榮 華 李德強(qiáng) 馬敏偉 豆騰飛 史慶超 孔令富 畢保良 寧麗軍

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院, 廣州 510642; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201; 3. 內(nèi)江師范學(xué)院, 長(zhǎng)江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)江 641112)

氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的前體分子, 還可以作為信號(hào)分子介導(dǎo)一系列通路調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成, 進(jìn)而發(fā)揮生理功能, 如亮氨酸、精氨酸及谷氨酰胺等支鏈氨基酸可以作為信號(hào)分子激活mTOR、TGF-β和GCN2等通路[1,2]。脯氨酸(Pro)作為膠原蛋白合成的底物, 可以調(diào)控膠原蛋白代謝,促進(jìn)損傷組織的修復(fù)[3]。有研究表明, 在復(fù)雜的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)機(jī)制中, Pro參與調(diào)控基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄因子活化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化還原反應(yīng), 同時(shí)在鳥氨酸、精氨酸、多胺、谷氨酸代謝和膠原蛋白合成等方面發(fā)揮著重要作用, 且Pro的可用性決定了膠原蛋白生物合成的速率[4,5]。許多研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加Pro能夠促進(jìn)魚類膠原蛋白沉積[5—8], 然而關(guān)于Pro促進(jìn)魚類膠原蛋白沉積的作用機(jī)制缺乏深入研究。有學(xué)者通過對(duì)人類Ⅰ型膠原蛋白α2(Col1α2)基因啟動(dòng)子功能分析發(fā)現(xiàn), 參與Col1α2啟動(dòng)子內(nèi)在活性上調(diào)的序列位于啟動(dòng)子-353和-186 bp之間, 這個(gè)區(qū)域包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn), 包括Smads、Sp1?3和Ets家族等[9]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)/Smads信號(hào)通路是調(diào)控膠原蛋白代謝的經(jīng)典途徑之一, 主要參與細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白的沉積[10—12]。有學(xué)者在探討“脆肉鯇”形成機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn), 蠶豆通過上調(diào)Smad4基因的表達(dá)來激活TGF-β/Smads通路的活性,進(jìn)而上調(diào)Col1α1和Col1α2基因的表達(dá), 最終促進(jìn)肌肉中膠原蛋白沉積, 改善肌肉品質(zhì)[13]。Pro促進(jìn)魚類膠原蛋白沉積是否也受TGF-β/Smads信號(hào)通路的調(diào)控呢? 目前研究發(fā)現(xiàn)許多TGF-β/Smads信號(hào)通路的干擾劑, 如積雪草皂苷(Asiaticoside)[14]、β-拉帕醌(β-Lapachone)[15]和氧化苦參堿(Oxymatrine)[16,17]等可以作用于TGF-β/Smads通路中特定配體, 使整個(gè)信號(hào)通路效應(yīng)發(fā)生變化, 最終導(dǎo)致機(jī)體合成膠原蛋白的能力發(fā)生相應(yīng)變化。Oxymatrine的分子式:C15H24N2O2, 是一種來自槐屬植物根部的生物堿,具有抗炎, 抗纖維化和抗腫瘤的作用, 能抑制iNOS表達(dá)和TGF-β/Smads信號(hào)通路, 已在醫(yī)學(xué)上被廣泛應(yīng)用于癌癥藥物的開發(fā)[18]。

淺色黃姑魚(Nibea coibor)俗稱白奈, 隸屬鱸形目, 石首魚科, 黃姑魚屬, 該魚生長(zhǎng)快、魚鰾大、營養(yǎng)價(jià)值高, 是我國東南沿海地區(qū)用于生產(chǎn)名貴魚膠(白花膠, 目前市場(chǎng)價(jià)格為10000—15000元/kg)的重要海水養(yǎng)殖品種[19]。魚膠(魚鰾的干制品)富含膠原蛋白, 營養(yǎng)價(jià)值極高, 與燕窩、魚翅齊名, 系“海洋八珍”之一, 又有“海洋人參”之譽(yù)[20]。然而, 目前關(guān)于魚鰾膠原蛋白的研究鮮有報(bào)道, 嚴(yán)重制約了魚膠產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和規(guī)?；M(jìn)程。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)Pro對(duì)淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白沉積具有促進(jìn)作用, 并推測(cè)TGF-β/Smads信號(hào)通路潛在參與Pro促進(jìn)魚鰾膠原蛋白沉積的調(diào)控[6,7,21], 然而以上推測(cè)還需進(jìn)一步證實(shí)。因此, 本研究在添加Pro后, 利用Oxymatrine干擾TGF-β/Smads信號(hào)通路, 分析Pro添加/干擾前后, 魚鰾膠原蛋白沉積的變化情況, 驗(yàn)證TGF-β/Smads信號(hào)通路參與調(diào)控 Pro促進(jìn)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以豐富魚類膠原蛋白代謝研究的基礎(chǔ)理論, 為魚類膠原蛋白代謝的營養(yǎng)調(diào)控提供新思路和新方法, 對(duì)深度挖掘和高效利用海洋產(chǎn)膠魚類魚鰾資源具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 飼料配置

