徐思琪 張世勇 段永強(qiáng) 張文平 王明華 邊文冀, 陳校輝,,*

(1. 江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院, 連云港 222005; 2. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所, 南京 210017; 3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺, 南京 210014; 4. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)屬鯰形目, 鮰科, 原產(chǎn)于北美, 是美國目前產(chǎn)量最高, 養(yǎng)殖技術(shù)最為成熟的淡水魚養(yǎng)殖品種[1]。因其具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力, 較好的肌肉品質(zhì), 無肌間刺并易于加工等優(yōu)點, 目前已經(jīng)成為世界性養(yǎng)殖品種, 2017年全美養(yǎng)殖產(chǎn)值近3.8億美元。斑點叉尾鮰于1984年引種至我國, 廣東、河南、江蘇、湖北和四川等省份具有較大規(guī)模的養(yǎng)殖。近年來, 我國斑點叉尾鮰養(yǎng)殖年產(chǎn)量一直穩(wěn)定在40×107kg以上, 已成為中國淡水養(yǎng)殖業(yè)的新興養(yǎng)殖品種[2]。斑點叉尾鮰的生長存在一定的雌雄二態(tài)性, 且雌性規(guī)格達(dá)到500 g以上后, 性腺發(fā)育加快, 生長減慢, 飼料系數(shù)提高。雌性成魚由于存在較大的卵巢組織, 導(dǎo)致其可食用比例下降, 市場需求降低。

硬骨魚類的生殖方式分為雌雄同體、雌雄異體和單性生殖。對于雌雄異體的硬骨魚類而言, 其性別分化易受環(huán)境因素的影響, 原始性腺分化為卵巢還是精巢由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定。通過外源性激素改變魚類性別分化方向早有報道, 在性別分化前使用外源雌激素或雄激素處理后會使魚類的性別雄性或雌性分化發(fā)生逆轉(zhuǎn)[3]。Yamamoto等[8]成功將正常雄性青鳉(XY型), 與經(jīng)過性逆轉(zhuǎn)后得到的生理性別為雌性的青鳉(XY型)雜交, 得到超雄性青鳉(YY型)。在國內(nèi), 劉漢勤等[4]利用激素誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)的方法結(jié)合雌核發(fā)育技術(shù), 獲得超雄和全雄黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)。采用類似的方法,已成功培育出可育后代的超雄性尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[5]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[6]和紅斑石斑魚(Epinephelus morio)[7]等。

斑點叉尾鮰性別決定機(jī)制研究開始于20世紀(jì)80年代, 目前廣泛接受的觀點認(rèn)為其性別決定系統(tǒng)為雄性異配子型(XX/XY)[8]。理論上, 開展全雄斑點叉尾鮰選育技術(shù)研究, 可以顯著提高其整體生長速度和規(guī)格整齊度, 且有助于良種的管控。使用雌激素誘導(dǎo)斑點叉尾鮰仔魚, 篩選XY雌魚與正常雄魚雜交生產(chǎn)超雄魚(YY型), 再將其與正常雌魚(XX型)雜交即可獲得全雄后代, 整個培育過程需要經(jīng)過3個世代。獲得穩(wěn)定遺傳的XY雌魚是培育全雄魚或超雄魚最為關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。為此, 本研究旨在探究培育斑點叉尾鮰XY雌魚的方法及性逆轉(zhuǎn)評估方法, 以期為后續(xù)全雄斑點叉尾鮰新品種的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所選用的斑點叉尾鮰親魚來自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚中基地。選取健康親魚暫養(yǎng)一周,按照配種方案交配產(chǎn)卵后, 選取彈性十足、色澤飽滿和顏色黃潤的受精卵, 在斑點叉尾鮰魚卵專用孵化裝置中孵化出苗。設(shè)置A、B、C和D四個試驗組, 分別投喂17β-E2添加劑量為0 (對照組)、6、30和60 μg/g 的微粒飼料, 各試驗組設(shè)置3個平行,每個平行放養(yǎng)200尾卵黃囊苗(52尾/g)。粒徑S1、S2、S3和S4的微粒飼料購自山東升索飼料科技有限公司。17β-E2母液與95%乙醇溶液混勻后加入微粒飼料中, 充分?jǐn)嚢韬笥诤嫦渲?0℃烘干, 密封袋保存?zhèn)溆?。待魚苗卵黃囊消失,開始投喂鹵蟲3d。對各組已經(jīng)開口的仔魚連續(xù)飽食投喂含有對應(yīng)17β-E2劑量的微粒飼料至30日齡, 并根據(jù)仔魚體長調(diào)整微粒飼料粒徑, 微粒飼料調(diào)整方案如表 1所示。試驗魚養(yǎng)殖至30日齡后,轉(zhuǎn)移至室外水泥池(5 m×5 m×1 m)中繼續(xù)養(yǎng)殖,投喂商品飼料(南京市澳華生物科技有限公司)。養(yǎng)殖水體中溶解氧>5 mg/L, 氨氮含量<0.02 mg/L。每日于上午8:00和下午17:00各投喂1次, 日投喂量為魚體重的3%。

