錢 軍， 王艷云， 葉群英綜述， 羅紅波審校

缺血性腦卒中是臨床上比較多見的腦血管疾病，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究的數(shù)據(jù)顯示，2019年我國缺血性腦卒中發(fā)病率為1700/10萬[1]，占全部腦血管疾病的85%以上，針對(duì)缺血性腦卒中，應(yīng)力爭盡早對(duì)缺血的腦組織實(shí)施再灌注治療，挽救缺血半暗帶是臨床上首要治療原則，但血流和氧氣的恢復(fù)會(huì)加重大腦損傷，甚至造成不可逆的損害，這種現(xiàn)象被稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)[2]，CIRI的機(jī)制復(fù)雜，主要有線粒體能量代謝障礙、鈣離子超載、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、血腦屏障破壞、NO合成過多、細(xì)胞焦亡等[3]，線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)是線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)緊密連接但未融合的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，許多研究發(fā)現(xiàn)MAM在許多細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，如調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)、線粒體動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡、自噬等[4]，近年研究發(fā)現(xiàn)，MAM參與的細(xì)胞事件和腦缺血再灌注后發(fā)生大腦損傷的病理生理機(jī)制高度重合，因此，了解MAM參與調(diào)控腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制可能成為治療和預(yù)防CIRI提供新的方向。本文結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)就MAM參與調(diào)控腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展作一綜述。

1 MAM的概述

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間膜接觸的概念最早出現(xiàn)在脂質(zhì)研究中，Ruby[5]等人用電子顯微鏡觀察到線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間有開放的通道，并發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線粒體。到目前為止，MAM的存在已經(jīng)通過不同的技術(shù)得到證實(shí)，包括活體成像、新的電子顯微鏡方法和亞細(xì)胞分離等。線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的最佳定義是與線粒體接觸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，但兩者接觸部位緊密相連卻不融合。在真核細(xì)胞中，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸復(fù)合物(ER and mitochondria encounter structure,ERMES)介導(dǎo)，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)界面更具有復(fù)雜性，兩者之間的聯(lián)系不是靜態(tài)的，而是隨細(xì)胞狀態(tài)的不同而動(dòng)態(tài)改變，兩者之間接觸部位的間距在10～30 nm之間波動(dòng)[6]，接觸總面積在5%～20%之間波動(dòng)，這種聯(lián)系方式使得線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在有聯(lián)系的同時(shí)又保持各自的特性。有研究表明，在腦缺血再灌注中，線粒體有絲分裂的上調(diào)會(huì)提供神經(jīng)保護(hù)[7]，Sun[8]等發(fā)現(xiàn)通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以減輕腦缺血再灌注損傷，對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用，可見MAM在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。

線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的動(dòng)態(tài)連接涉及多種蛋白的參與，如電壓依賴性陰離子通道(VDACs)、線粒體融合蛋白1/2(Mfn1/2)、1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)、酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51(PTPIP51)、囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白B(VAPB)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(GRP75)、PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1(PINK1)等[9]。