1.2 實(shí)驗(yàn)魚及飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在廣東省汕頭市南澳縣汕頭大學(xué)海洋生物臨海實(shí)驗(yàn)站中進(jìn)行。淺色黃姑魚購自當(dāng)?shù)氐囊粋€(gè)苗種孵化場(chǎng)。在幼魚購回后, 暫養(yǎng)在一個(gè)大的浮動(dòng)網(wǎng)箱(3 m×3 m×2 m, 長(zhǎng)×寬×深)2周, 期間投喂商業(yè)飼料(粗蛋白40.0%, 粗脂肪10.0%, 揭陽通威,中國)。實(shí)驗(yàn)前, 魚先禁食24h, 同時(shí)用40 mg/L丁香酚溶液(阿拉丁試劑有限公司, 中國)麻醉, 稱重并分組。225條實(shí)驗(yàn)魚(11.621±0.154) g被隨機(jī)分入9個(gè)網(wǎng)箱(1 m×1 m×1.5 m, 長(zhǎng)×寬×深), 25尾魚/網(wǎng)箱。

2組等氮等脂的實(shí)驗(yàn)飼料配制參考前期研究[6],以魚粉、混合氨基酸和結(jié)晶氨基酸為主要蛋白來源, 魚油為主要脂質(zhì)來源。Blank組無額外添加Pro;Pro組添加15 g/kg Pro, 用丙氨酸來平衡各實(shí)驗(yàn)飼料中的氮, 參考美國國家科學(xué)研究委員會(huì)(NRC, 2011)中大黃魚的營養(yǎng)需求設(shè)計(jì)其他營養(yǎng)成分的含量。實(shí)驗(yàn)飼料原料組成和營養(yǎng)成分如表 1所示, 飼料氨基酸組成如表 2所示。飼料原料過60目篩, 經(jīng)充分徹底混合, 用2.5 mm直徑的膨化機(jī)制粒, 在自然通風(fēng)環(huán)境中風(fēng)干。干顆粒飼料被密封在塑料袋里存儲(chǔ)在?20℃, 直到使用。3個(gè)網(wǎng)箱一組被隨機(jī)分配到3個(gè)處理組(Blank、Pro和Oxymatrine), Blank為空白組, 飼喂Pro零添加飼料, Pro和Oxymatrine實(shí)驗(yàn)組飼喂Pro添加飼料。開展為期8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn), 在第4周后開始干擾實(shí)驗(yàn)。Oxymatrine實(shí)驗(yàn)組采用腹腔注射氧化苦參堿(Oxymatrine)。Oxymatrine試劑購買于MedChem-Express(MCE)公司(中國, 上海), 粉末狀的Oxymatrine在使用前用含DMSO的溶劑溶解, 然后用生理鹽水按1﹕20比例稀釋成注射液。一定濃度的DMSO對(duì)魚體有毒副作用, 結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 實(shí)驗(yàn)魚腹腔注射液體100 μL/次無死亡, 首先確定了Oxymatrine的稀釋及注射方案如下: 在超聲輔助下100 mg Oxymatrine溶于1 mL DMSO(100 mg/mL),并按照上述方案稀釋成注射液(終濃度5 mg/mL)。參考文獻(xiàn)確定給藥量為10 mg/kg[16,17], 當(dāng)時(shí)魚重約50 g, 所以按照100 μL/尾給藥。為了消除注射應(yīng)激和溶劑對(duì)魚體基礎(chǔ)代謝的影響, 減少實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差,Blank和Pro實(shí)驗(yàn)組等量注射Oxymatrine的溶劑。在8周的飼養(yǎng)期內(nèi), 每天人工飽食投餌兩次(07:00和16:30), 觀察記錄魚的健康狀況及環(huán)境變化等, 在實(shí)驗(yàn)過程中, 光照時(shí)間13—14h, 溫度23—30℃, pH 7.8—8.1, 氨氮低于0.05 mg/L, 鹽度31—33 g/L, 溶解氧5.2—6 mg/L。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及近似成分Tab. 1 Formulation and proximate composition of the experimental diets