表1 微粒飼料調(diào)整方案Tab. 1 Particulate feed adjustment scheme

1.2 試驗樣品采集

從各試驗組中隨機(jī)取10尾60日齡試驗魚, 3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽(MS-222; Merck, 德國)麻醉后分別取尾鰭以及卵巢組織, 尾鰭用95%乙醇溶液保存在1.5 mL 離心管中,性腺用多聚甲醛溶液保存在1.5 mL EP管中, 樣品存放于4℃的冰箱中保存, 用于遺傳性別鑒定及組織切片。同時, 在60日齡記錄各組試驗魚存活情況, 并稱量各組試驗魚的體重和體長等生長數(shù)據(jù)。在270日齡, 從各試驗組中取雌魚的鰓、心臟、肝臟、腎臟、卵巢和肌肉后, 放置于凍存管中液氮保存, 用于17β-E2含量的檢測。同時, 取A組雌雄魚的卵巢、精巢組織, 以及D組XX雌魚與XY雌魚卵巢組織, 液氮速凍后于–80℃冰箱保存。

1.3 遺傳性別鑒定

取20 mg尾鰭組織,剪碎后置于1.5 mL EP管中。使用DNA Isolation Mini Kit試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司)提取基因組DNA, 操作過程按照說明書進(jìn)行, DNA樣本于–20℃保存。應(yīng)用斑點叉尾鮰遺傳性別鑒定方法[8]對試驗魚的遺傳性別進(jìn)行鑒定。

1.4 解剖學(xué)觀察

從各試驗組隨機(jī)取100尾60日齡試驗魚, 麻醉后在肛門開口1—2 mm處沿腹中線由下至上做縱向切口, 切口大約為3—4 cm左右, 切口根據(jù)試驗魚大小做細(xì)微調(diào)整, 剝離臟器后, 在體腔黏膜下方處觀察性腺發(fā)育情況。根據(jù)遺傳性別鑒定結(jié)果, 對各組100尾60日齡試驗魚的卵巢形成比例和性逆轉(zhuǎn)率進(jìn)行統(tǒng)計。在剝離臟器過程中, 避免破壞試驗魚各部位臟器, 防止內(nèi)臟大量出血, 從而導(dǎo)致腹腔大量血液淤積, 不利于對卵巢的觀察。

1.5 組織學(xué)觀察

將保存在多聚甲醛中的卵巢組織經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后, 常規(guī)切片5—6 μm, 經(jīng)蘇木精、伊紅染色, 用中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)(Nikon,日本)觀察, 并拍照記錄, 根據(jù)遺傳性別鑒定結(jié)果, 挑選A組正常雌魚和B組、C組、D組XY雌魚卵巢進(jìn)行組織切片, 在組織學(xué)水平比較卵巢發(fā)育差異。

1.6 17β-E2含量測定

根據(jù)遺傳性別鑒定結(jié)果, 準(zhǔn)確稱取液氮保存的各處理組XY雌魚和對照組雌魚的鰓、心臟、肝臟、腎臟、卵巢、皮膚和肌肉組織, 按重量(g)﹕體積(mL)=1﹕10的比例加入10倍預(yù)冷PBS,高速研磨、離心后取上清50 μL加入考馬斯亮藍(lán)(G-250)(Merck,德國)作用25min后(5倍稀釋), 于595 nm波長,1 cm光徑, 蒸餾水調(diào)零, 測定各管吸光度后,進(jìn)行各組織中17β-E2含量的測定。本試驗所用17β-E2ELISA試劑盒購自南京建成科技有限公司。450 nm波長下依序測量各樣品的吸光度(OD值), 測定應(yīng)在加終止液后10min內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)濃度和OD值得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程, 并計算每個樣品的17β-E2含量。