2 MAM參與調(diào)控CIRI的病理進(jìn)程

2.1 鈣離子穩(wěn)態(tài) 鈣離子穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞中大部分生化反應(yīng)的基礎(chǔ)，鈣離子主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存，在線粒體中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞基本功能。鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線粒體高度依賴MAM，尤其是MAM所募集的IP3R/Grp75/VDAC構(gòu)成的Ca2+通道[10]，其中IP3R定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，是ER釋放Ca2+的主要通道之一，電壓依賴性陰離子通道蛋白1 (VDAC1)是位于線粒體外膜(OMM)上的Ca2+通道,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(GRP75)可以將IP3R的配體結(jié)構(gòu)域與VDAC1連接，因此GRP75是連接兩個(gè)細(xì)胞器兩側(cè)兩個(gè)蛋白的關(guān)鍵分子[10]，VDAC1和IP3R通過與GRP75相互作用，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的鈣離子穩(wěn)態(tài)，這是維持線粒體正常功能所必須的。此外，MAM中還存在其他促進(jìn)ER和線粒體之間Ca2+有效轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)復(fù)合物，如VAPB-PTPIP51復(fù)合物[9]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間緊密接觸的距離可能會(huì)影響線粒體功能，當(dāng)兩者之間的距離<5 nm(通過電子斷層掃描顯示)會(huì)促進(jìn)線粒體的鈣超載導(dǎo)致細(xì)胞損傷[11]，這種距離是隨著IP3誘導(dǎo)胞漿中Ca2+的增加而動(dòng)態(tài)變化。綜上所述，MAM通過感應(yīng)細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度，可能會(huì)動(dòng)態(tài)改變形狀，進(jìn)而改變組織間距離，以進(jìn)行合適的細(xì)胞反應(yīng)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另一方面，當(dāng)線粒體內(nèi)大量Ca2+長期存在時(shí)，會(huì)引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放，腦缺血再灌注后，MPTP開放會(huì)引起線粒體破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，Huang[12]等研究發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔抑制細(xì)胞凋亡減輕腦缺血再灌注損傷。在腦缺血再灌注損傷病理進(jìn)程中，Ca2+超載和細(xì)胞凋亡是組織損傷的重要機(jī)制，在腦缺血再灌注后，可通過調(diào)控MAM募集的蛋白構(gòu)成的通路減少Ca2+內(nèi)流，避免Ca2+超載引起的細(xì)胞死亡，減輕腦缺血再灌注損傷。

2.2 線粒體動(dòng)力學(xué) 線粒體動(dòng)力學(xué)主要包括線粒體融合、分裂、自噬等。線粒體融合主要通過融合蛋白介導(dǎo)，如融合蛋白1/2(mfn1/2)和Optic atrophy 1(Opa1)，mfn1/2定位于線粒體外膜，Opa1定位線粒體內(nèi)膜，分別介導(dǎo)線粒體內(nèi)外膜的融合[13]，其中的mfn1只定位于線粒體，而mfn2不僅定位于線粒體，而且在MAM中大量存在，當(dāng)線粒體融合增強(qiáng)時(shí)，ATP合成增加以及細(xì)胞的氧化磷酸化水平上升，能量合成增加，另外，線粒體融合還參與線粒體的合成與受損線粒體的修復(fù)。線粒體分裂主要由分裂蛋白調(diào)控，如動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1(DRP1)、裂變蛋白1(FIS1)及線粒體分裂因子(MFF)，其中DRP1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)線粒體分裂時(shí)，DRP1被分裂因子募集到線粒體膜上與FIS1結(jié)合，DRP1與FIS1的復(fù)合體使GTP酶構(gòu)象發(fā)生變化，GTP水解釋放能量，進(jìn)一步誘導(dǎo)線粒體分裂[14]，DRP1的活性可以被多種蛋白所調(diào)控，其中有一種突觸融合蛋白Syntaxin17，據(jù)報(bào)道該蛋白定位于MAM和線粒體，并確定DRP1在MAM中的定位和活性[15]。線粒體自噬主要是由自噬蛋白，如Bnip3、Nix等所調(diào)控，及時(shí)消除功能失調(diào)的線粒體并保留適當(dāng)?shù)木€粒體數(shù)量對(duì)于正常的細(xì)胞功能和細(xì)胞生存是不可或缺的，線粒體自噬被認(rèn)為是線粒體質(zhì)量和數(shù)量控制的核心機(jī)制[16]，自噬的發(fā)生首先需要形成自噬體，大量研究表明，自噬體在MAM處形成[17]，同時(shí)，線粒體的融合與分裂狀態(tài)可維持線粒體自噬的發(fā)生。張逸[18]等在對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠進(jìn)行研究時(shí)，通過檢測(cè)大腦缺血組織中的線粒體相關(guān)動(dòng)力蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注的急性期損傷(1 d)會(huì)顯著增加線粒體融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表達(dá)，而在腦缺血再灌注長期損傷(7 d)的缺血腦組織中線粒體融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表達(dá)水平顯著下降，研究發(fā)現(xiàn)，通過干預(yù)腦缺血再灌注的急性期損傷和長期損傷中OPA1、Drp1的表達(dá)水平，可以減輕腦缺血再灌注損傷，陳運(yùn)轉(zhuǎn)[19]等在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞自噬可引起神經(jīng)元損傷加重,自噬的發(fā)生可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。上述數(shù)據(jù)表明，MAM在線粒體的融合、分裂、自噬等方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)，線粒體動(dòng)力學(xué)也是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，通過干預(yù)腦缺血再灌注后的線粒體相關(guān)動(dòng)力蛋白的表達(dá)以及線粒體自噬可減輕腦缺血再灌注損傷。