表2 實(shí)驗(yàn)飼料的氨基酸組成Tab. 2 Amino acid contents of experimental diets (μmol/g dry matter)

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 停食24h, 采用丁香酚(100 mg/L,上海試劑, 中國)麻醉, 稱重并計(jì)數(shù), 計(jì)算魚的生長(zhǎng)和飼料利用率。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)選取6尾實(shí)驗(yàn)魚, 測(cè)量個(gè)體體重和體長(zhǎng), 計(jì)算肥滿度和特定生長(zhǎng)率等指標(biāo); 屠宰取魚鰾稱重, 計(jì)算鰾體比, 將魚鰾置于–20℃用于后續(xù)膠原蛋白含量的測(cè)定。采集肝臟用于組織切片觀察, 取出的肝臟(右側(cè))分成小塊(1 cm×1 cm)固定于Bouin’s 液中。此外, 另取4尾/網(wǎng), 用于采集魚鰾組織, 將樣本分成兩份, 一份置于–20℃用于后續(xù)氨基酸分析, 另一份快速收集好后立即浸入液氮, 隨后儲(chǔ)存在–80℃用于RNA的提取和基因表達(dá)分析。

1.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

肝臟組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)在武漢賽維爾生物科技有限公司協(xié)助下完成, 實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單介紹如下: 將新鮮的組織樣品通過4%多聚甲醛固定24h; 用75%酒精-無水乙醇按梯度脫水6h; 使用二甲苯透明2次, 每次10min, 浸蠟3次, 每次1h; 包埋, 冷卻; 切片, 切片厚度控制在5—6 μm; 烤干, HE染色, 脫水封片, 染色結(jié)果: 細(xì)胞核藍(lán)色, 細(xì)胞質(zhì)紅色; 最后進(jìn)行顯微鏡鏡檢, 利用Case Viewer軟件進(jìn)行圖像采集分析。

1.5 氨基酸測(cè)定

飼料和魚體組織氨基酸組成采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀TSQ-Endura(Thermo Scientific Dionex,USA), 根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 18246-2000)進(jìn)行測(cè)定, 用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)的每種氨基酸的單一峰, 根據(jù)出峰時(shí)間和峰高計(jì)算出峰面積, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(濃度為橫軸, 峰面積為縱軸), 計(jì)算出單一氨基酸在樣品中的絕對(duì)濃度,根據(jù)樣品處理過程中的稀釋倍數(shù), 計(jì)算出干物質(zhì)中氨基酸的含量, 由于色氨酸在酸水解后不能被檢測(cè)到, 因此, 沒有測(cè)定出色氨酸的數(shù)值。

1.6 膠原蛋白含量測(cè)定

Hyp含量測(cè)定采用試劑盒(Art. No. A030-2; 南京建成生物工程研究所, 南京, 中國)對(duì)樣品進(jìn)行處理。操作方法參考制造商的說明書, 使用Infinite?Pro 200酶標(biāo)儀(Tecan, 瑞士)分析樣品, 用酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度, Hyp濃度由標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)公式計(jì)算得到。膠原蛋白的含量由Hyp的含量乘以8估算得到(AOAC, 2002)。因?yàn)镠yp幾乎只存在于膠原蛋白中, 而且因膠原蛋白結(jié)構(gòu)的特殊性, Hyp含量在膠原蛋白中相對(duì)固定為12.5%。因此, 常用Hyp的含量來計(jì)算組織中膠原蛋白的含量。

