǎng)殖過(guò)程中配合飼料和冰鮮魚(yú)的投喂量可能超出了大口黑鱸的需求。目前大口黑鱸養(yǎng)殖的普遍存在多投喂、早上市, 追求市場(chǎng)邊際效益最大化的現(xiàn)象, 這種養(yǎng)殖模式, 導(dǎo)致脂肪的大量沉積, 影響了魚(yú)類(lèi)健康, 同時(shí)加重了養(yǎng)殖環(huán)境的生態(tài)負(fù)擔(dān)。我國(guó)水產(chǎn)行業(yè)已經(jīng)從片面追求快速發(fā)展轉(zhuǎn)換至提質(zhì)增效綠色發(fā)展的新階段, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部實(shí)施的水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖“五大行動(dòng)”中推廣實(shí)施生態(tài)健康養(yǎng)殖模式、減少水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥量、配合飼料替代幼雜魚(yú)都是大口黑鱸養(yǎng)殖未來(lái)需要積極改變的地方。使用配合飼料養(yǎng)殖對(duì)魚(yú)類(lèi)健康和養(yǎng)殖環(huán)境都有著顯著的優(yōu)勢(shì)。但是, 大口黑鱸配合飼料還需要參考冰鮮魚(yú)優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)特性, 優(yōu)化和調(diào)整營(yíng)養(yǎng)配方, 提升配合飼料的品質(zhì), 減少蛋白質(zhì)浪費(fèi), 減輕環(huán)境污染, 有效促進(jìn)大口黑鱸的健康生長(zhǎng), 最終提高出肉率, 降低體脂率, 增加養(yǎng)殖效益。

3.2 不同餌料對(duì)大口黑鱸腸道菌群多樣性的影響分析

腸道微生物定植于宿主腸道中, 在宿主體內(nèi)平衡、腸道發(fā)育、代謝, 甚至神經(jīng)發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用[31]。研究表明餌料能改變魚(yú)類(lèi)的腸道菌群,并通過(guò)腸-腦軸調(diào)節(jié)魚(yú)類(lèi)的免疫、生長(zhǎng)和行為[19]。在本研究中, 不同餌料的投喂顯著改變了大口黑鱸的腸道微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。α-多樣性分析結(jié)果表明, 配合飼料投喂組腸道菌群豐富度最高(由Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)表征), 但是腸道菌群的多樣性明顯降低(由Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征)。該結(jié)果與大口黑鱸[21]、烏鱧(Ophiocephalus argus)[31]、花鱸(Lateolabrax japonicus)和日本黃姑魚(yú)(Nibea japonica)[32]等多種魚(yú)類(lèi)的研究結(jié)論一致,原因可能是: (1)配合飼料生產(chǎn)過(guò)程中的高溫高壓膨化步驟殺滅了絕大多數(shù)微生物, 而冰鮮魚(yú)則攜帶了大量的微生物, 因此冰鮮魚(yú)被攝食后, 攜帶的一部分微生物會(huì)在腸道定植, 從而改變養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的腸道菌群; (2)配合飼料中碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)含量過(guò)高, 導(dǎo)致參與運(yùn)輸和代謝的微生物豐度大幅增加, 多樣性反而下降。β多樣性排序分析樣本呈現(xiàn)出較好聚類(lèi)趨勢(shì), 所有組別可以明顯區(qū)分, 也表明餌料對(duì)大口黑鱸的腸道微生物影響顯著, 而養(yǎng)殖水體微生物對(duì)于腸道微生物影響相對(duì)較小。