1.7 qRT-PCR檢測雌雄性別分化相關(guān)基因

使用RNA提取試劑盒(Qiagen, 德國)提取270日齡A組雌雄的卵巢、精巢組織, 以及D組XX雌魚與XY雌魚卵巢組織的總RNA。按照Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa, 日本)操作過程合成cDNA。分別根據(jù)斑點叉尾鮰雌雄性別分化基因foxl2和dmrt1編碼區(qū)基因序列設(shè)計特異性qRT-PCR反應(yīng)引物, 以α-tubulin基因作為內(nèi)參基因, qRT-PCR反應(yīng)引物如表 2所示。qPCR 體系為 25 μL, 包括12.5 μL TB Green染料(TaKaRa,日本), 2 μL cDNA,上下游引物各1 μL, 補(bǔ)H2O至25 μL。qRT-PCR程序為 95℃30s, 95℃ 15s, 57℃ 30s, 95℃ 15s, 60℃ 15s, 79℃5s, 95℃ 15s, 每個試驗3次重復(fù)。采用2–??Ct值法計算foxl2和dmrt1基因在各樣本種的相對表達(dá)量。

表2 qRT-PCR反應(yīng)引物表Tab. 2 The primers for q-PCR in this study

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件整理數(shù)據(jù), 所有數(shù)據(jù)采用R 4.0.5軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 顯著性水平用P表示, 顯著性水平為P<0.05, 極顯著性水平為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 17β-E2處理對生長和存活的影響

對各組60日齡試驗魚的生長情況進(jìn)行評估, 分別測定了體長和體重等生長數(shù)據(jù), 并計算各組試驗魚的存活率(表3)。結(jié)果表明, 各組試驗魚的存活率與對照組無顯著性差異, C組試驗魚的體重和體長顯著性高于B組和對照組(P<0.05), 極顯著性高于D組(P<0.01), 說明適當(dāng)提高飼料中17β-E2劑量有助于試驗魚的生長, 但添加的17β-E2量過高會抑制其生長(表3)。

表3 各組試驗魚生長和存活數(shù)據(jù)Tab. 3 Growth and Survival data of channel catfish in each experimental group

2.2 卵巢發(fā)育評估

根據(jù)遺傳性別鑒定結(jié)果(圖1), 挑選A組正常雌魚和各B組、C組、D組XY雌魚卵巢進(jìn)行組織切片(圖2)。對照組和各處理組卵巢的卵母細(xì)胞均以Ⅱ期卵母細(xì)胞為主, 大小均勻, 呈橢圓形或圓形。核內(nèi)分布1至5個不等的核仁。在B組、C組、D組中, XY雌魚的卵母細(xì)胞數(shù)量和核仁數(shù)量隨著17β-E2劑量的升高而增多, 核質(zhì)比隨之減小。

圖1 斑點叉尾鮰遺傳性別鑒定示例圖Fig. 1 Genetic sex identification of channel catfisha. 雌性斑點叉尾鮰遺傳性別鑒定圖; b. 雄性斑點叉尾鮰遺傳性別鑒定圖a. the genetic sex identification of female channel catfish; b. the genetic sex identification of male channel catfish

通過對各組60日齡試驗魚的卵巢形成及發(fā)育情況的解剖觀察,卵巢的形成比例與17β-E2劑量呈正相關(guān)。對照組中精巢與卵巢的比例接近1﹕1, 隨著飼料中17β-E2劑量的提高其性逆轉(zhuǎn)率也呈升高的趨勢(表4)。D組的逆轉(zhuǎn)率達(dá)到100%, XY雌魚的卵巢發(fā)育最好, 與對照組卵巢發(fā)育相似; B組的性逆轉(zhuǎn)率最低, 為61.4%, 且XY雌魚的卵巢發(fā)育較差, 與同時期對照組和其他處理組相比卵巢較細(xì)、輪廓不清晰(圖2)。

表4 各試驗組雌魚比例統(tǒng)計表Tab. 4 Statistical table of proportion of female fish in each experimental group

圖2 60日齡斑點叉尾鮰卵巢組織圖Fig. 2 Histological sections and anatomy of the ovaries of channel catfish at 60 dahsa、c、e、g. A組XX雌魚及B、C、D組XY雌魚的卵巢組織切片圖; b、d、f、h. 分別是A組XX雌魚和B、C、D組XY雌魚的卵巢組織解剖圖。NM. 核膜; N. 細(xì)胞核; NU. 核仁; YG. 卵黃顆粒; CT. 結(jié)締組織a. the histological section figure of channel catfish (XX) ovary, c,e, g. the histological section figures of sexual reversal channel catfish (XY) ovaries in group A, B, C and D; b. the anatomy figure of channel catfish (XX) ovary, d, f, h. the anatomy figures of sexual reversal channel catfish (XY) ovaries in group A, B, C and D respectively. NM. Nuclear membrane; N. Nucleus; Nu. Nucleolus; YG. Yolk granules; CT. Connective tissue