1.7 基因表達(dá)分析

魚鰾組織中總RNA提取根據(jù)TRIzol (Invitrogen?)試劑說明書使用氯仿-異丙醇法萃取, 利用DNase Ⅰ消化去除污染基因組DNA (TaKaRa), 通過1.2% (w/v)瓊脂糖凝膠分析確定其完整性和質(zhì)量,利用Nanodrop?ND-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific NanoDrop, USA)測(cè)定260/280 nm處的吸光度, 從而確定RNA的最終濃度。RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA使用TransScript?One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super-Mix Kit (Trans Gen生物技術(shù), 北京)。簡(jiǎn)單介紹如下: 2 μg總RNA與1 μL Oligo(dT)18, 10 μL 2×TS反應(yīng)混合液, 1 μL TransScript?RT/RI混合酶, 1 μL gDNA去除劑混合后補(bǔ)DEPC水至20 μL。在42℃下孵育15min, 然后加熱到85℃,5s滅活gDNA去除劑和TransScript?RT/RI酶。cDNA存儲(chǔ)在–20°C, 直至使用。

利用Primer Premier 5.0軟件(Premier Biosoft International, Palo Alto, USA)根據(jù)大黃魚Larimichthys crocea、鱖Siniperca chuatsi和鱸Micropterus salmoides等的相關(guān)基因核心序列保守區(qū)設(shè)計(jì)該基因的特異性引物(表3), 引物均由華大基因(北京基因組研究所, 深圳)合成。采用應(yīng)用生物系統(tǒng)VeritiTM熱循環(huán)儀(Thermo Fisher Scientific, USA)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR), 擴(kuò)增目的基因DNA片段。PCR片段在1.2% 瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè), 確認(rèn)產(chǎn)物大小與預(yù)期相符后, 將PCR產(chǎn)物送華大基因(北京基因組研究所、深圳)測(cè)序, 序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

表3 膠原蛋白代謝相關(guān)基因的RT-PCR引物序列Tab. 3 Sequences of real-time PCR primers for gene of collagen metabolism

按如下體系配置20 μL的qRT-PCR反應(yīng)混合液:2 μL cDNA、7 μL DEPC水、10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ (Takara)和1 μL引物(管家基因或目標(biāo)基因), 20 μL反應(yīng)混合液在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上運(yùn)行(Roche Light Cycler? 480 System, 瑞士)。使用ΔΔCt相對(duì)量化計(jì)算方法, 先使用管家基因(βactin)進(jìn)行歸一化處理, 3個(gè)樣本, 每個(gè)樣本一式3份被用來計(jì)算平均Ct, ΔCt=目標(biāo)基因Ct–管家基因Ct。ΔΔCt=每個(gè)樣本處理組ΔCt/控制組ΔCt(實(shí)驗(yàn)參考)。相對(duì)量化的表達(dá)式2–ΔΔCt表示為目標(biāo)基因處理組與控制組的相對(duì)表達(dá)量。基因表達(dá)繪圖使用倍數(shù)變化(Fold change)法, 主要用了一個(gè)if函數(shù),Fold change=IF(值>1; 值, –1/值), 將相對(duì)表達(dá)量換算成倍數(shù)變化。

1.8 計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate, %/d)=[Ln終末體重(g)?Ln初始體重(g)]/天數(shù)×100

餌料系數(shù)(Feed coefficient,FC)=采食量(g)/[終末體重(g)–初始體重(g)]

魚鰾器官指數(shù)(Swim bladder somatic index,SB-SI)=100×魚鰾重(g)/魚體重(g)

存活率(Survival rate,SR, %)=100×終末魚數(shù)/初始魚數(shù)

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×魚體重(g)/體長(zhǎng)(cm)3

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0程序(SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA, LSD), 并采用Tukey進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(mean±SE)呈現(xiàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 添加Pro及注射Oxymatrine對(duì)淺色黃姑魚生長(zhǎng)性能的影響

如表 4所示, 特定生長(zhǎng)率(SGR)、餌料系數(shù)(FC)、肥滿度(CF)、鰾體比(SBSI)及存活率(SR)各項(xiàng)指標(biāo)在Blank組、Pro組和Oxymatrine組間均無顯著差異(P>0.05)。且各組存活率均≥90%, 由此可以看出實(shí)驗(yàn)魚能很好的適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件, 且干擾劑注射沒有對(duì)魚體健康造成重大影響。

表4 飼料中添加Pro并用Oxymatrine干擾對(duì)淺色黃姑魚生長(zhǎng)性能比較分析Tab. 4 The effect of inhibitors on growth performance of N.coibor fed diets with Pro of optimal level