3.3 不同餌料對(duì)大口黑鱸腸道菌群組成和功能的影響分析

不同餌料的投喂也顯著改變了大口黑鱸的腸道微的群落結(jié)構(gòu)(圖3)。冰鮮魚(yú)組藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)相對(duì)豐度最高。進(jìn)一步的線性判別分析表明, 冰鮮魚(yú)組特異性菌群主要集中于擬桿菌門(mén)(Bacteroidota), 擬桿菌目(Bacteroidia), 擬桿菌綱(Bacteroidales), 以及海水藍(lán)藻藍(lán)菌屬(Cyanobium)和聚球菌屬(Synechococcus)。藍(lán)藻門(mén)細(xì)菌是養(yǎng)殖水體常見(jiàn)菌群, 屬水平分析發(fā)現(xiàn)主要是海水藍(lán)藻的聚球菌屬(Synechococcus_CC9902),混合投喂組也有發(fā)現(xiàn)這些海水藍(lán)藻藍(lán)菌, 但配合飼料組卻沒(méi)有, 這應(yīng)該是海水冰鮮魚(yú)餌料中所攜帶,攝食后進(jìn)入大口黑鱸腸道。擬桿菌是冰鮮組大口黑鱸腸道特異性細(xì)菌的結(jié)果與先前的研究一致[21]。擬桿菌能夠幫助宿主分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 提高消化吸收率并維持腸道微生態(tài)平衡, 其豐度與宿主脂肪含量密切相關(guān), 而腸道內(nèi)擬桿菌與厚壁菌的比例直接影響宿主的脂肪積累, 肥胖時(shí)脂肪積累主要與厚壁菌增加有關(guān), 而健康動(dòng)物的腸道則是擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)的細(xì)菌較多[33]。配合飼料組則是變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線菌門(mén)(Actinobacteriota)相對(duì)豐度最高, 優(yōu)勢(shì)菌屬為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)和分枝桿菌屬(Mycobacterium)。混合投喂組厚壁菌門(mén)(Firmicutes)豐度明顯增加, 優(yōu)勢(shì)菌屬則是支原體屬(Mycoplasma)、厭氧氨氧化菌屬(Candidatus_Brocadia)及羅姆布茨菌屬(Romboutsia)。支原體是水生動(dòng)物易感染的致病菌, 會(huì)破壞宿主免疫的系統(tǒng)并參與其他致病病變的發(fā)展和誘導(dǎo)疾病的加重[34], 混合投喂組和冰鮮魚(yú)組支原體屬(Mycoplasma)的豐度都顯著高于配合飼料組, 可能是冰鮮魚(yú)餌料所攜帶。冰鮮魚(yú)水分含量高, 相比于標(biāo)準(zhǔn)化加工的配合飼料會(huì)攜帶更多微生物, 同時(shí), 冰鮮魚(yú)投喂量是配合飼料的4倍, 因此也更容易將所攜帶的微生物通過(guò)攝食傳遞定植與大口黑鱸腸道。所以, 從魚(yú)類(lèi)健康和食品質(zhì)量安全角度評(píng)估, 配合飼料具有明顯的安全優(yōu)勢(shì)?？死撞暇鷮?Klebsiella)也屬于條件致病菌, 能通過(guò)糖酵解和戊糖磷酸途徑降解碳水化合物[35], 羅姆布茨菌屬(Romboutsia)能將宿主難以消化的大分子碳水化合物發(fā)酵代謝為丁酸等短鏈脂肪酸, 降低腸道pH,提高宿主的免疫調(diào)節(jié)能力, 維持腸道微生態(tài)平衡[36]。這些菌群在配合飼料和混合投喂組是優(yōu)勢(shì)菌, 與配合飼料碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)含量有關(guān), 碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)含量需要更多的相關(guān)菌群進(jìn)行代謝。細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè), 進(jìn)一步證實(shí)了餌料對(duì)大口黑鱸腸道群落結(jié)構(gòu)的顯著影響。配合飼料含有較高的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì), 因此腸道菌群在“能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化”“碳水化合物運(yùn)輸和代謝”“氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝”和“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝”等功能類(lèi)群的相對(duì)豐度也高。

總之, 餌料對(duì)大口黑鱸的生長(zhǎng)和腸道微生物都具有顯著的影響。冰鮮魚(yú)投喂組生長(zhǎng)顯著高于配合飼料投喂組, 表明現(xiàn)有配合飼料在誘食效果, 適口性及營(yíng)養(yǎng)成分等方面依然無(wú)法滿(mǎn)足魚(yú)體及其腸道菌群的需求?；旌贤段菇M生長(zhǎng)最快, 表明冰鮮魚(yú)并非最佳餌料, 配合飼料中添加的必需氨基酸、微量元素等營(yíng)養(yǎng)物也促進(jìn)了大口黑鱸的生長(zhǎng)。因此,今后的大口黑鱸專(zhuān)用配合飼料的研發(fā), 可以參考冰鮮魚(yú)優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)特性, 優(yōu)化和調(diào)整營(yíng)養(yǎng)配方, 同時(shí)根據(jù)大口黑鱸的營(yíng)養(yǎng)需求添加益生物質(zhì), 更好地促進(jìn)大口黑鱸健康生長(zhǎng)。