2.3 17β-E2含量測定

對照組雌魚和各處理組XY雌魚的鰓、心臟、肝臟、腎臟、卵巢和肌肉中17β-E2含量進(jìn)行測定(表5), 鰓、心臟、肝臟、腎臟和肌肉等組織中17β-E2含量均無極顯著性差異(P>0.01); 而卵巢中17β-E2的含量與其添加劑量呈正相關(guān), D組顯著性高于對照組和C組(P<0.05), 極顯著性高于B組(P<0.01)。

表5 各試驗組斑點叉尾鮰不同組織中17β-E2含量Tab. 517 β-E2 content in different tissues of channel catfish from each experimental group

2.4 qRT-PCR檢測雌雄性別分化相關(guān)基因

通過qRT-PCR對270日齡A組正常雌魚、雄魚的卵巢和精巢組織, 以及D組XY雌魚和XX雌魚卵巢組織中雄性性別決定基因dmrt1和雌性性別決定基因foxl2的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測(圖3)。結(jié)果顯示,dmrt1基因在A組雄魚的精巢中的表達(dá)量(P<0.01)極顯著性高于A組正常雌魚卵巢以及D組XY雌魚和XX雌魚卵巢組織, 且D組XY雌魚的卵巢組織中其表達(dá)受到抑制;foxl2基因在D組XY雌魚和XX雌魚的卵巢組織中表達(dá)受到激活, 且在XY雌魚卵巢組織中的表達(dá)量顯著性高于XX雌魚的卵巢組織及A組正常雌魚和雄魚的卵巢和精巢組織(P<0.05)。

圖3 斑點叉尾鮰性別分化基因表達(dá)圖Fig. 3 mRNA expression levels of sex differentiation genes in channel catfisha. 斑點叉尾鮰雄性性別分化基因dmrt1表達(dá)圖; b. 斑點叉尾鮰雌性性別決定基因foxl2表達(dá)圖。圖中4個組織依次為D組XX雌魚和XY雌魚卵巢組織, 以及A組XX雌魚卵巢和XY雄魚精巢組織a. mRNA expression levels of dmrt1 gene; b. mRNA expression levels of foxl2 gene. The four tissues in the figure were XX female and XY female ovaries in group D, as well as XX female ovary and XY male testis in group A

3 討論

動物在早期生長發(fā)育過程中, 性別分化是極為重要的生物學(xué)過程, 較為高等的脊椎動物的性別分化主要由性染色體上的性別決定基因所決定, 環(huán)境因素所起的作用往往較小, 而低等脊椎動物(如爬行類、兩棲類、魚類等)的進(jìn)化程度相對較低, 其早期性別分化極易受到溫度、pH、溶解氧、光周期、外源性激素和種群密度等環(huán)境因素的影響[9,10]。性別分化的差異是由于相關(guān)類固醇代謝酶在雌雄個體中差異表達(dá), 從而導(dǎo)致內(nèi)源性類固醇分泌水平的改變。雌激素對魚類的雌性性別決定、性腺分化和維持具有至關(guān)重要的作用, 在外源性雌激素誘導(dǎo)下, 雄魚的生理性別能夠逆轉(zhuǎn)為雌性[11]; 當(dāng)體內(nèi)雌激素下調(diào)時, 已分化的卵巢也能夠逆轉(zhuǎn)為精巢[12,13]。17β-E2是魚類天然的雌性性別分化誘導(dǎo)劑, 在多種魚類中已開展17β-E2誘導(dǎo)雄性性別逆轉(zhuǎn)研究[14,15]。

不同魚類的性腺分化時間存在一定的差異, 如斑點叉尾鮰的卵巢分化開始于19日齡, 而精巢分化于90—102日齡;黃姑魚(Nibea albiflora)[16]是在36日齡時卵巢開始分化, 46日齡出現(xiàn)卵巢腔;半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[17]在62日齡卵巢開始分化,當(dāng)發(fā)育到120日齡可以觀察到明顯的卵巢腔。本試驗對斑點叉尾鮰開展17β-E2誘導(dǎo)起始于其開口時期, 直至第30日齡, 通過在飼料中添加不同劑量的17β-E2, 進(jìn)而控制其體內(nèi)雌激素水平, 以探究斑點叉尾鮰XY雄魚雌性化的合適17β-E2劑量。