2.3 氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)的氧化與抗氧化的狀態(tài)失衡，體內(nèi)自由基超過正常范圍而導(dǎo)致的組織細(xì)胞氧化損傷反應(yīng)，其中線粒體是自由基產(chǎn)生的主要場所[20]。在MAM上有多個(gè)氧化調(diào)節(jié)劑，其中最常見的是胞質(zhì)銜接蛋白p66Shc，MAM處可見p66Shc濃度增加，p66Shc是一種介導(dǎo)線粒體活性氧(ROS)生成的氧化還原酶[21]，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，MAM蛋白p66Shc被激活，轉(zhuǎn)位到線粒體，參與了ROS的形成。此外，MAM駐留蛋白Ero1-Lα的水平升高可能會(huì)增加ROS的產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放[22]。另一方面，MAM蛋白p66Shc可以參與導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，因?yàn)閜66Shc中含有一個(gè)額外的N-末端富含脯氨酸的膠原結(jié)構(gòu)域(CC2)，其中含有一個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser36)，該位點(diǎn)對(duì)促凋亡非常重要[23]。上述數(shù)據(jù)說明MAM在氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，同時(shí)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡也是造成腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。

2.4 炎癥反應(yīng) NLRP3炎癥小體是目前為止唯一被報(bào)道與MAM有關(guān)的炎癥小體，同時(shí)NLRP3也是介導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)典焦亡通路的關(guān)鍵分子[3]，可被細(xì)胞器內(nèi)的活性氧(ROS)正調(diào)控，此外，當(dāng)線粒體的活性失調(diào)時(shí)，NLRP3激活受到抑制。在NLRP3未受刺激時(shí)，大部分定位于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，NLRP 3作為固有免疫重要的模式識(shí)別受體參與了缺血后的炎癥損傷，NLRP 3炎癥小體不僅能識(shí)別外源性病原體，也能夠感知自身內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)(如缺血再灌注損傷)，是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子通路，當(dāng)發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，NLRP3被激活，激活NLRP3進(jìn)一步激活凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)并與ASC重新定位于MAM，激活的ASC進(jìn)一步招募pro-caspase-1并將其激活，被激活的caspase-1可以誘導(dǎo)包膜穿孔、死亡，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放引起炎癥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)促炎因子IL-1β、 IL-18成熟分泌[24]，F(xiàn)ann[25]等研究發(fā)現(xiàn)腦缺血缺氧后 NLRP3、ASC 及caspase-1等蛋白表達(dá)增加，阻斷caspase-1后可減輕腦缺血后的神經(jīng)損傷。另一方面，MAM還參與神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生[26]，神經(jīng)酰胺是一種生物活性鞘磷脂，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長停滯、分化、凋亡和炎癥非常重要。以上數(shù)據(jù)都說明了MAM在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，炎癥反應(yīng)也是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。