2.2 添加Pro及注射Oxymatrine對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的影響

如圖 1所示, Pro組顯著高于Blank組和Oxymatrine組(P<0.05), 說明飼料中添加Pro促進(jìn)了魚鰾中膠原蛋白的沉積, 而腹腔注射干擾劑可以抑制膠原蛋白的沉積。

圖1 飼料中添加Pro及Oxymatrine干擾對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白含量(g/kg濕重)的影響Fig. 1 The effect of adding Pro in feed and Oxymatrine interference on the collagen content (g/kg wet matter) in swim bladder of N. coibor上標(biāo)中不同字母表示處理組間存在顯著差異(P<0.05; n=3)The absence of identical letters in the superscript indicate significant differences among the groups (P<0.05; n=3)

2.3 添加Pro及注射Oxymatrine對(duì)淺色黃姑魚魚鰾中氨基酸組成的影響

如表5所示, 在魚鰾中, 有11種氨基酸(Pro、Glu、Gly、Ala、Thr、Tyr、Met、Leu、Ser、Lys和Asp)受影響(P<0.05), 剩余氨基酸水平相對(duì)穩(wěn)定。通過多重比較分析Pro添加或注射干擾劑Oxymatrine對(duì)氨基酸代謝的影響, 如Pro和Oxymatrine組與Blank組比較發(fā)現(xiàn), 添加Pro導(dǎo)致淺色黃姑魚魚鰾中一些氨基酸含量升高, 如Pro、Glu、Asp、Met和Ser; 同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致Tyr、Ala和Thr含量降低。通過Oxymatrine組與Pro組比較發(fā)現(xiàn), 注射干擾劑Oxymatrine會(huì)導(dǎo)致Glu和Ala含量升高, 同時(shí)導(dǎo)致Leu、Lys和Gly含量降低。

表5 飼料中添加Pro并用Oxymatrine干擾對(duì)淺色黃姑魚魚鰾氨基酸組成的影響Tab. 5 The effect of inhibitors on collagen in swim bladder of N.coibor fed diets with Pro of optimal level (10 μmol/g dry matter)

2.4 Oxymatrine腹腔注射對(duì)淺色黃姑魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

干擾劑Oxymatrine的溶劑中含有DMSO等有害成分, 可能會(huì)對(duì)魚體健康造成危害, 實(shí)驗(yàn)中需要分析這種潛在危害程度。因此, 我們進(jìn)行了肝臟組織切片分析, 通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組肝臟組織結(jié)構(gòu)完整, 細(xì)胞排列緊密, 胞質(zhì)界限分明且細(xì)胞數(shù)量較多, 無病理性現(xiàn)象(圖2)。

圖2 Oxymatrine干擾對(duì)淺色黃姑魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effect of Oxymatrine interference on the liver tissue structure of N. coiborH1、H2和H4分別為Blank組、Pro組和Oxymatrine組的淺色黃姑魚肝臟組織結(jié)構(gòu)圖H1, H2 and H4 have shown the liver organization structure of N. coibor in the Blank group, Pro group and Oxymatrine group, respectively

2.5 Oxymatrine干擾對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖 3所示,Col1α1、Col1α2、P4Ha(I)、TGFβ和Smad2基因相對(duì)表達(dá)量在Pro組中均顯著高于Blank組(P<0.05), 說明飼料中添加Pro, 上調(diào)了這些基因的表達(dá)。同時(shí), Oxymatrine組與Pro組比較發(fā)現(xiàn), 這些基因也存在顯著差異, 說明Oxymatrine干擾導(dǎo)致這些基因顯著下調(diào)。除此以外, 淺色黃姑魚魚鰾中P4Ha(Ⅱ)、P4Ha(Ⅲ)、TGF-βRT、Smad3、Smad4和Smad7基因的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定, 均不受干擾和Pro添加的影響(P>0.05)。