激素誘導(dǎo)魚類性逆轉(zhuǎn)研究一般采用投喂法和浸浴法兩種方法。投喂法一般是將激素添加到飼料中, 魚體以攝食的方式將激素攝入體內(nèi); 浸浴法是在養(yǎng)殖水體中加入一定濃度的激素, 以促進(jìn)魚類發(fā)生性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。較多研究表明, 激素飼喂法往往要好于浸浴法[18—20]。本試驗以鹵蟲-人工配合飼料作為17β-E2載體, 在斑點叉尾鮰仔魚開口階段投喂激素處理的鹵蟲, 并在此后的不同發(fā)育階段投喂合適粒徑的微粒飼料。通過解剖觀察發(fā)現(xiàn), 僅60 μg/g 17β-E2處理組試驗魚的性腺全部為卵巢, 但其體長和體重及存活率均小于其他處理組合對照組, 30 μg/g處理組的性逆轉(zhuǎn)率雖為81.4%, 但卻擁有最佳的生長數(shù)據(jù)。在尼羅羅非魚[21]、淞江鱸(Trachidermus fasciatus)[22]、河鱸(Perca fluviatilis)[23]的研究中發(fā)現(xiàn), 在一定的范圍內(nèi), 類固醇激素對生長具有促進(jìn)作用, 但添加過高的激素劑量卻會抑制的生長。

在性腺分化時期短期使用17β-E2, 一般不會造成其在魚體內(nèi)富集[24,25], 且我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第193號公告《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》中并未將雌二醇列入該清單。高艷麗等[26]研究發(fā)現(xiàn)17β-E2處理史氏鱘(Acipenser schrenckii)后,在其肌肉中含量較低, 停藥一段時間后, 17β-E2在肌肉中的含量達(dá)到正常水平。本試驗對各處理組中60日齡試驗魚鰓、心臟、肝臟、腎臟、卵巢和肌肉等組織中17β-E2含量進(jìn)行檢測, 各組中僅卵巢組織中17β-E2含量存在差異, 其中D組卵巢17β-E2的含量顯著性高于其他處理組和對照組; C組的卵巢組織中17β-E2含量顯著性高于與B組, 但與對照組無顯著性差異, 在一定程度上說明該處理組卵巢中17β-E2含量更加接近于正常卵巢組織。

與其他魚類一樣, 斑點叉尾鮰foxl2基因和dmrt1基因被廣泛認(rèn)為雌雄性別分化標(biāo)志基因[27]。foxl2基因?qū)β殉驳姆只肮δ芫S持起著重要作用,dmrt1基因主要調(diào)控雄性性別分化相關(guān)下游基因[28,29]。在性別分化前期, 紅耳滑龜(Trachemys scripta)[30]、黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)[31]和尼羅羅非魚[32]等經(jīng)17β-E2處理后,dmrt1基因表達(dá)顯著降低, 而foxl2基因的表達(dá)則顯著上調(diào)。在本研究中, XY雌魚的foxl2基因的表達(dá)量顯著高于其他3組, 而dmrt1基因的表達(dá)量則顯著低于其他3組, 該結(jié)果進(jìn)一步說明在斑點叉尾鮰性別分化前期使用17β-E2進(jìn)行誘導(dǎo)能夠促進(jìn)雌性性別分化基因的表達(dá), 并抑制雄性性別分化基因的表達(dá), 進(jìn)而實現(xiàn)斑點叉尾鮰由雄性逆轉(zhuǎn)成雌性。

本試驗采用17β-E2作為雌性性別分化誘導(dǎo)劑相對安全、可靠。30 μg/g17β-E2處理組(C組)具有較快的生長速率, 但不能實現(xiàn)雄性性別100%逆轉(zhuǎn);60 μg/g處理組(D組)雖能夠?qū)崿F(xiàn)全部逆轉(zhuǎn), 但由于劑量相對較高, 在一定程度上抑制了試驗魚的生長。因此, 實現(xiàn)斑點叉尾鮰雄魚雌性化的最佳17β-E2劑量仍需要在30和60 μg/g 17β-E2處理組之間進(jìn)一步優(yōu)化。