3 MAM可能作為腦缺血再灌注損傷潛在的治療靶點(diǎn)

MAM所參與的細(xì)胞事件與腦缺血再灌注后發(fā)生的病理生理機(jī)制高度相關(guān)。可以通過抑制MAM上募集的IP3R/Grp75/VDAC鈣離子通路和VAPB-PTPIP51復(fù)合物，從而減少缺血再灌注時(shí)的鈣離子超載，減輕缺血再灌注損傷，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除PTPIP51，可以減少由VAPB-PTPIP51復(fù)合物介導(dǎo)的鈣超載，可以大大減輕缺血再灌注后細(xì)胞的損傷[27]。如前文所述，MAM所募集的線粒體融合蛋白(mfn)以及定位于MAM上的調(diào)控DRP1活性的突觸融合蛋白在線粒體的分裂以及融合中發(fā)揮重要作用，可以通過調(diào)控MAM上的線粒體融合蛋白(mfn)以及分裂蛋白的調(diào)節(jié)蛋白等蛋白的表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)細(xì)胞內(nèi)線粒體的分裂和融合，控制細(xì)胞內(nèi)線粒體的質(zhì)量和數(shù)量，在滿足能量需求的同時(shí)，清除損傷的線粒體，減少因線粒體功能障礙引起的缺血再灌注損傷，研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)存在于MAM上的mfn2可促進(jìn)線粒體生物合成從而抑制細(xì)胞凋亡[28]，鹽酸戊乙奎醚可通過線粒體動(dòng)力學(xué)機(jī)制對(duì)心肌缺血再灌注損傷有較好的保護(hù)作用[29]。可以干預(yù)MAM蛋白p66Shc的激活和Ero1-Lα的水平，減輕氧化應(yīng)激對(duì)缺血再灌注的損傷，P66Shc的缺失已被證明可以減輕缺血再灌注損傷，然而，p66Shc誘導(dǎo)的ROS的形成也參與了胰島素信號(hào)的傳遞，可能參與了抵抗輕度缺血再灌注損傷的內(nèi)源性防御[30]。還可通過阻斷與MAM相關(guān)的NLRP 3炎癥小體的激活，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)缺血再灌注的損傷。

綜上所述，MAM可通過多個(gè)方面參與腦缺血再灌注損傷的病理進(jìn)程，調(diào)控MAM募集的蛋白的表達(dá)，能夠減輕細(xì)胞缺血、缺氧引起的氧化應(yīng)激，保證線粒體的數(shù)量和質(zhì)量，還可干預(yù)MAM參與的炎癥反應(yīng)，均可以減輕缺血再灌注損傷，這為MAM作為腦缺血再灌注損傷治療的潛在靶點(diǎn)提供依據(jù)。

4 展 望

線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中發(fā)揮多種功能的細(xì)胞器，而MAM作為線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)緊密連接但未融合的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞的生命周期，MAM通過調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)、線粒體動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡、自噬等多種途徑，決定著細(xì)胞的命運(yùn)。從腦缺血再灌注損傷的機(jī)制上分析，MAM的功能與其高度重合。如前文所述，近年來已有研究發(fā)現(xiàn)，通過干預(yù)MAM所募集的蛋白，可以減輕缺血再灌注損傷，如敲除PTPIP51、上調(diào)mfn2的表達(dá)等，這都說明MAM可能是治療腦缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)。要確定MAM與腦缺血再灌注損傷是否有關(guān)系，首先需要明確在發(fā)生腦缺血再灌注損傷中患者的MAM是否有異常，如MAM募集的蛋白的表達(dá)、線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間接觸面積的變化等，但由于MAM的組成和功能的復(fù)雜性和多樣性，也為量化MAM的水平變化帶來挑戰(zhàn)。目前，MAM仍然有許多有待研究的問題，MAM的研究對(duì)探究腦缺血再灌注損傷等疾病的治療靶點(diǎn)具有重要意義。