圖3 與空白對(duì)照組相比, Pro添加組和Oxymatrine干擾組膠原蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化情況Fig. 3 Compared with the blank control group, ratio changes of collagen metabolism related genes expression in Pro added and Oxymatrine interference groups以對(duì)照組為基線, X軸上的數(shù)值大于0表示與對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào), 具體數(shù)值代表上調(diào)的倍數(shù)。相反小于0表示表達(dá)下調(diào), 具體數(shù)值的絕對(duì)值代表下調(diào)的倍數(shù); “*”個(gè)數(shù)不同代表了相應(yīng)處理組間具有顯著差異(P<0.05; n=3)Taking the control group as the baseline, a value greater than 0 on the X-axis indicates that the expression is up-regulated compared with the control group, and the specific value represents the fold of the up-regulation. On the contrary, less than 0 means downregulation, and the absolute value of the specific value represents the fold of down-regulation; The different number of “*”represents a significant difference between the corresponding treatment groups (P<0.05; n=3)

3 討論

鑒于Pro作為膠原蛋白合成的必需底物, 許多研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加Pro對(duì)膠原蛋白沉積具有一定影響[3—8], 然而, 至今關(guān)于Pro促進(jìn)膠原蛋白代謝的作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。作者前期開展了一系列相關(guān)研究, 發(fā)現(xiàn)飼料中添加Pro顯著增加了黃姑魚魚鰾中膠原蛋白含量[6]。深入研究發(fā)現(xiàn), Pro添加上調(diào)了魚鰾細(xì)胞中膠原蛋白基因(Col1α1和Col1α2)的表達(dá), 同時(shí)被上調(diào)的還有TGF-βRT和Smad2等基因[7]。TGFβ/Smads信號(hào)通路是調(diào)控基質(zhì)膠原蛋白代謝的經(jīng)典途徑[22—25]。進(jìn)一步對(duì)TGF-β/Smads通路中相關(guān)基因及Col1α1和Col1α2基因表達(dá)、魚鰾中膠原蛋白含量與Pro的添加水平展開聚類和相關(guān)分析, 發(fā)現(xiàn)Pro促進(jìn)雙棘黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積潛在受到TGFβ/Smads信號(hào)通路的調(diào)控[7]; 為了進(jìn)一步驗(yàn)證TGFβ/Smads信號(hào)通路在調(diào)控Pro促進(jìn)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積的重要作用, 本研究在飼料中添加Pro和注射TGF-β/Smads通路抑制劑Oxymatrine, 分析添加或干擾前后, 淺色黃姑魚生長(zhǎng)、魚鰾中氨基酸及膠原蛋白含量的變化。Pro的添加和抑制劑干擾對(duì)淺色黃姑魚的生長(zhǎng)沒有顯著影響, 但能導(dǎo)致魚鰾部分氨基酸及膠原蛋白含量發(fā)生顯著變化。其中Pro、Glu、Gly、Ala、Thr、Tyr、Met、Leu、Ser、Lys和Asp受到Pro添加或干擾的顯著影響。Li等[26]報(bào)道了機(jī)體氨基酸組成受到飼料AA組成的影響, 可能因?yàn)檫@些氨基酸的代謝與Pro的代謝途徑有共通之處。例如, Pro在一些哺乳動(dòng)物的小腸合成Glu,Pro、Hyp、Arg和鳥氨酸影響彼此的新陳代謝[4]。AA之間存在著非常復(fù)雜的相互關(guān)系, 本研究也僅為復(fù)雜的AA代謝及其相互作用提供簡(jiǎn)單依據(jù)。另外,魚鰾中Pro含量與飼料中Pro添加水平一致, 而魚鰾中膠原蛋白含量與之恰好相反, 受Oxymatrine干擾的顯著影響, 說明Pro雖然是膠原蛋白合成的重要底物, 但Pro并不是膠原蛋白含量的有效“指示劑”。這也符合Li 等[4]的研究報(bào)道, 自然界中不存在(或存在極少)游離的Hyp, Hyp只存在于膠原蛋白中, 所以常用Hyp, 而不是Pro含量來計(jì)算膠原蛋白蛋白含量。Oxymatrine干擾還引起了魚鰾中一些非必需氨基酸AA含量的變化, 主要有Gly、Glu及Ala, 間接反映了Oxymatrine干擾沒有導(dǎo)致生長(zhǎng)受影響, 因?yàn)榫獾谋匦璋被峤M成是動(dòng)物生長(zhǎng)和維持機(jī)體氮平衡的重要反饋。分析肝臟組織形態(tài)是了解機(jī)體健康情況的一個(gè)重要手段。機(jī)體對(duì)藥物的耐受力有限, 過度的給藥會(huì)導(dǎo)致機(jī)體肝腎代謝負(fù)擔(dān)過重, 長(zhǎng)期給藥會(huì)導(dǎo)致組織受損, 危及動(dòng)物健康。本研究通過肝臟形態(tài)學(xué)檢測(cè), 觀察注射干擾劑對(duì)淺色黃姑魚健康的影響。結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組中的肝臟切片細(xì)胞界限較為明顯, 細(xì)胞核清晰可見, 無細(xì)胞核朝質(zhì)膜移位等肝臟病變現(xiàn)象。結(jié)合實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)數(shù)據(jù)及死亡率分析, 說明我們給藥量和頻率是實(shí)驗(yàn)魚可承受的, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為其他魚類相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)借鑒。

值得注意的是, Pro對(duì)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積具有顯著的促進(jìn)作用, 而Oxymatrine干擾對(duì)淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白沉積表現(xiàn)出顯著的抑制效果。許多研究都發(fā)現(xiàn)了Oxymatrine具有抑制膠原蛋白合成的作用[16—18], 特別是Oxymatrine可以通過抑制TGF-β/Smads途徑, 減輕不同組織損傷修復(fù)過程中的纖維化[18]。本研究隨后對(duì)TGF-β/Smads通路中相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量分析, 發(fā)現(xiàn)Pro顯著上調(diào)了Col1α1、Col1α2、P4Ha(I)和TGF-β基因的表達(dá), 說明Pro促進(jìn)膠原蛋白沉積, 可能是通過調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)的, 特別是Ⅰ型膠原蛋白基因Col1α1和Col1α2顯著受到Pro的影響。另一方面,通過Oxymatrine干擾, 顯著降低了Pro介導(dǎo)的淺色黃姑魚魚鰾中Col1α1、Col1α2、TGF-β和Smad2基因的表達(dá), 膠原蛋白的沉積也隨著顯著下調(diào)。有研究表明TGF-β在促膠原發(fā)生過程中是關(guān)鍵的信號(hào)啟動(dòng)并通過TGF-βRT受體(TGF-βRTI、TGF-βRTII和TGF-βRTIII)將信號(hào)傳遞給Smads, 激活通路促進(jìn)蛋白的合成[27,28], 其中, 一類正調(diào)控的Smads蛋白(RSmads), 即Smad2和Smad3, 在激活目標(biāo)基因Col1α2的表達(dá)上尤為重要[29]。Wu等[30]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn), Oxymatrine能有效抑制TGF-β1、Smad3和CBP基因的表達(dá), 同時(shí)促進(jìn)肝臟中Smad7的表達(dá)。綜上所述, Pro可能通過激活TGF-β信號(hào), 將信號(hào)傳遞給胞質(zhì)中Smad2/3, 進(jìn)而激活了Col1α2基因的瞬時(shí)過表達(dá), 最后導(dǎo)致魚鰾中膠原蛋白的沉積增加。通過Oxymatrine干擾, 特異性抑制了Smad2/3, 使得Smad3和Smad2結(jié)合下降, 導(dǎo)致傳遞到細(xì)胞核內(nèi)的信號(hào)減弱, 下調(diào)了Col1α2基因的轉(zhuǎn)錄, 最后抑制了淺色黃姑魚魚鰾中膠原蛋白合成。

綜上所述, 飼料中添加Pro和注射抑制劑Oxymatrine對(duì)淺色黃姑魚的生長(zhǎng)的影響不顯著, 但能顯著影響魚鰾中膠原蛋白的沉積。具體表現(xiàn)為Pro顯著上調(diào)了Col1α1、Col1α2、P4Ha(I)和TGF-β基因的表達(dá), 同時(shí)促進(jìn)了魚鰾中膠原蛋白沉積; 而Oxymatrine干擾顯著抑制了TGF-β/Smads通路中Col1α1、Col1α2、Smad2和TGF-β基因的表達(dá), 且魚鰾中膠原蛋白含量也隨之降低。因此, 可以證實(shí)Pro促進(jìn)淺色黃姑魚魚鰾膠原蛋白沉積受到TGFβ/Smads信號(hào)通路的調(diào)控, 且Col1α1、Col1α2、TGFβ和Smad2基因在其中起著重要作用。

致謝:

感謝汕頭大學(xué)理學(xué)院海洋生物研究所為本實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所, 溫小波教授和林帆博士對(duì)文稿所提的寶貴意見。